Semplici strumenti fatti in casa per gestire le mosche della frutta -Drosophila melanogaster

Riepilogo

Descritto qui è l'uso di diversi strumenti fatti in casa per trasferire, raffreddare e uccidere la Drosophilaadulta , così come per pulire fiale di cultura del vetro e raccogliere le uova. Questi strumenti sono facili da realizzare e sono piuttosto efficienti nella gestione della Drosophila.

Abstract

La mosca della frutta, La Drosophila melanogaster, è ampiamente utilizzata sia nella ricerca biologica che nell'educazione biologica. La manipolazione delle mosche adulte è comune ma difficile nella pratica, poiché le mosche adulte volano. Dimostrata qui è come fare alcuni strumenti semplici ed economici per affrontare problemi difficili nella gestione della Drosophila. I fori nei tappi di schiuma sono fatti e punte pipette o imbuti vengono inseriti nei fori. Le mosche si spostano quindi solo in una direzione nell'assemblaggio della punta/imbuto della pipetta, consentendo un controllo efficiente del trasferimento di Drosophila adulti dentro o fuori da una fiala. I protocolli esistenti sono stati modificati per raffreddare le mosche raffreddando raffreddandoili raffreddando nel ghiaccio tritato e trasferendole su una superficie fredda e dura del gelato. Il gelato è coperto da un pezzo di garza medica che mantiene le mosche immobilizzate dall'acqua condensata quando esaminate sotto uno stereoscopio. Le mosche vengono infine eutanasia per il conteggio e lo smistamento o scartate mediante microonde. Una gabbia a forma di bottiglia è stata sviluppata anche per la raccolta delle uova, nonché un dispositivo di risparmio di manodopera e un protocollo di accompagnamento per la pulizia delle fiale di coltura del vetro.

Introduzione

La mosca della frutta, La Drosophila melanogaster, è un organismo modello ampiamente utilizzato nella ricerca biologica e nell'educazione alla biologia per studiare una vasta gamma di argomenti^1,2. I problemi di base di gestione della Drosophila sono il trasferimento di adulti dalla fiala alla fiala e l'immobilizzazione delle mosche in modo che siano più facili da gestire, come tutti gli adulti (ad eccezione di alcuni mutanti^3,4) possono volare.

Convenzionalmente, un ricercatore trasferisce le mosche da una fiala all'altra tenendo due fiale bocca a bocca, toccando le mosche verso il basso o permettendo alle mosche di volare su un'altra fiala, quindi separando e ricollegando entrambe le fiale⁴. Ovviamente, questo richiede che l'apertura di due fiale con lo stesso diametro, ed è difficile controllare la quantità di mosche trasferite. Nel frattempo, questo richiede mani veloci per portare a termine il lavoro, e fuggire dalle mosche vaganti può causare problemi per il laboratorio o la classe. L'aggiunta di mosche extra virginiche o mosche maschili a una croce già preparata è un altro compito di routine negli esperimenti di Drosophila. Convenzionalmente, le mosche devono essere immobilizzate nella fiala trasversale prima dell'aggiunta di mosche extra.

La Drosophila adulta è regolarmente anestesizzata da etere, CO₂o refrigerante⁵. Rispetto all'esposizione all'etere e al CO 2, l'agghiacciamento è l'agente più conveniente per immobilizzare la Drosophila adulta e la meno dannosa sia per le mosche che per i ricercatori (soprattutto i giovani studenti)^6,7. Tuttavia, l'acqua che si condensa continuamente sulla superficie fredda o sulla camera bagnata le mosche. È difficile determinare i fenotipi delle mosche bagnate e possono facilmente danneggiarsi durante la manipolazione^8,9. Questo ha mantenuto il metodo di raffreddamento di diventare più ampiamente accettato.

