כלים ביתיים פשוטים לטיפול בזבובי פירות-דרוסופילה מלאנוסטר

Summary

המתואר כאן הוא השימוש בכמה כלים תוצרת בית כדי להעביר, לצנן, ולהרוג מבוגרים Drosophila ילה, כמו גם לנקות את התרבות זכוכית מבחנות ולאסוף ביצים. כלים אלה קלים לעשות והם יעילים למדי בטיפול Drosophila ילה.

Abstract

הזבוב הפרי, דרוזופילה מלאנוסטר, משמש רבות גם בחינוך ביולוגי ובביולוגיה. טיפול בזבובים מבוגרים נפוץ אך קשה בפועל, כאשר זבובים מבוגרים עפים. הפגינו כאן היא איך לעשות כמה כלים פשוטים וחסכוניים כדי לטפל בבעיות קשות בטיפול Drosophila ילה. חורים בפקקים מוקצף נעשים ומfunnels ומוכנסים לתוך החורים. לאחר מכן, הזבובים זזים רק בכיוון אחד לתוך מכלול הפיפטה/משפך של הצינורות , ומאפשר שליטה יעילה על העברת הבוגרים לתוך או מתוך בקבוקון. הפרוטוקולים הקיימים שונו לזבובים מצננים על ידי התקררות בקרח כתוש והעברתם אל משטח קר, קשה מסכה. מסכה מכוסה פיסת גזה רפואי שמחזיק ללא קיבוע זבובים מהמים המרוכז כאשר נבדק תחת stereomicroscope. הזבובים מורדמים בסופו של דבר לספירה ולמיון או למחיקה על ידי המיקרוגל. הכלוב בצורת בקבוק פותחה גם עבור איסוף ביצים, כמו גם מכשיר לחסכון בעבודה וליווי פרוטוקול לניקוי בקבוקים של תרבות זכוכית.

Introduction

זבוב הפירות, דרוסופילה מלאנוסטר, הוא אורגניזם מודל המשמש רבות בחינוך ביולוגי ובביולוגיה לחקר מגוון רחב של נושאים^1,2. הבעיות הבסיסיות בטיפול בדרוסופילה הן העברת מבוגרים ממבחנה לבקבוקון ולשתק את הזבובים כך שיהיה קל יותר לטפל בהם, כמו כל המבוגרים (למעט מוטציות מסוימות^3,4) יכולים לעוף.

מקובל, חוקר מעביר זבובים ממבחנה אחת לאחרת על ידי החזקת שני מבחנות פה-לפה, הקשה על זבובים למטה או לאפשר זבובים לטוס לתוך בקבוקון אחר, ולאחר מכן הפרדת וחיבור מחדש שני מבחנות⁴. כמובן, הדבר דורש שפתיחת שני מבחנות בקוטר זהה, וקשה לשלוט בכמות הזבובים המועברים. בינתיים, זה דורש ידיים מהירות כדי לבצע את העבודה, ובריחה זבובים תועים יכול לגרום לבעיות עבור המעבדה או הכיתה. הוספת זבובים בתולין נוספים או זבובים זכרים לצלב כבר מוכן היא משימה שגרתית נוספת בניסויים דרוזוהילה . מקובל, זבובים חייב להיות מקיבוע במבחנה לפני תוספת של זבובים נוספים.

מבוגרים מרדימים באופן שגרתי על ידי אתר, CO₂, או מצמרר⁵. לעומת החשיפה לאתר ושיתוף₂ , מצמרר הוא הסוכן החסכוני ביותר עבור ששתק למבוגרים דרוסופילה ואת הפחות מזיק הן זבובים וחוקרים (בעיקר סטודנטים צעירים)^6,7. עם זאת, מים העבים באופן רציף על פני השטח הקר או מרטיב את הזבובים. קשה לקבוע את פנוטיפים של זבובים רטובים, והם יכולים בקלות להיפגע במהלך מניפולציה^8,9. זה שמר על שיטת הצינון. להיות מקובלת יותר

כלים עבור העברת הזבוב ושיטה לקירור מעופף כבר תוארו בעבר¹⁰. להלן, מדווחים שטכניקת הרדמה מצמררת ששונתה, הינה בטוחה, אמינה ואפשרית לניסויים בדרוזוהילה . מתואר גם במאמר זה 1) שיטות להרוג מבוגרים עבור ספירה, מיון, או השמטה, 2) התקנים לחסכון בעבודה ופרוטוקולים לניקוי מבחנות של תרבות זכוכית, ו 3) כלוב פשוט לאיסוף ביצים. הכלים תוכנן בקלות וחסכוני המתואר כאן יכול לשמש כדי לטפל בנושאים קשים של טיפול בזבוב, ושיטות אלה נבדקו והוכחו להיות חזקים, אמין, קל לטפל עבור חוקרים מנוסים ומתחילים.

