과일 파리를 처리하는 간단한 수제 도구 -초파리 멜라노가스터

요약

여기에 설명 된 여러 수 제 도구의 사용 전송, 진정, 성인 Drosophila를죽일, 뿐만 아니라 유리 문화 유리 유리 병을 청소 하 고 계란을 수집. 이러한 도구는 쉽게 만들 수 있으며 Drosophila를 처리하는 데 매우 효율적입니다.

초록

과일 파리, 드로 소필라 멜라 노 가스터,널리 생물학적 연구 및 생물학 교육 모두에서 사용된다. 성인 파리를 취급하는 것은 일반적이지만 성인 파리가 비행하기 때문에 실제로는 어렵습니다. 여기에서 설명한 것은 Drosophila의처리에 있는 어려운 문제점을 해결하기 위하여 몇몇 간단하고 비용 효과적인 공구를 만드는 방법입니다. 폼 스토퍼의 구멍이 만들어지고 피펫 팁이나 깔때기가 구멍에 삽입됩니다. 파리는 피펫 팁/깔때기 조립체로 한 방향으로만 이동하여 성인 Drosophila를 바이알로 또는 바이알로 이송하는 것을 효율적으로 제어할 수 있습니다. 기존 프로토콜은 분쇄 된 얼음에서 냉각하고 차갑고 단단한 얼음 팩 표면으로 옮겨 서늘한 마취 파리를 위해 수정되었습니다. 아이스팩은 입체 현미경으로 검사할 때 응축된 물에서 움직이지 않는 파리를 유지하는 의료용 거즈 조각으로 덮여 있습니다. 파리는 마침내 마이크로 웨이브에 의해 계산 및 분류 또는 폐기안락사된다. 병 모양의 케이지는 계란을 수집하기 위한 개발되었으며, 노동력 을 절약하는 장치와 유리 배양 바이알 을 청소하기위한 프로토콜이 동반되었습니다.

서문

과일 파리, Drosophila melanogaster는, 널리 주제^1,2의넓은 범위를 연구하는 생물학 연구 및 생물학 교육에 사용되는 모델 유기체이다. Drosophila를 취급하는 기본적인 문제는 모든 성인 (일부 돌연변이 3,⁴제외)이 비행 할 수 있으므로 바이알에서 바이알로 의 성인을 옮기고 파리의 고정을 처리하기가 더 쉽습니다.

종래, 연구원은 두 개의 유리병을 입에서 입으로 잡고, 파리를 두드리거나 파리가 다른 바이알로 날아오르도록 허용한 다음 두바이알을 분리하고 다시 연결하여 한 바이알에서 다른 바이알로 이동합니다 4. 분명히, 이것은 동일한 직경의 두 개의 바이알의 개구부를 필요로하며, 전송 된 파리의 양을 제어하기가 어렵습니다. 한편, 이것은 일을 끝내기 위하여 빠른 손이 필요하고, 길 잃은 파리를 탈출하는 것은 실험실 또는 교실에 대한 문제가 귀착될 수 있습니다. 엑스트라 버진 파리 또는 수컷 파리를 이미 준비된 십자가에 추가하는 것은 Drosophila 실험에서 또 다른 일상적인 작업입니다. 종래, 파리는 여분의 파리를 추가하기 전에 크로스 바이알에 고정되어야한다.

성인 초파리는 일상적으로 에테르, CO 2, 또는냉각 5에의해 마취된다. 에테르 및_CO2 노출에 비해, 냉각은 성인 Drosophila를 고정시키기위한 가장 비용 효율적인 에이전트이며 파리와 연구자 (특히 젊은 학생)^6,7모두에게 가장 유해합니다. 그러나 차가운 표면이나 챔버에 지속적으로 응축되는 물은 파리를 적시다. 젖은 파리의 표현형을 결정하는 것은 어렵고 조작^8,9중에 쉽게 손상 될 수 있습니다. 이것은 냉각 방법이 더 널리 받아들여지는 것을 막았습니다.

