Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Zusammenfassung

Zelle Proteome zeichnen sich oft mit Elektrophorese-Assays, wo alle Arten von Proteinen in den Zellen sind unspezifisch mit einer Leuchtstofffärbung beschriftet und sind von einem Photodetektor nach ihrer Trennung entdeckt. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung bieten Gromer Proteindetektion mit seiner Fähigkeit zur Visualisierung von einzelnen fluoreszierende Moleküle. Allerdings wird die Anwendung dieser leistungsstarke bildgebende Methode Elektrophorese-Assays durch den Mangel an Möglichkeiten, um die Homogenität der fluoreszierenden Kennzeichnung der einzelnen Protein-Arten über das Proteom charakterisieren behindert. Hier haben wir eine Methode zur Evaluierung der Kennzeichnung Homogenität über das Proteom basierend auf ein einzelnes Molekül Fluoreszenz imaging Assay entwickelt. In unserer Messung mit Hilfe einer Stichprobe von HeLa-Zelle, der Anteil der Proteine, die mit mindestens einem Farbstoff, der wir genannt "Kennzeichnung Belegung" beschriftet (LO), war entschlossen, Auswahl von 50 % bis 90 %, das hohe Potenzial der Anwendung der Einzelmolekül-Bildgebung zu unterstützen sensibel und präzise Proteomanalyse.

Einleitung

Proteomanalyse, deren Ziel es ist, die Gesamtheit der Protein-Moleküle in die Zelle ausgedrückt zu quantifizieren, ist ein wertvoller Ansatz an aktuellen biologischen und medizinischen Studien. Diese Analyse basiert häufig auf Massenspektrometrie, die Protein-Arten anhand der Spektren erzeugt durch Protein Ionisation^1,2,3identifiziert. Eine alternative Methode für Proteomanalyse ist Elektrophorese, einschließlich Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), Kapillarelektrophorese und zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese. Diese Methode beruht auf unspezifischen fluoreszierende Kennzeichnung der Protein-Moleküle in den analysierten Zellen, gefolgt von elektrophoretischen Trennung und Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Protein-Arten. Zur Erreichung der erforderlichen unspezifische Protein-Kennzeichnung ist eine Strategie, fluoreszierende Farbstoffe zu verwenden, die an Proteine über elektrostatische und hydrophobe Interaktionen, wie Coomassie Blau und Sypro-Ruby^{4,5,6 binden können} . Eine alternative Strategie ist mit kovalente Kennzeichnung mit Farbstoffen mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester oder Maleimide, die kovalent an Proteine durch gemeinsame Rückstände wie primäre Amine und Thiole binden kann, bzw.^{7, 8}.

Unterdessen ist die Nachweisempfindlichkeit Fluoreszenz ideal für Low-Fülle Proteine und kleine Anzahl von Zellen zu analysieren. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Bildgebung ist eines der empfindlichsten Methoden, die ermöglicht die Erkennung von einzelnen fluoreszierende Farbstoffe und markierte Proteine in Vitro und in vivo^{9,10,11,12, 13,14,15}. Anwendung dieser bildgebenden Methode Elektrophorese basierenden Proteomanalyse wird voraussichtlich hochsensiblen und quantitativen Assays ermöglichen durch individuelle Fluoreszent-markierten Proteinen zählen. Es bleibt unklar, ob Beschriftung mit Fluoreszenzfarbstoffen homogen genug über die Proteinmoleküle ist, und wie diese Homogenität von verschiedenen Protein-Arten (Abbildung 1) betroffen ist. Einfache Masse Lösung Messungen können verwendet werden, um einem Molverhältnis von Fluoreszenzfarbstoffen, Proteine, sogenannte "Kupplung Effizienz"⁸ oder "Beschriftung Effizienz" zu erhalten, aber diese Eigenschaft liefert keine Informationen über die Homogenität der Beschriftung unter Protein-Moleküle.