Protocol

1. הכנת כלים ועזרים

1. פקקים/משפך
   1. השג שני אטמי ספוג (קוטר התקעים חייב להיות מעט גדול יותר מהקוטר הפנימי של הבקבוקונים המשמשים להעברת זבובים). בצע חור במרכזי של אטמי ספוג עם ברזל מחומם להלחמה חשמלית.
   2. השיגו שני טיפים של הפיפטה, חותכים אחד לחצי בצורה מחוסרת עם סכין חדה, וזורקים את הקצה המחודד. ואז, לחתוך 1.5 ס מ של הקצה המחודד מהקצה השני של הצינורות. הדבק את השרידים של שני הפיפטה ביחד עם דבק לכל מטרה כדי ליצור קצה מוארך של פיפטה (איור 1A).
   3. הכנס משפך ואת הקצה הצינור מוארך לתוך אטמי ספוג כדי ליצור טיפ משפך פקק (להלן המכונה T-ו-F הפקקים) וכיפה את העצה הפיפטה עם צינור מיקרוצנטריפוגה 100 μL (איור 1A).
      הערה: אורך גבעול המשפך חייב להיות גדול מגובה התקע. אם הוא קצר יותר או שווה לגובה של התקע, אז הזבובים יברחו מפתח הגבעול. סוף גבעול המשפך צריך להיות ממוקם לפחות 2 ס מ מעל פני השטח של המדיום התרבותי או התחתון של בקבוקון ריק. Funnels קטנים (למשל, בקוטר הדיסק < 60 מ"מ) עם קטרים קטנים של פתיחת גזע פנימי (< 5 מ"מ) עדיפים. ניתן להשתמש בזכוכית או במשפך פלסטיק כדי ליצור פקק F. עם זאת, funnels פלסטיק עדיפים על שיעורי ביולוגיה, כפי שהם שוברים פחות בקלות מfunnels זכוכית.
2. מחטים מיקרובתר
   1. השיגו עפרונות מכניים החשים בנוח ביד ובסיכות החרקים התואמים את הקטרים (למשל, 0.5 מ"מ, 0.7 מ"מ) של מילוי העופרת שלהם.
   2. חותכים את הקצוות הרחבים של סיכות החרק עם זוג צבת ולתייק את החלק השטוח. החלף את ההפניה עם הפינים (איור 1B). לחץ על לחצן הלחיצה והזנה של 0.5 – 1 ס מ של סיכה כדי לבצע ניתוח. נקו את הסיכה ודחפו אותו לגמרי חזרה לפיר העיפרון לאחר פעילות הניתוח כדי להפוך אותו לבטוח עבור כל אדם לטפל.
      הערה: מחטים מיקרוספירה שימושיות לא רק בניתוח איברים כגון זחל בלוטות הרוק אלא גם בספירה ומיון זבובים מבוגרים מת.
3. ליוקס קשוחים
   1. להשיג מספר refreezable icepacks קשה (icepacks בגודל גדול עדיפים). איור 1C מראה icepacks זה עבד היטב, אשר מודד 26.5 ס"מ x 14.5 ס"מ x 2.5 ס"מ יש הצדדים העליון והתחתון כי הם שטוחים לחלוטין.
   2. גזור גזה רפואי (לא סטרילי) לחתיכות כי הם מעט קטנים יותר מאשר המשטחים הקרים של icepacks הם מכסים. לדוגמה, פיסת גזה רפואית מעט קטן יותר מ 26.5 ס"מ x 14.5 ס"מ עדיף לכסות מסכה המוצג באיור 1c.
      הערה: האביזרים הדרושים עבור אלה כלים מצמררת כוללים: תיבת קרח (השתמשנו 25 ס"מ x 15 ס"מ x 15 ס מ תיבת קצף לאדם אחד ו-37 ס"מ x 28 ס"מ x 20 ס מ תיבת עבור יותר מאדם אחד), המשמש לאחסון קרח כתוש; זוג מלקחיים דקים, המשמשים לתפוס זבובים צוננים על ידי כנפיהם ולהעבירם לבקבוקון; זוג כפפות עבודה הגנה, אשר משמשות כדי לקחת מקורר החוצה של a-20 ° c מקפיא; וסרט פלסטיק, המשמש לכיסוי השלב של stereomicroscope.
4. כלוב איסוף ביצת דרוזוהילה
   הערה: מוכנות מראש אוספים כלובים אוסף ביצים זמינים מחברות ביוטכנולוגיה רבות¹¹. המתואר כאן הוא בקבוק אקרילי קטן בצורת ביצה כלוב איסוף עבור 60 מ"מ מנות פטרי (איור 1D שמאל; עיצוב הכלוב מוצג באמצע). ניתן להתאים אותו למידות אחרות של כלי פטרי (לדוגמה, 100 מ"מ, 35 מ"מ). זה מאפשר העברת זבובים לתוך או מחוץ לכלוב בקלות. כלוב פשוט יכול להיות מוכן כדלקמן.
   1. השתמש בחותך הצמד כדי לגזור בקבוק משקה פלסטי רך (500 mL, קוטר פנימי ca. 65 מ"מ) לתוך 2:1 משוער (קצה מחודד: בקצה קהה) היחס ולמחוק את הקצה הקהה.
   2. עטוף רצועה של נייר כרטיס סביב צלחת מיץ תפוחים (קוטר פנימי 60 מ"מ) עם סרט דביק [צלחת מיץ תפוחים משמש כדי לאסוף ביצים (איור 1E, נכון)].
5. נהג מברשת שפופרת אלחוטי
   1. השג מנהל מקדחה אלחוטי (מהירות מקסימלית = 500 rpm).
   2. השיגו מברשת שפופרת עם זיפים לאורך הצדדים, כמו גם החזית שלה. באופן אידיאלי, קוטרו של המברשת צריך להיות גדול מעט יותר מקוטר של בבחנות התרבות שיש לנקות. חותכים את קצה הידית שלה כך שניתן להוסיף אותו לתוך המקדחה (איור 1D).
      הערה: האביזרים הדרושים עבור כלי ניקוי אלה כוללים ספוגים מפלדת אל-חלד וכפפות גומי ארוך השרוול.