플라이 트랜스퍼를 위한 도구 및 플라이 냉각 을 위한 방법은 앞서^10에기술되어 있다. 본 명세서에서, 변형된 냉각 마취 기법은 드로소필라 실험에 대해 안전하고 신뢰할 수 있으며 실현 가능하다고 보고된다. 또한 이 논문에서는 1) 계산, 분류 또는 폐기를 위한 성인을 죽이는 방법, 2) 유리 배양 바이알 을 청소하기 위한 노동 절약 장치 및 프로토콜, 3) 계란 을 수집하기위한 간단한 케이지입니다. 여기에 설명된 간편하게 설계되고 비용 효율적인 도구는 플라이 핸들링의 어려운 문제를 해결하는 데 사용할 수 있으며, 이러한 방법을 테스트했으며 숙련된 연구원과 초보 연구원을 위해 견고하고 신뢰할 수 있으며 다루기 쉬운 것으로 입증되었습니다.

프로토콜

1. 도구 및 액세서리 준비

1. 팁/깔때기 스토퍼
   1. 두 개의 스폰지 플러그를 구하십시오 (플러그의 직경은 파리를 전송하는 데 사용되는 바이알의 내부 직경보다 약간 커야합니다). 가열 된 전기 납땜 인두로 스폰지 플러그의 중심에 구멍을 만듭니다.
   2. 두 개의 1mL 파이펫 팁을 얻고 날카로운 칼로 반으로 자르고 뾰족한 끝을 버립니다. 그런 다음, 두 번째 파이펫 팁에서 뾰족한 끝의 1.5 cm를 잘라. 두 파이펫 팁의 유적을 다목적 접착제와 함께 접착제로 사용하여 긴 파이펫 팁을 만듭니다(그림1A).
   3. 깔때기와 길쭉한 파이펫 팁을 스폰지 플러그에 삽입하여 팁및 퍼널 스토퍼(이하 T-및 F-스토퍼라고 함)를 만들고 100 μL 미세원심지 튜브(그림1A)로피펫 팁을 캡합니다.
      참고: 깔때기 줄기의 길이는 플러그의 높이보다 커야 합니다. 플러그 높이보다 짧거나 같으면 파리가 줄기 개구부에서 빠져나갑니다. 깔때기 줄기의 끝은 배양 배지또는 빈 바이알의 바닥 위에 적어도 2 cm 위에 위치되어야 한다. 작은 내부 스템 개구름(&5mm)을 가진 작은 깔때기(예: 디스크 직경 및 60mm)가 바람직합니다. 유리 또는 플라스틱 깔때기를 사용하여 F 스토퍼를 만들 수 있습니다. 그러나 플라스틱 깔때기는 유리 깔때기보다 쉽게 부서지기 때문에 생물학 수업에 선호됩니다.
2. 미세 제해 바늘
   1. 손에 편안하게 느껴지는 기계식 연필과 납 리필의 직경(예: 0.5mm, 0.7mm)과 일치하는 곤충 핀을 구하십시오.
   2. 펜치 한 쌍으로 곤충 핀의 넓은 끝을 잘라 평평하게 잘라. 리드를 핀으로 바꿉니다(그림1B). 클릭 버튼을 누르고 핀의 0.5-1cm를 공급하여 해부를 수행합니다. 핀을 청소하고 해부 활동 후 연필 샤프트에 완전히 다시 밀어 사람이 안전하게 다룰 수 있도록하십시오.
      참고: 미세 분해 바늘은 애벌레 침샘과 같은 기관의 해부뿐만 아니라 죽은 성인 파리를 계수하고 분류하는 데에도 유용합니다.
3. 단단한 아이스팩
   1. 재사용 가능한 하드 아이스팩을 여러 개 구하십시오(대형 아이스팩이 바람직함). 그림 1C는 26.5cm x 14.5 cm x 2.5cm의 아이스팩이 잘 작동하며 상하면이 완전히 평평하다는 것을 보여줍니다.
   2. 의료 거즈 (비 살균)를 커버하는 얼음 팩의 차가운 표면보다 약간 작은 조각으로 자릅니다. 예를 들어, 26.5 cm x 14.5 cm보다 약간 작은 의료용 거즈 조각은 도 1C에도시된 아이스팩을 커버하는 것이 바람직하다.
      참고: 이러한 냉각 도구에 필요한 액세서리는 다음과 같습니다 : 얼음 상자 (우리는 한 사람에 대한 25cm x 15cm x 15cm 폼 상자를 사용하고 37cm x 28cm x 20cm 상자 는 두 명 이상) 분쇄 된 얼음을 저장하는 데 사용됩니다; 한 쌍의 미세 점 핀셋, 그들의 날개에 의해 차가운 파리를 잡아 유리병에 그들을 전송 하는 데 사용 됩니다.; -20 °C 냉동고에서 차가운 아이스 팩을 꺼내는 데 사용되는 보호 작업 장갑 한 쌍; 및 플라스틱 필름, 이는 입체 현미경의 단계를 커버하는 데 사용됩니다.
4. 초파리 계란 수집 케이지
   참고: 기성품 Drosophila 계란 수집 케이지는 많은 생명 공학 회사에서 사용할 수 있습니다^11. 여기에 설명된 60 mm 페트리 접시에 대한 작은 아크릴 병 모양의 계란 수집 케이지 (그림1D 왼쪽; 케이지 디자인은 중간에 도시되어 있다). 다른 페트리 접시 크기(예: 100mm, 35mm)에 맞게 조정할 수 있습니다. 이를 통해 케이지 안으로 또는 케이지밖으로 쉽게 파리를 옮길 수 있습니다. 간단한 케이지는 다음과 같이 준비할 수 있습니다.
   1. 스냅 커터를 사용하여 청량 플라스틱 음료 병(500mL, 내부 직경 65mm)을 대략 2:1(뾰족한 끝:무딘 끝) 비율로 자르고 무딘 끝을 버립니다.
   2. 접착제 테이프로 사과 주스 플레이트 (내부 직경 60mm)를 감싸는 카드 용지 의 스트립 [사과 주스 플레이트는 계란을 수집하는 데 사용됩니다 (그림1E,오른쪽].
5. 무선 튜브 브러시 드라이버
   1. 무선 드릴 드라이버(최대 속도 = 500rpm)를 가져옵니다.
   2. 앞면뿐만 아니라 측면과 강모가있는 튜브 브러시를 가져옵니다. 이상적으로 브러시의 직경은 청소해야 하는 배양 바이알의 직경보다 약간 커야 합니다. 핸들의 끝을 잘라 드릴 척에 삽입할 수있도록 합니다(그림 1D).
      참고: 이러한 청소 도구에 필요한 액세서리는 스테인레스 스틸 스폰지와 긴 커프 고무 장갑을 포함한다.