Strumenti per il trasferimento di mosca e un metodo per il raffreddamento a mosca sono stati descritti in precedenza¹⁰. Qui, viene riportata una tecnica di anestesia refrigerante modificata che è sicura, affidabile e fattibile per gli esperimenti di Drosophila. In questo documento sono descritti anche 1) metodi per uccidere gli adulti per il conteggio, lo smistamento o lo scarto, 2) dispositivi e protocolli per il risparmio di lavoro per la pulizia delle fiale di coltura del vetro e 3) una semplice gabbia per la raccolta delle uova. Gli strumenti facilmente progettati ed economici descritti qui possono essere utilizzati per affrontare i difficili problemi della movimentazione del volo, e questi metodi sono stati testati e si sono dimostrati robusti, affidabili e facili da gestire per ricercatori esperti e principianti.

Protocollo

1. Preparazione di strumenti e accessori

1. Arresti a punta/funnel
   1. Ottenere due tappi di spugna (il diametro dei tappi deve essere leggermente maggiore del diametro interno delle fiale utilizzate per trasferire le mosche). Fare un buco nei centri della spugna tappi con un ferro da saldatura elettrica riscaldato.
   2. Ottenere due punte pipette da 1 mL, tagliarne una a metà trasversalmente con un coltello affilato e scartare l'estremità appuntita. Quindi, tagliare 1,5 cm dell'estremità appuntita sulla seconda punta della pipetta. Incollare i resti delle due punte pipette insieme a un adesivo per tutti gli usi per fare una punta di pipetta allungata (Figura 1A).
   3. Inserire un imbuto e la punta allungata della pipetta nei tappi di spugna per fare un tappo di punta e imbuto (in seguito indicato comeT- e F-stopper) e riporre la punta della pipetta con un tubo di microcentrifuga di 100 .
      
2. Aghi microdisseci
   1. Ottenere matite meccaniche che si sentono a proprio agio nella mano e perni di insetti che corrispondono ai diametri (ad esempio, 0,5 mm, 0,7 mm) delle loro ricariche di piombo.
   2. Tagliare le estremità larghe dei perni di insetti con un paio di pinze e file il taglio piatto. Sostituire il lead con i perni (Figura 1B). Premere il pulsante di clic e estrarre 0,5-1 cm di un perno per condurre una dissezione. Pulire il perno e spingerlo completamente nell'albero della matita dopo un'attività di dissezione per renderlo sicuro per qualsiasi persona da gestire.
      NOT: Gli aghi microdisseci sono utili non solo nelle dissezioni di organi come le ghiandole salivari larve, ma anche nel conteggio e nello smistamento delle mosche adulte morte.
3. Pacchetti di ghiaccio duri
   1. Ottenere diversi ghiaccio duro rifreezable (i pacchetti di ghiaccio di grandi dimensioni sono preferibili). Figura 1C mostra un icepacks che ha funzionato bene, che misura 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm e ha lati superiori e inferiori che sono completamente piatti.
   2. Tagliare la garza medica (non sterile) in pezzi leggermente più piccoli delle superfici fredde dei ghiacci che coprono. Ad esempio, un pezzo di garza medica leggermente più piccolo di 26,5 cm x 14,5 cm è preferibile coprire un icepack mostrato figura 1C.
      NOT: Gli accessori necessari per questi strumenti di raffreddamento includono: una scatola di ghiaccio (abbiamo usato una scatola di schiuma 25 cm x 15 cm x 15 cm per una persona e 37 cm x 28 cm x 20 cm scatola per più di una persona), che viene utilizzata per memorizzare il ghiaccio tritato; un paio di pinzette a punta fine, che vengono utilizzate per afferrare le mosche refrigerate per le loro ali e trasferirle in una fiala; un paio di guanti da lavoro protettivi, che vengono utilizzati per prendere ghiaccio refrigerati da un congelatore -20 gradi centigradi; e pellicola di plastica, che viene utilizzato per coprire lo stadio di uno stereomicroscopio.
4. Gabbia per la raccolta delle uova di Drosophila
   NOT: Le gabbie pronte per la raccolta delle uova di Drosophila sono disponibili presso molte aziende biotecnologiche¹¹. Descritto qui è una piccola gabbia di raccolta delle uova a forma di bottiglia acrilica per piatti Petri da 60 mm (Figura1D sinistra; il design della gabbia è mostrato al centro). Può essere adattato per altre dimensioni della piastra Petri (ad esempio, 100 mm, 35 mm). Questo permette il trasferimento di mosche all'esterno o all'esterno della gabbia con facilità. Una semplice gabbia può essere preparata come segue.
   1. Utilizzare una fresa a scatto per tagliare una bottiglia di bevanda di plastica morbida (500 mL, diametro interno ca. 65 mm) in un rapporto approssimativamente 2:1 (estremità appuntita: estremità smussata) e scartare l'estremità smussata.
   2. Avvolgere una striscia di carta intorno a una piastra di succo di mela (diametro interno 60 mm) con nastro adesivo [la piastra di succo di mela viene utilizzata per raccogliere le uova (Figura 1E, a destra)].
5. Driver pennello tubo Cordless
   1. Ottenere un driver di perforazione cordless (velocità massima : 500 rpm).
   2. Ottenere un pennello tubo che ha setole lungo i lati così come la sua parte anteriore. Idealmente, il diametro del pennello dovrebbe essere leggermente più grande del diametro delle fiale di coltura che devono essere pulite. Tagliare l'estremità della maniglia in modo che possa essere inserita nel trapano mandrino (Figura 1D).
      NOT: Gli accessori necessari per questi strumenti di pulizia includono spugne in acciaio inox e guanti di gomma lungo polsino.