Hier beschreiben wir das Protokoll für eine Probe zu untersuchen, die Kennzeichnung Homogenität für alle Arten von Protein in der Zelle (Abbildung 2)¹⁶. Die zwei wichtigsten Schritte des Assays sind Proteinreinigung und Bildgebung. Im ersten Schritt alle Proteine in den Zellen sind Eindringmittel beschriftet und biotinylierte, dann extrahiert separat mit Gelelektrophorese gefolgt von Electroelution. Im zweiten Schritt sind Fluoreszenzeigenschaften von einzelnen Protein-Moleküle in den entnommenen Proben anhand des Einzelmolekül-Bildgebung. Aus diesen Daten, Parameter, die wichtig für die Zählung Analyse, wie z. B. der Anteil der Proteine mit mindestens einem beschriftet färben, die wir fordern Kennzeichnung Auslastung (LO)¹⁶, und die durchschnittliche Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gebunden an ein einziges Protein-Molekül (N̄ _Farbstoff), charakterisiert werden können. In das Protokoll ein optimiertes Verfahren zur Kennzeichnung der HeLa-Zelle Proteome mit NHS Ester-basierte Cyanin 3 (Cy3) Farbstoff wird exemplarisch dargestellt und kann mit anderen Kennzeichnung Verfahren nach gewünschten Forschungsziele geändert werden.

Protokoll

1. Zelle-Vorbereitung

1. HeLa-Zellen in einer 10 cm Petrischale bei 37 ° C kultivieren unter 5 % CO₂ in Dulbecco modifizierten Adlerhorst 10 % fötalen Rinderserum-haltigem Medium.
2. Exponentiell wachsende Zellen zu sammeln, sobald sie 70 % Konfluenz, nach ATCC Anweisungen¹⁷erreicht haben.
   1. Spülen Sie die Zellen mit 5 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4). PBS zu entfernen.
   2. Fügen Sie 1 mL 0,1 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). 5 min bei 37 ° c inkubieren
   3. Überwachen Sie das Fortschreiten der Zelle Dissoziation von Mikroskopie.
   4. Zellen werden Runde und aus der Schale gelöst sind, fügen Sie 4 mL Wachstumsmedium und brechen Sie Zelle Agglomeration durch Pipettieren zu.
   5. Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.
   6. 150 X g für 10 min in ein Zentrifugenröhrchen zentrifugiert. Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 5 mL 1 X PBS (pH 7,4).
   7. Wiederholen Sie Schritt 1.2.6. Aufzuwirbeln Sie Zellen mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4), eine Endkonzentration von 10⁶ Zellen/mL mit der Anzahl in Schritt 1.2.5.
      Hinweis: Die Zellsuspension kann regelmÄÑig und bei-80 ° C gelagert mehrere Monate sein. Einen Frost/Tau-Zyklus wiederholen sollte vermieden werden.

(2) Zell-Lyse und fluoreszierende Kennzeichnung

1. 10 mL Lyse Puffer zu machen (0,1 M Borat, 1 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) und 1 % Tween 20). Passen Sie auf pH 12 mit 2 M NaOH.
   Achtung: Konzentrierte NaOH ist ätzend. Geeignete Handschuhe und Brille zu tragen, wenn Sie diese Lösung vorbereiten.
   Hinweis: Lysiereinrichtung Puffer kann bis zu einer Woche bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
2. Mix 100 μL der Lyse Puffer mit 1 μL 1 M Dithiothreitol (DTT) und 4 μL des 50 %-3-[(3-cholamidopropyl)-Dimethylammonio] -1-Propanesulfonate (CHAPS).
3. Mix 1 μL der Zellkultur (ca. 1.000 Zellen) mit dem gemischten Lysiereinrichtung Puffer aus Schritt 2.2. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 5 min mit sanften Agitation. Neu die Lösung durch Pipettieren langsam zu homogenisieren.
4. Fügen Sie 1 μL von 2 μg/mL Cy3 NHS-Ester Farbstoff. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. 5 min im Dunkeln bei Raumtemperatur unter schonenden rühren inkubieren.
   Hinweis: Der hohe pH-Wert dieses Puffers führt Neutralisierung der Lysin-Reste in Proteinen, was zu einer höheren Reaktivität.
5. Wiederholen Sie die Zugabe von 1 μl 2 μg/ml Cy3 NHS-Ester Farbstoff. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur unter schonenden rühren inkubieren.
   Hinweis: Dieses wiederholte Zugabe von NHS-Ester Farbstoff kann die Kennzeichnung Effizienz zu steigern, weil einige der Farbstoff Cy3 NHS-Ester hydrolysiert und durch den hohen pH-Wert des Puffers Reaktion deaktiviert.
6. Passen Sie auf pH 7,2 durch Zugabe von 100 μl von 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES)-NaOH pH 7,2 um die Reaktion zu stillen. Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren.
7. Fügen Sie 20 μL 19 mg/mL Biotin-(Polyethylenglykol (PEG))₂-Amine und 5 μL von 20 mg/mL 1-Ethyl - 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC). Pipettieren langsam um Luftblasen zu vermeiden, um die Lösung zu homogenisieren. 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur unter schonenden rühren inkubieren.
   Hinweis: Dieser Schritt Biotinylierungen ist notwendig, die Proteinmoleküle auf ein Mikroskop-Deckglas bei einer festen Dichte und mit keine Vorliebe für Protein-Arten zu beheben.
8. Umgesetzte Kennzeichnung Reagenzien zu entfernen und die Probe mit einer Ultrafiltration Spalte mit 10 kDa Cutoff, nach den Anweisungen des Herstellers konzentrieren.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Probe kann für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden.

