Herramientas caseras simples para manejar moscas de la fruta—Drosophila melanogaster

Resumen

Aquí se describe el uso de varias herramientas caseras para transferir, enfriar y matar drosophilaadulta, así como para limpiar viales de cultivo de vidrio y recoger huevos. Estas herramientas son fáciles de hacer y son bastante eficientes en el manejo de Drosophila.

Resumen

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es ampliamente utilizado tanto en la investigación biológica y la educación biológica. El manejo de moscas adultas es común pero difícil en la práctica, ya que las moscas adultas vuelan. Aquí se muestra cómo hacer algunas herramientas simples y rentables para abordar problemas difíciles en el manejo de Drosophila. Se hacen orificios en los tapónes de espuma y se insertan puntas o embudos de pipeta en los orificios. Las moscas entonces se mueven sólo en una dirección en el conjunto de punta/embudo de pipeta, lo que permite un control eficiente de la transferencia de Drosophila adulta dentro o fuera de un vial. Los protocolos existentes se han modificado para las moscas de anestetización fría enfriándose en hielo triturado y transfiriéndolas a una superficie fría y dura de la bolsa de hielo. La bolsa de hielo está cubierta con un pedazo de gasa médica que mantiene las moscas inmovilizadas del agua condensada cuando se examina bajo un estereomicroscopio. Las moscas son finalmente eutanasiadas para contar y clasificar o descartadas por microwaving. También se ha desarrollado una jaula en forma de botella para recoger huevos, así como un dispositivo de ahorro de mano de obra y un protocolo de acompañamiento para la limpieza de viales de cultivo de vidrio.

Introducción

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo ampliamente utilizado en la investigación biológica y la educación biológica para estudiar una amplia gama de temas^1,2. Los problemas básicos de manejo de Drosophila son la transferencia de adultos de vial a vial e inmovilización de las moscas para que sean más fáciles de manejar, ya que todos los adultos (excepto algunos mutantes^3,4) pueden volar.

Convencionalmente, un investigador transfiere moscas de un vial a otro sosteniendo dos viales boca a boca, tocando las moscas haciaabajo o permitiendo que las moscas vuelen hacia arriba en otro vial, luego separando y reenchufando ambos viales 4. Obviamente, esto requiere que la apertura de dos viales con el mismo diámetro, y es difícil controlar la cantidad de moscas transferidas. Mientras tanto, esto requiere manos rápidas para hacer el trabajo, y escapar de las moscas perdidas puede resultar en problemas para el laboratorio o el aula. Añadir moscas vírgenes adicionales o moscas macho a una cruz ya preparada es otra tarea rutinaria en los experimentos de Drosophila. Convencionalmente, las moscas deben ser inmovilizadas en el vial de cruz antes de la adición de moscas adicionales.

Drosophila adulta son anestesiadas rutinariamente por éter, CO₂o escalofriante^5. En comparación con la exposición al éter y el CO2, el enfriamiento es el agente más rentable para inmovilizar drosophila adulta y el menos dañino tanto para las moscas como para los investigadores (especialmente los jóvenes estudiantes)^6,7. Sin embargo, el agua que se condensa continuamente en la superficie fría o la cámara humedece las moscas. Es difícil determinar los fenotipos de las moscas húmedas, y pueden dañarse fácilmente durante la manipulación^8,9. Esto ha impedido que el método de enfriamiento sea más ampliamente aceptado.

Las herramientas para la transferencia de mosca y un método para el enfriamiento de vuelo se han descrito previamente¹⁰. Aquí, se reporta una técnica de anestesia escalofriante modificada que es segura, confiable y factible para los experimentos de Drosophila. También se describen en este artículo 1) métodos para matar adultos para contar, clasificar o desechar, 2) dispositivos y protocolos de ahorro de mano de obra para limpiar viales de cultivo de vidrio, y 3) una jaula simple para recoger huevos. Las herramientas de fácil diseño y rentables que se describen aquí se pueden utilizar para abordar los problemas difíciles de manejo de la mosca, y estos métodos han sido probados y han demostrado ser robustos, confiables y fáciles de manejar para investigadores experimentados y novatos.