2. Trasferimento di mosche adulte dalla fiala A alla fiala B

NOT: Trasferire mosche adulte da una fiala all'altra è la pratica più comune condotta negli esperimenti sulla Drosophila [ad esempio, il trasferimento di mosche dalla vecchia cultura (A) alla cultura fresca (B) o da una fiala trasversale (A) a una fiala vuota (B)] per l'anestesizzazione. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per qualsiasi attività di trasferimento di mosche adulte. Se non diversamente specificato, questo protocollo viene utilizzato per trasferire le mosche dalla fiala A alla fiala B in tutto questo documento.

1. Controllare attentamente lo stelo dell'imbuto di un fappo F e la punta pipetta di un T-stopper, quindi eliminare le mosche che rimangono nei tappi con un soffiatore d'aria in gomma. Questo passo è di fondamentale importanza, soprattutto quando un insieme di T- e F-stoppers viene utilizzato per il trasferimento continuo di diverse linee di Drosophila.
2. Toccare le mosche nella fiala A e sostituire la spina con un T-stopper, quindi collegare la fiala B con un F-stopper.
3. Invertire la fiala A sulla fiala B, inserire l'estremità della punta della pipetta del T-stopper nell'apertura dell'imbuto del fappa F, battere il bordo della fiala A invertita per consentire alle mosche di scivolare fuori dalla punta della pipetta e attraverso il gambo dell'imbuto, e cadere nella fiala B. Se un vecchio cibo nella fiala A diventa meno compatto, può cadere quando la fiala A viene invertita e bussata. In una tale situazione, invertire fiala B sopra fiala A e consentire alle mosche di strisciare fino in fiala B.
4. Separare il T-stopper dal F-stopper. Capovolgi l'estremità della punta della pipetta del T-stopper con un tubo di microcentrifuga da 200 gradi se il rimanente vola nella fiala A bisogno di essere trasferito ad altre fiale momentaneamente; in caso contrario, rimuovere il T-stopper e ricollegare fiala A. Rimuovere il F-stopper e ricollegare fiala B.