(3) Proteom Trennung und Verwertung

1. 4 x SDS-Probenpuffer (200 mM Tris-HCl pH 6,8, 4 % SDS, 4 % Glycerin und 0,4 % Bromophenol blue) hinzufügen.
   Hinweis: Zur Vermeidung von Beschädigungen der Farbstoff die Protein-Probe sollte nicht erhitzt werden, wie im standard SDS-PAGE und bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
2. Durchführen Sie standard-SDS-PAGE für die Protein-Probe und eine molekulare Leiter, mit 20 % Acrylamid Gel. Migrieren Sie die Probe in das Gel in eine konstante Spannung (160 V) bis die Migration beendet vorne nur das Gel.
3. Bild das Gel um die Position der Protein-Bands (Abbildung 3) identifizieren.
4. Schneiden Sie die Gel-Teile einschließlich Proteinfraktionen von Interesse mit einer scharfen Klinge, basierend auf den Band-Positionen. Fraktionierung, 16, 23, 55 und 120 kDa Gipfeln und 19-25, 25-32, 32 – 42, 42 – 54, 54 – 69, 69 / 97, 97-136 und 136 – 226 kDa Regionen sind in Abbildung 3dargestellt.
5. Proteine mit einem Dialysator durch Electroelution mit einer Porengröße von 6 – 8 kDa, nach den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren.
   Hinweis: Die extrahierte Probe kann für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden.

(4) Mikroskop-Deckglas-Vorbereitung

1. Bereiten Sie 200 μL des Avidin Puffer (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/mL Avidin und Rinderserumalbumin (BSA) 2 mg/mL) für jede Probe.
2. Bereiten Sie Deckgläsern 22 mm x 22 mm und 0,15 mm Dicke. Setzen Sie die Deckgläsern um Luft-Plasma mit einem Plasma cleaner für 1 min zu reinigen und aktivieren ihre Oberflächen.
3. Mantel der Deckgläsern mit Avidin durch Spin-Coating 200 μL der Avidin-Puffer mit einem Spin Coater für 5 Sekunden bei 500 u/min, gefolgt von 30 Sekunden bei 1.000 u/min. Inkubieren Sie Deckgläsern für 15 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.
4. Die Protein-Probe Deckgläsern vorbereiten.
   1. Verdünnen Sie die Protein-Probe (ab 3.5) 100 Mal in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
   2. Platz 100 μL der verdünnten Probe auf der Oberfläche in der Mitte des Avidin beschichtete Deckglas (aus Schritt 4.3).
   3. In der Dunkelheit für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Bereiten Sie die Positivkontrolle.
   1. Platz 100 μL von 10 ng/mL gereinigt fluoreszierende Biotin in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2 in der Mitte des das Avidin beschichtete Deckglas (aus Schritt 4.3).
   2. In der Dunkelheit für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Diese Positivkontrolle Deckglas stellt die Dichte des Avidin Bindung Spots, dient zum Berechnen der LO.
6. Bereiten Sie die negative-Kontrolle.
   1. Spin-Mantel das Plasma gereinigt Deckglas mit 200 μl 5 mm HEPES-NaOH und 2 mg/mL BSA (ohne Avidin).
   2. Inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.
   3. Fügen Sie 100 μL von 10 ng/mL gereinigt fluoreszierende Biotin in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.
   4. In der Dunkelheit für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Diese Negativkontrolle Deckglas stellt die Menge der unspezifischen Bindung von fluoreszierenden Biotin, das Deckglas ohne Avidin.
7. Spülen Sie jedes Deckglas mit 200 μl destilliertes Wasser durch an den Rändern des Deckglases um die Mitte des Deckglases mit der Spitze berühren nicht zu pipettieren. Wiederholen Sie diese waschen dreimal.
   Hinweis: Nach dem Absaugen von Wasser auf das Deckglas, sollte Wasser sofort wieder auf das Deckglas zu verhindern, dass es völlig austrocknen platziert werden.
8. Luft-Plasma auf die gleiche Anzahl von Deckgläsern wie in Schritt 4.2 aussetzen.
9. Legen Sie die gereinigten Deckgläschen auf Probe-gebundenen Deckglas ab Schritt 4.7 um Austrocknen zu vermeiden.