2. העברת זבובים למבוגרים ממבחנה A כדי בקבוקון B

הערה: העברת זבובים של מבוגרים ממבחנה אחת לאחרת היא הפרקטיקה השכיחה ביותר בניסויים בדרוזוהילה [למשל, העברת זבובים מהתרבות הישנה (א) לתרבות טרייה (b) או מבקבוקון צלב (א) לבקבוקון ריק (ב). הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש עבור כל מבוגר לטוס העברת פעילויות. אלא אם נכתב אחרת, פרוטוקול זה משמש כדי להעביר זבובים ממבחנה A כדי בקבוקון B לאורך הנייר הזה.

1. בדוק את הגבעול של המשפך של פקק F ואת קצה הפיפטה של פקק T בזהירות, ולאחר מכן נקה את כל הזבובים שנשארו בפקקים עם מפוח אוויר מגומי. שלב זה הוא בעל חשיבות עליונה, במיוחד כאשר מדובר בקבוצה אחת של מטוסי T ו-F המשמשים להעברה רציפה של קווי דרוזוהילה שונים.
2. להקיש את הזבובים במבחנה A ולהחליף את התקע שלה עם פקק T, ואז לחבר בקבוקון B עם פקק F.
3. היפוך בקבוקון A מעל בקבוקון B, להכניס את קצה החריץ של הפקק לתוך פתיחת המשפך של מעצור F, להפיל את הקצה של בקבוקון הפוכה A כדי לאפשר זבובים לחמוק מתוך הקצה של הצינורות ודרך גבעול המשפך, וירידה לתוך בקבוקון B. אם כל האוכל הישן במבחנה A הופך פחות קומפקטי, זה עלול לרדת כאשר בקבוקון A הוא הפוך ודפק. במצב כזה, להפוך בקבוקון B מעל בקבוקון A ולאפשר זבובים לזחול לתוך בקבוקון B.
4. . הפרידו את הפקק מפקק האף המכסה את קצה הפיפטה של מעצור ה-T עם שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 200 μL, אם הזבובים הנותרים במבחנה יש צורך להעביר לבקבוקונים אחרים בכל רגע; אחרת, להסיר את הפקק ולחבר מחדש את המבחנה א. הסר את הפקק F וחבר מחדש בקבוקון B.