Protocolo

1. Preparación de herramientas y accesorios

1. Tapón de punta/embudo
   1. Obtener dos tapones de esponja (el diámetro de los tapones debe ser ligeramente mayor que el diámetro interno de los viales utilizados para transferir moscas). Haga un agujero en los centros de los tapones de esponja con un soldador eléctrico calentado.
   2. Obtenga dos puntas de pipeta de 1 ml, corte una por la mitad transversalmente con un cuchillo afilado y deseche el extremo puntiagudo. A continuación, corte 1,5 cm del extremo puntiagudo de la segunda punta de pipeta. Pegue los restos de las dos puntas de pipeta junto con un adhesivo multiusos para hacer una punta de pipeta alargada (Figura1A).
   3. Inserte un embudo y la punta alargada de la pipeta en los tapones de esponja para hacer un tapón de punta y embudo (en adelante denominados t- y F-stoppers) y tapar la punta de la pipeta con un tubo de microcentrífuga de 100 l (Figura 1A).
      NOTA: La longitud del vástago del embudo debe ser mayor que la altura del enchufe. Si es más corto o igual que la altura del enchufe, las moscas escaparán de la abertura del vástago. El extremo del vástago del embudo debe estar situado al menos 2 cm por encima de la superficie del medio de cultivo o la parte inferior de un vial vacío. Son preferibles embudos pequeños (por ejemplo, diámetro del disco <60 mm) con pequeños diámetros internos de apertura del vástago (<5 mm). Se puede utilizar un embudo de vidrio o de plástico para hacer un F-stopper. Sin embargo, los embudos de plástico son preferibles para las clases de biología, ya que se rompen menos fácilmente que los embudos de vidrio.
2. Agujas microdistveantes
   1. Obtenga lápices mecánicos que se sientan cómodos en la mano y los pasadores de insectos que coincidan con los diámetros (por ejemplo, 0,5 mm, 0,7 mm) de sus recargas de plomo.
   2. Corta los extremos anchos de los pasadores de insectos con un par de alicates y archiva el corte plano. Sustituya el cable por los pasadores (Figura1B). Pulse el botón de clic y alimente 0,5–1 cm de un pasador para realizar una disección. Limpie el pasador y empújelo completamente de nuevo en el eje del lápiz después de una actividad de disección para que sea seguro para cualquier persona.
      NOTA: Las agujas microdissección son útiles no sólo en disecciones de órganos como las glándulas salivales larvales, sino también en el recuento y clasificación de moscas adultas muertas.
3. Paquetes de hielo duros
   1. Obtenga varias compresas de hielo duro refreezables (las compresas de hielo de gran tamaño son preferibles). La Figura 1C muestra un paquete de hielo que funcionó bien, que mide 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm y tiene lados superior e inferior que son completamente planos.
   2. Corte la gasa médica (no estéril) en trozos ligeramente más pequeños que las superficies frías de las bolsas de hielo que cubren. Por ejemplo, una pieza de gasa médica ligeramente inferior a 26,5 cm x 14,5 cm es preferible cubrir una compresa de hielo que se muestra en la Figura 1C.
      NOTA: Los accesorios necesarios para estas herramientas de refrigeración incluyen: una caja de hielo (utilizamos una caja de espuma de 25 cm x 15 cm x 15 cm para una persona y caja de 37 cm x 28 cm x 20 cm para más de una persona), que se utiliza para almacenar hielo triturado; un par de pinzas de punto fino, que se utilizan para agarrar moscas frías por sus alas y transferirlas a un vial; un par de guantes de trabajo de protección, que se utilizan para sacar las compresas de hielo refrigeradas de un congelador de -20 oC; y película de plástico, que se utiliza para cubrir el escenario de un estereomicroscopio.
4. Jaula de recogida de huevos Drosophila
   NOTA: Las jaulas de recolección de huevos Drosophila ya hechas están disponibles en muchas empresas de biotecnología^11. Aquí se describe una pequeña jaula de colección de huevos en forma de botella de acrílico para platos Petri de 60 mm (Figura1D a la izquierda; el diseño de la jaula se muestra en el medio). Se puede adaptar para otros tamaños de plato Petri (por ejemplo, 100 mm, 35 mm). Esto permite la transferencia de moscas dentro o fuera de la jaula con facilidad. Una jaula simple se puede preparar de la siguiente manera.
   1. Utilice un cortador de presión para cortar una botella de bebida de plástico suave (500 ml, diámetro interno aprox. 65 mm) en una proporción aproximada de 2:1 (extremo puntiagudo: extremo romo) y deseche el extremo romo.
   2. Envuelva una tira de papel de tarjeta alrededor de una placa de jugo de manzana (diámetro interno 60 mm) con cinta adhesiva [la placa de jugo de manzana se utiliza para recoger huevos (Figura1E,derecha)].
5. Controlador de cepillo de tubo inalámbrico
   1. Obtenga un controlador de taladro inalámbrico (velocidad máxima a 500 rpm).
   2. Obtener un cepillo de tubo que tiene cerdas a lo largo de sus lados, así como su parte delantera. Idealmente, el diámetro del cepillo debe ser ligeramente mayor que el diámetro de los viales de cultivo que necesitan ser limpiados. Corte el extremo de su asa para que pueda insertarse en el portabrocas (Figura1D).
      NOTA: Los accesorios necesarios para estas herramientas de limpieza incluyen esponjas de acero inoxidable y guantes de goma de manguito largo.