5. Beobachtung mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie

1. Starten Sie ein Fluoreszenzmikroskop Weitfeld- oder evaneszenten Feld.
   Achtung: Direkte oder verstreuten Laserstrahlung kann dazu führen, dass Auge oder Hautschäden. Geeignete Schutzbrille und schirmen den Lichtweg Laser.
   Hinweis: Das Mikroskop-Setup finden Sie auf unserer früheren Publikation¹⁶. Kurz gesagt, kann ein Weitfeld- oder evaneszenten Feld Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer Hochleistungs-488 nm Laseranregung, ein hoher numerischer Apertur-Objektiv und eine hochempfindliche Kamera für diese Messung verwendet werden. Darüber hinaus sind für eine automatisierte Messung eine computergesteuerte XY translationale Probentisch, mechanische Fensterläden für Laser Erregungen und ein Autofokus-System empfohlen, installiert werden.
2. Das Deckglas auf dem Mikroskop und finden im Mittelpunkt.
3. Führen Sie einen Kachel-Scan um mindestens 100 Bilder zu erhalten.
   Hinweis: Die Laser-Beleuchtung sollte mit mechanischen Fensterläden zum Beispiel ausgesetzt werden, nur dann, wenn Bilder mit der Kamera zur Minimierung von Immunofluoreszenz Aufnahme gesteuert werden. Es gibt viele Beispiele, empfiehlt automatisierte Messung mit Hilfe eines Computerprogramms die Mikroskop-Geräte steuern. Jedes Bild umfasst in der Regel 100 – 500 Einzelmolekül Spots, wenn ein 60 X Objektiv verwenden.