3. Immobilizzare le mosche con il freddo

1. Conservare i ghiaccio resistenti in un congelatore a -20 gradi centigradi per almeno 24 h prima dell'uso.
2. Mettere un gelato ghiacciato e duro a temperatura ambiente (RT) per 20 min. Leggermente inumidire un pezzo di garza medica non asettica con un po 'd'acqua corrente e lasciarlo aggrapparsi da vicino alla superficie del ghiaccio. La garza medica può essere riutilizzata nel raffreddamento a mosca successiva. Allo stesso tempo, raffreddare una fiala vuota nel ghiaccio tritato.
3. Trasferire mosche adulte che devono essere immobilizzate nella fiala vuota refrigerata (CEV). Quando le due fiale di trasferimento sono separate, coprire il CEV con un piatto Petri o una spina e battere il CEV contro il ghiaccio tritato per toccare tutte le mosche nel CEV fino al fondo. Ripetere questo processo più volte fino a quando tutte le mosche sono immobilizzate. Le mosche saranno immobilizzate entro 30 s. Successivamente, posizionare il CEV nel ghiaccio per 1 min. Non è consigliabile trasferire troppe mosche contemporaneamente per l'anestesizzazione.
4. Versare le mosche refrigerate sulla garza medica che copre la confezione di ghiaccio. Stendere le mosche sovrapposte con un pennello e assicurarsi che ogni mosca può essere raffreddata dalla superficie fredda del ghiaccio. Se un hard pack refrigerato si gonfia leggermente, posizionarlo su un asciugamano e lavorare sul suo lato piatto.
5. Rimuovere le clip palco dallo stereomicroscopio, coprire il palco con un pezzo di pellicola di plastica e mettere il ghiaccio sul palco. Accendere la luce superiore (una fonte di luce fredda è auspicabile), mettere a fuoco lo stereomicroscopio e spostare il ghiaccio fino a quando le mosche refrigerate possono essere visualizzate chiaramente.

4. Uccidere mosche adulte per il conteggio, lo smistamento o lo scarto

1. Trasferire mosche adulte in una fiala vuota e coprirlo con un piatto Petri.
2. Invertire la fiala, riscaldarla per 1 min e 20 s in un forno a microonde e lasciare che le mosche morte cadano nel piatto Petri.
3. Indossare guanti da lavoro protettivi e togliere la fiala dal forno a microonde. Versare le mosche morte su una carta bianca, contare o esaminare le mosche con un ago microdissecolto sotto uno stereomicroscopio, e smaltire i corpi di mosca in un bidone della spazzatura dopo l'osservazione.
4. Per uccidere mosche indesiderate, riscaldare le mosche per 2-3 min in un forno a microonde, quindi toccare le carcasse in un bidone della spazzatura.
   NOT: Non è consigliabile uccidere alcuni ceppi mutanti delle ali (ad esempio, mutanti di lunghezza delle ali) per l'esame, in quanto è difficile giudicare dalle carcasse se le ali si estendono oltre la punta dell'addome, che si vede nelle mosche di tipo selvaggio.

5. Trasferimento di mosche in/uscita dalla gabbia per la raccolta delle uova a forma di bottiglia

NOT: Come accennato in precedenza, i tani a T e F vengono utilizzati per trasferire le mosche in entrata e in uscita dalla gabbia di raccolta delle uova. Le mosche non hanno bisogno di essere anestesizzate durante tutto questo processo. Altri dettagli, come la preparazione del mezzo di succo di mela, la raccolta delle uova e la dechorionizzazione, possono essere trovati nella letteratura¹².

1. Inserire la gabbia per la raccolta delle uova nel piatto del succo di mela o montare il piatto di succo di mela nella gabbia fatta di una bottiglia di bibita analcolica. Sigillare l'articolazione attorno ai due componenti con una striscia di pellicola di paraffina.
2. Mettere il maggior numero possibile di mosche nella gabbia e ricollegare la gabbia con un tappo di schiuma dopo aver trasferito le mosche.
3. Per cambiare il cibo per le mosche nella gabbia, trasferire le mosche nella gabbia in una fiala vuota.
4. Sostituire il succo di mela e richiudere, quindi trasferire le mosche dalla fiala alla gabbia.
5. Quando la raccolta delle uova termina, trasferire le mosche in una fiala vuota e trasferirle in fiale di coltura.