2. Transferencia de moscas adultas del vial A al vial B

NOTA: La transferencia de moscas adultas de un vial a otro es la práctica más común que se lleva a cabo en experimentos de Drosophila [por ejemplo, transferir moscas de la antigua cultura (A) al cultivo fresco (B) o de un vial cruzado (A) a un vial vacío (B)] para anestesia. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para cualquier actividad de transferencia de moscas adultas. A menos que se indique lo contrario, este protocolo se utiliza para transferir moscas del vial A al vial B a través de este papel.

1. Compruebe cuidadosamente el tallo del embudo de un F-stopper y la punta de la pipeta de un t-stopper, luego despeje las moscas que permanezcan en los tapones con un soplador de aire de goma. Este paso es de suma importancia, especialmente cuando se utiliza un conjunto de T- y F-stoppers para la transferencia continua de diferentes líneas de Drosophila.
2. Toque las moscas en el vial A y reemplace su enchufe con un T-stopper, luego enchufe el vial B con un F-stopper.
3. Invierta el vial A sobre el vial B, inserte el extremo de la punta de la pipeta del tapón en la abertura del embudo del F-stopper, golpee el borde del vial invertido A para permitir que las moscas se deslicen fuera de la punta de la pipeta y a través del vástago del embudo, y caigan en el vial B. Si cualquier alimento viejo en el vial A se vuelve menos compacto, puede caer cuando el vial A se invierte y se golpea. En tal situación, invierta el vial B sobre el vial A y permita que las moscas se arrastren hasta el vial B.
4. Separe el T-stopper del F-stopper. Tapar el extremo de la punta de la pipeta del T-stopper con un tubo de microcentrífuga de 200 l si las moscas restantes en el vial A necesitan ser transferidas a otros viales momentáneamente; de lo contrario, retire el T-stopper y vuelva a enchufar el vial A. Retire el F-stopper y vuelva a reconectar el vial B.