6. Bild-Analyse und Gewinnung von Informationen

1. Wenn das Bild Unebenheiten durch die Laser-Beleuchtung-Muster hat, durchführen Sie Bildverarbeitung zu¹⁸korrigieren.
   1. Erwerben Sie ein Referenzbild durch Messung mit einem Deckglas Stichprobe aus gleichmäßig verteilt Farbstoffe mit Hilfe einer Kamera Einstellung die gleiche wie in Schritt 5.3.
   2. Erwerben Sie ein Offset Bild durch Messung mit keine Laseranregung mit der gleichen Kameraeinstellung.
   3. Subtrahieren Sie jeder Pixelwert in jedem Beispiel-Bild und die Referenz-Bild mit dem Wert des Offset Bildes.
   4. Jeder Pixelwert in die subtrahierten Beispielbilder durch den Wert im subtrahierten Referenzbild zu teilen.
2. Sammeln Sie ordnungsgemäß erworbenen Bilder zu und entfernen Sie den Bildhintergrund.
   1. Bilder mit großen fluoreszierende Aggregaten manuell zu entfernen.
   2. Entfernen Sie den Bildhintergrund durch die Anwendung der rollenden Kugel Algorithmus¹⁹ mit einem Ball-Radius von 50 Pixeln mit ImageJ²⁰.
   3. Schärfen der Bilder durch Subtraktion unscharfe Bilder mit ImageJ (schärfen Bild-Funktion).
3. Finden Sie und analysieren Sie Einzelmolekül-Spots in Bildern.
   1. Einzelmolekül-Spots mit dem Yen Schwelle Algorithmus²¹ mit ImageJ zu identifizieren.
   2. Filtern Sie Plätze mit weniger als zwei Pixel auszuschließende Dunkelrauschen der Kamera und stellen mehr als 20 Pixel um Aggregationen von Proteinen mit ImageJ (ROI-Manager) auszuschließen.
   3. Die Anzahl der Plätze in jedem Bild. Mit der Beleuchtung korrigierten Bilder (Schritt 6.1.4), analysieren total Intensitäten innerhalb von Pixeln zu jedem Spot mit ImageJ.
4. Berechnen Sie die Kennzeichnung Auslastung (LO) mithilfe der folgenden Formel:
   LO = (Anzahl der zählt in der Probe / Anzahl der Grafen in die Positivkontrolle) X 100
5. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen gesprungen, um ein einziges Eiweißmolekül (N̄_Farbstoff).
   1. Analysieren Sie ein Histogramm der Intensitäten von jedem Ort.
      Hinweis: Das Histogramm zeigt in der Regel mehrere Gipfel, und jede Spitze steht eine unterschiedliche Anzahl von Farbstoffmoleküle an ein Protein gebunden. Die erste, zweite und dritte Gipfel im Histogramm entspricht 1, 2 und 3 Moleküle, beziehungsweise.
   2. Berechnen Sie die durchschnittliche Intensität aus dem Histogramm. Auch berechnen Sie der Peak-Intensität des ersten Peaks durch Anwendung ein "glockenförmig" Fitting.
   3. Berechnen Sie N̄_Farbstoff , indem man die durchschnittliche Intensität mit der Peak-Intensität.

Ergebnisse

Abbildung 4 stellt raw-Bilddaten für Bruchteile von unterschiedlichem Molekulargewicht der Proteine von HeLa-Zelle lysate, sowie die positive und negative Kontrolle. Während der Protein-Probe und Positive Ausstellung 100 – 500 Punkte pro Bild steuern, zeigt die negative-Kontrolle keine oder wenige stellen, zeigen, dass das Protokoll ausreichend unspezifische Bindung der Farbstoffe auf der Oberfläche des Deckglases hemmt. Vor Ort Intensität Histogramme f...

Diskussion

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität der einzelnen markierten Protein-Arten in den Zellen nach der Trennung mit SDS-PAGE (Schritt 3) zu quantifizieren. Das Trennverfahren kann mit anderen Methoden wie flüssige Chromatographie oder Kapillarelektrophorese, ersetzt werden, die Trennung und Fraktionierung von zellulären Proteinen mit hoher Auflösung erfordert spezielle Ausrüstung²³ermöglichen. Die Kennzeichnung Methode mit NHS-Ester in das aktuelle Protoko...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
22x22x0.15 mm coverslip	VWR	470019-004
488 nm Argon laser	Coherent	Innova 70C
488 nm dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03
488 nm emission filter	Semrock	FF02-520/28
560 nm dichroic filter	Semrock	Di02-R561
560 nm emission filter	Semrock	FF02-617/73
560 nm fiber laser	MBP Communications	F-04306-2
60x oil immersion lens	Olympus	PLAPON 60x
Avidin	Nacalai-tesque	03553-64
Biotin-PEG-amine	Thermo Scientific	21346
Biotinylated Alexa Fluor 488	Nanocs
Borate	Nacalai-tesque
BSA	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-ester dye	GE Healthcare	PA13101
Dialyzer  - D-tube, 6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	Sigma-Aldrich
DTT	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD camera	Andor	IiXon 897
Epi fluorescence microscope	Olympus	IX81
Gel viewer	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix	Gibco
Plasma cleaner	Diener Electronic
SDS	Wako	NC0792960
Size purification column 10K	Merck Millipore	UFC5010
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416