3. לשתק את הזבובים על ידי צינון

1. לשמור על refreezable icepacks קשה ב-20 ° c מקפיא לפחות 24 שעות לפני השימוש.
2. מניחים מקורר, קשה מסכה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 20 דקות. מעט מויסטן פיסת גזה רפואי שאינה אספספיגה עם כמה מים זורמים ולאפשר לו להיאחז היטב את פני השטח של מסכה. גזה רפואי ניתן לעשות שימוש חוזר הזבוב הבא מצמרר. באותו זמן, לצנן בקבוקון ריק בקרח כתוש.
3. העבר זבובים מבוגרים כי צריך להיות מקיבוע לתוך הבקבוקון הריק מקורר (CEV). כאשר שני מבחנות העברה מופרדים, לכסות את CEV עם צלחת פטרי או תקע ולהפיל את CEV נגד קרח כתוש כדי להקיש על כל הזבובים CEV למטה לתחתית. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שכל הזבובים יהיו ללא תנועה. . הזבובים יהיו ללא קיבוע בתוך 30 שנות לאחר מכן, הצב את ה-CEV בקרח במשך 1 דקות. לא מומלץ להעביר יותר מדי זבובים בבת אחת בשביל להיות מורדם.
4. יוצקים את הזבובים מקורר אל גזה רפואי שמכסה את חבילת קרח. מורחים את הזבובים חופפים עם מכחול ולוודא כי כל זבוב יכול להיות מקורר על ידי המשטח הקר של icepack. אם מצוננים מצונן מתנפח מעט, מניחים אותו על מגבת ועובדים על הצד השטוח.
5. להסיר את הסרטונים מstereomicroscope, לכסות את הבמה עם פיסת סרט פלסטיק, ולשים את מסכה על הבמה. הפעל את האור העליון (מקור אור קר רצוי), למקד את stereomicroscope ולהעביר את מסכה עד זבובים מקורר ניתן לראות בבהירות.

4. הריגת זבובים למבוגרים לספירה, מיון או השמטה

1. להעביר מבוגרים זבובים לתוך בקבוקון ריק ולכסות אותו עם צלחת פטרי.
2. להפוך את המבחנה, לחמם אותו עבור 1 דקות + 20 במיקרוגל, ולאפשר זבובים מתים לרדת לתוך צלחת פטרי.
3. תלבש כפפות מגן ותוציא. את הבקבוקון מהמייקרוגל יוצקים זבובים מתים על כרטיס נייר לבן, לספור או לבחון את הזבובים עם מחט מיקרוסקופ מתחת stereomicroscope, ולהיפטר הגופות לעוף בפח אשפה לאחר התבוננות.
4. כדי להרוג זבובים לא רצויים, לחמם את הזבובים 2 – 3 דקות במיקרוגל, ואז להקיש על הגוויות לתוך פח אשפה.
   הערה: לא מומלץ להרוג כמה זנים של מוטציות כנף (למשל, המוטנטים אורך הכנף) לבדיקה, כי קשה לשפוט מן הגוויות אם הכנפיים להאריך מעבר לקצה הבטן, אשר נראה זבובים מסוג פראי.

5. העברת זבובים פנימה/החוצה של בקבוקים בצורת כלוב אוסף ביצים

הערה: כפי שהוזכר לעיל, הפקקים T ו-F משמשים כדי להעביר זבובים לתוך ומחוץ לכלוב אוסף ביצים. זבובים לא צריכים להיות מורדם במהלך תהליך זה. פרטים נוספים, כגון הכנת מדיום מיץ התפוחים, אוסף הביציות והדבורנון, ניתן למצוא בספרות¹².

1. הכנס את הכלוב אוסף ביצים לתוך צלחת מיץ תפוחים או להר את צלחת מיץ התפוחים לכלוב עשוי בקבוק משקה רך. לאטום את המפרק סביב שני המרכיבים עם רצועת סרט הפרפין.
2. מניחים כמו זבובים רבים ככל האפשר לתוך הכלוב ולחבר מחדש את הכלוב עם פקק קצף לאחר העברת הזבובים.
3. כדי לשנות את המזון עבור זבובים בכלוב, להעביר את הזבובים בכלוב לבקבוקון ריק.
4. להחליף את הצלחת מיץ תפוחים לאטום אותו, ואז להעביר את הזבובים מן המבחנה בחזרה לכלוב.
5. כאשר אוסף הביצים מסתיים, להעביר את הזבובים לתוך בקבוקון ריק ולהעביר אותם לתוך בבקבוקונים התרבות.