3. Inmovilizar moscas por enfriamiento

1. Conservar las compresas de hielo refreezables en un congelador de -20 oC durante al menos 24 horas antes de su uso.
2. Colocar una compresa de hielo fría y dura a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos. Humedezca ligeramente un pedazo de gasa médica no aséptica con un poco de agua corriente y deje que se adhiera estrechamente a la superficie de la bolsa de hielo. La gasa médica se puede reutilizar en el siguiente enfriamiento de mosca. Al mismo tiempo, enfríe un vial vacío en hielo triturado.
3. Transfiera moscas adultas que necesitan ser inmovilizadas en el vial vacío refrigerado (CEV). Cuando los dos viales de transferencia estén separados, cubra el CEV con una placa Petri o un tapón y golpee el CEV contra el hielo triturado para tocar todas las moscas en el CEV hasta el fondo. Repita este proceso varias veces hasta que todas las moscas estén inmovilizadas. Las moscas serán inmovilizadas dentro de los 30 s. A continuación, coloque el CEV en el hielo durante 1 min. No es aconsejable transferir demasiadas moscas a la vez para anestesiar.
4. Vierta las moscas frías sobre la gasa médica que cubre la bolsa de hielo. Extienda las moscas superpuestas con un pincel y asegúrese de que cada mosca pueda ser enfriada por la superficie fría de la bolsa de hielo. Si una empanada de hielo duro se hincha ligeramente, colóquela en una toalla y trabaje en su lado plano.
5. Retire los clips del escenario del estereomicroscopio, cubra el escenario con un pedazo de película de plástico y coloque la compresa de hielo en el escenario. Encienda la luz superior (una fuente de luz fría es deseable), enfoque el estereomicroscopio y mueva la bolsa de hielo hasta que las moscas frías se puedan ver claramente.

4. Matar moscas adultas para contar, ordenar o descartar

1. Transfiera las moscas adultas a un vial vacío y cúbralo con un plato de Petri.
2. Invertir el vial, calentarlo durante 1 min + 20 s en un horno microondas, y dejar que las moscas muertas caigan en el plato Petri.
3. Ponte guantes de trabajo de protección y saca el vial del microondas. Vierta las moscas muertas en una tarjeta de papel blanco, cuente o examine las moscas con una aguja microdissección bajo un estereomicroscopio, y deseche los cuerpos de mosca en un cubo de basura después de la observación.
4. Para matar moscas no deseadas, calienta las moscas durante 2-3 minutos en un horno microondas, luego toca las carcasas en un cubo de basura.
   NOTA: No es aconsejable matar algunas cepas mutantes de alas (por ejemplo, mutantes de longitud de ala) para su examen, ya que es difícil juzgar a partir de los cadáveres si las alas se extienden más allá de la punta del abdomen, que se ve en moscas de tipo salvaje.

5. Transferencia de moscas de entrada/salida de la jaula de recogida de huevos en forma de botella

NOTA: Como se mencionó anteriormente, los T- y F-stoppers se utilizan para transferir moscas dentro y fuera de la jaula de recolección de huevos. Las moscas no necesitan ser anestesiadas durante todo este proceso. Otros detalles, como la preparación del medio de jugo de manzana, la colección de huevos y la desconreorionización, se pueden encontrar en la literatura¹².

1. Inserte la jaula de recolección de huevos en el plato de jugo de manzana o monte la placa de jugo de manzana en la jaula hecha de una botella de refresco. Selle la articulación alrededor de los dos componentes con una tira de película de parafina.
2. Coloque tantas moscas como sea posible en la jaula y vuelva a enchufar la jaula con un tapón de espuma después de transferir las moscas.
3. Para cambiar la comida de las moscas en la jaula, transfiera las moscas de la jaula a un vial vacío.
4. Vuelva a colocar la placa de jugo de manzana y vuelva a sellarla, luego transfiera las moscas del vial de vuelta a la jaula.
5. Cuando termine la recolección de huevos, transfiera las moscas a un vial vacío y transfieralas a viales de cultivo.