6. Pulizia delle fiale della cultura del vetro

NOT: Generalmente, una fiala vecchia cultura contiene mosche vive. Nel protocollo qui descritto, queste mosche NON hanno bisogno di essere uccise prima della pulizia a meno che non siano mosche transgeniche.

1. Rimuovere qualsiasi inchiostro pennarello permanente dalle fiale della coltura di vetro con spugne in acciaio bagnato e inossidabile.
2. Immergere le fiale della coltura in acqua corrente.
   1. Riempire un lavandino di laboratorio con acqua, aggiungere sapone per lavastoviglie liquido in acqua e mescolare.
   2. Immergere le fiale della coltura nell'acqua, quindi rimuovere la spina, consentendo all'acqua di correre nella fiala. Il detersivo per piatti in acqua farà tutte le mosche adulte rimanenti affondare sul fondo e annegare in acqua.
   3. Immergere le fiale della vecchia coltura in acqua per almeno 30 min.
3. Allenta il mandrino del trapano, inserisci il pennello della provetta e ristringi il mandrino. Controllare la direzione del selettore di rotazione e assicurarsi che il trapano ruoti in senso orario. Regolare il grilletto di velocità e assicurarsi che la velocità massima sia inferiore a 500 giri/min.
4. Pulire le fiale della coltura.
   1. Pulire le fiale di coltura grossolanamente.
      1. Mettere un lungo guanto di gomma polsino sulla mano non dominante e tenere la fiala in acqua.
      2. Tenere il driver del tubo cordless con la mano dominante nuda, spremere il pennello nella fiala di coltura e premere il grilletto.
         NOT: Non immergere la batteria in acqua. Il pennello rotante scomporrà il vecchio cibo, la pupa, ecc., e rimuoverà più del 95% dei rifiuti.
      3. Scaricare i rifiuti in un bidone dell'immondizia separato. Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte dei rifiuti in ogni fiala è stata pulita.
   2. Pulire accuratamente le fiale della coltura.
      1. Pulire la spazzola del tubo, scolare e pulire il lavandino e riempirlo con acqua pulita.
      2. Rimuovere i rifiuti rimanenti da ogni fiala di coltura come descritto nella sezione 6.4.1.

Risultati

I T- e F-stopper sono stati sviluppati come un insieme di strumenti semplici che possono essere adattati e utilizzati in qualsiasi attività di trasferimento di mosca. Trasferire mosche da una vecchia cultura in diverse culture fresche comporta la rimozione dei tappi delle fiale fresche, la loro sostituzione con i tappi F, quindi toccando le mosche nella vecchia fiala, rimuovendo rapidamente la spina e sostituendola con un T-stopper. Se il vecchio cibo è compatto, allora è importante ca...

Discussione

Alcuni strumenti fatti in casa per la gestione delle attività di base coinvolte nell'allevamento e nella sperimentazione della Drosophila sono descritti in questo documento. Questi strumenti sono semplici ma piuttosto efficaci. Praticamente, qualsiasi laboratorio può fare questi strumenti con facilità, e una ricerca o un laboratorio didattico non ha bisogno di trovare un'alternativa già pronta che forse non è disponibile a livello locale.

Il trasferimento del volo è la pratica p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
a pair of pliers
cordless drill driver			max speed: 500 rpm
electric soldering iron
file
funnel			diameter of disk<60mm
ice box
insect pins
infrared thermometer			HCIYET HT-830
long cuff rubber gloves
mechanical pencils
medical gauze
microcentrifuge tube			100 ul
microwave oven
Parafilm
peri dish			internal diameter 60 mm
pipette tips			1 ml
plastic film
plastic peri dish			Φ36 mm used to cover the empty vial
point tweezers
protective work gloves
re-freezable hard icepacks			26.5×14.5×2.5 cm or larger
rubber air blower
snap cutter
soft drink bottle			500 ml, internal diameter c.a. 65 mm
sponge stopper
stainless steel sponges
tube brush
vial			Φ34 mm × 90 mm