6. ניקוי תרבית ומבחנות

הערה: באופן כללי, בקבוקון תרבות ישן מכיל זבובים חיים. בפרוטוקול המתואר כאן, זבובים אלה לא צריך להיהרג לפני הניקוי אלא אם כן הם זבובים הטרנסגניים.

1. הסירו את כל דיו הסמן הקבוע מתוך מבחנות של תרבות זכוכית עם ספוגים רטוב נירוסטה.
2. משרים את מבחנות התרבות במים זורמים.
   1. ממלאים כיור מעבדה עם מים, מוסיפים סבון נוזלי כלים למים ומערבבים.
   2. לטבול את מבחנות התרבות לתוך המים, ולאחר מכן להסיר את התקע, המאפשר למים לרוץ לתוך הבקבוקון. אבקת הכלים במים תגרום לשאר הזבובים הבוגרים לשקוע לתחתית ולטבוע במים.
   3. משרים את מבחנות התרבות הישנות במים לפחות 30 דקות.
3. שחרר את הצ של התרגיל, הכנס את מברשת שפופרת הבדיקה והretighten את הצ. בדוק את כיוון בורר הסיבוב וודא שהתרגיל מסתובב בכיוון השעון. כוונן את הגורם המפעיל המהיר וודא שהמהירות המירבית נמוכה מ-500 סל ד.
4. . נקה את בבחנות התרבות
   1. נקה את מבחנות התרבות בערך.
      1. שים כפפת גומי ארוכה על היד הלא דומיננטית והחזק את הבקבוקון במים.
      2. החזיקו את נהג מברשת השפופרת האלחוטי עם היד הדומיננטית החשופה, מחצי את המברשת לתוך בקבוקון התרבות וסוחטים את ההדק.
         הערה: אל טבול את הסוללה במים. המברשת המסתובבת תשבור את האוכל הישן, הגולם וכדומה, ותסיר יותר מ-95% מהפסולת.
      3. השליכו את הפסולת. לתוך פח אשפה נפרד חזור על תהליך זה עד שרוב הפסולת בכל בקבוקון נוקה.
   2. נקו את מבחנות התרבות ביסודיות.
      1. נקו את מברשת הצינורית, רוקנו ונקו את הכיור, וממלאים אותו במים נקיים.
      2. הסר את הפסולת הנותרת מכל בקבוקון תרבות כמתואר בסעיף 6.4.1.

תוצאות

T-ו-F הפקקים פותחו כקבוצה של כלים פשוטים שניתן להתאים ולהשתמש בכל לטוס העברת פעילויות. העברת זבובים מתרבות ישנה למספר תרבויות טריות כרוכה בהסרת אטמי הבקבוקונים הטריים, החלפתו בפקקים, ולאחר מכן הקשה על הזבובים בבקבוקון הישן, הסרת התקע במהירות והחלפתו בפקק T. אם האוכל הישן ה?...

Discussion

מספר כלים תוצרת בית לטיפול בפעילויות בסיסיות הכרוכות בגידול בדרוזוהילה ובניסויים מתוארים במאמר זה. כלים אלה פשוטים אך יעילים למדי. כמעט, כל מעבדה יכולה לעשות את הכלים האלה בקלות, ומחקר או מעבדה להוראה לא צריך למצוא חלופה מוכנה שהיא אולי לא זמינה באופן מקומי.

העברת טיסה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
a pair of pliers
cordless drill driver			max speed: 500 rpm
electric soldering iron
file
funnel			diameter of disk<60mm
ice box
insect pins
infrared thermometer			HCIYET HT-830
long cuff rubber gloves
mechanical pencils
medical gauze
microcentrifuge tube			100 ul
microwave oven
Parafilm
peri dish			internal diameter 60 mm
pipette tips			1 ml
plastic film
plastic peri dish			Φ36 mm used to cover the empty vial
point tweezers
protective work gloves
re-freezable hard icepacks			26.5×14.5×2.5 cm or larger
rubber air blower
snap cutter
soft drink bottle			500 ml, internal diameter c.a. 65 mm
sponge stopper
stainless steel sponges
tube brush
vial			Φ34 mm × 90 mm