6. Limpieza de viales de cultivo de vidrio

NOTA: Generalmente, un vial de cultivo antiguo contiene moscas vivas. En el protocolo descrito aquí, estas moscas NO necesitan ser asesinadas antes de la limpieza a menos que sean moscas transgénicas.

1. Retire cualquier tinta marcadora permanente de los viales de cultivo de vidrio con esponjas húmedas de acero inoxidable.
2. Remoje los viales de cultivo en agua corriente.
   1. Llene un fregadero de laboratorio con agua, agregue jabón líquido para lavar platos en el agua y mezcle.
   2. Sumerja los viales de cultivo en el agua y, a continuación, retire el tapón, permitiendo que el agua corra hacia el vial. El detergente para platos en el agua hará que las moscas adultas restantes se hundan hasta el fondo y se ahoguen en el agua.
   3. Remoje los antiguos viales de cultivo en agua durante al menos 30 minutos.
3. Afloje el portabrocas del taladro, inserte el cepillo del tubo de ensayo y vuelva a apretar el mandril. Compruebe la dirección del selector de rotación y asegúrese de que el taladro gire en el sentido de las agujas del reloj. Ajuste el gatillo de velocidad y asegúrese de que la velocidad máxima sea inferior a 500 rpm.
4. Limpie los viales de cultivo.
   1. Limpie los viales de cultivo aproximadamente.
      1. Coloque un guante de goma de manguito largo en la mano no dominante y sostenga el vial en el agua.
      2. Sostenga el controlador de cepillo de tubo inalámbrico con la mano dominante desnuda, apriete el cepillo en el vial de cultivo y apriete el gatillo.
         NOTA: No sumerja la batería en el agua. El cepillo giratorio romperá los alimentos viejos, la pupa, etc., y eliminará más del 95% de los residuos.
      3. Vierta los residuos en un cubo de basura separado. Repita este proceso hasta que se haya limpiado la mayor parte de los residuos de cada vial.
   2. Limpie bien los viales de cultivo.
      1. Limpie el cepillo del tubo, drene y limpie el fregadero, y rellénelo con agua limpia.
      2. Retire los residuos restantes de cada vial de cultivo como se describe en la sección 6.4.1.

Resultados

Los T- y F-stoppers fueron desarrollados como un conjunto de herramientas simples que se pueden adaptar y utilizar en cualquier actividad de transferencia de moscas. Transferir moscas de una cultura antigua a varios cultivos frescos implica quitar los tapones de los viales frescos, reemplazarlos con F-stoppers, luego derribar las moscas en el vial viejo, quitar rápidamente su enchufe y reemplazarlo con un T-stopper. Si el alimento viejo es compacto, entonces es importante voltear el vial...

Discusión

Algunas herramientas caseras para manejar las actividades básicas involucradas en la cría y experimentación de Drosophila se describen en este artículo. Estas herramientas son simples pero bastante efectivas. Prácticamente, cualquier laboratorio puede hacer estas herramientas con facilidad, y una investigación o un laboratorio de enseñanza no necesita encontrar una alternativa ya hecha que tal vez no esté disponible localmente.

La transferencia de moscas es la práctica más c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
a pair of pliers
cordless drill driver			max speed: 500 rpm
electric soldering iron
file
funnel			diameter of disk<60mm
ice box
insect pins
infrared thermometer			HCIYET HT-830
long cuff rubber gloves
mechanical pencils
medical gauze
microcentrifuge tube			100 ul
microwave oven
Parafilm
peri dish			internal diameter 60 mm
pipette tips			1 ml
plastic film
plastic peri dish			Φ36 mm used to cover the empty vial
point tweezers
protective work gloves
re-freezable hard icepacks			26.5×14.5×2.5 cm or larger
rubber air blower
snap cutter
soft drink bottle			500 ml, internal diameter c.a. 65 mm
sponge stopper
stainless steel sponges
tube brush
vial			Φ34 mm × 90 mm