2. 바이알 A에서 바이알 B로 성인 파리 이전

참고: 한 바이알에서 다른 바이알로 성인 파리를 옮기는 것은 Drosophila 실험에서 수행되는 가장 일반적인 관행입니다 [예를 들어, 오래된 문화 (A)에서 신선한 문화 (B)로 파리를 옮기거나 교차 바이알 (A)에서 빈 바이알 (B)]으로 마취를 위한 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 모든 성인 비행 전송 활동에 사용할 수 있습니다. 달리 명시되지 않는 한, 이 프로토콜은 이 논문에서 바이알 A에서 바이알 B로 파리를 전송하는 데 사용된다.

1. F-스토퍼의 깔때기 줄기와 T 스토퍼의 피펫 팁을 조심스럽게 확인한 다음 고무 에어 블로어로 스토퍼에 남아 있는 파리를 치웁습니다. 이 단계는 특히 한 세트의 T-및 F-스토퍼가 다른 Drosophila 라인의 연속 전달에 사용되는 경우에 가장 중요합니다.
2. 바이알 A의 파리를 누르고 플러그를 T 스토퍼로 교체한 다음 바이알 B를 F 스토퍼로 연결합니다.
3. 바이알 B 를 통해 바이알 A를 반전, F 스토퍼의 깔때기 개구부에 T 스토퍼의 피펫 팁 끝을 삽입, 반전 바이알 A의 가장자리를 노크하여 파리가 피펫 팁에서 미끄러 질 수 있도록하고 깔때기의 줄기를 통해, 바이알 B로 드롭. 바이알 A의 오래된 음식이 덜 컴팩트해지면 바이알 A가 반전되어 넘어질 때 떨어질 수 있습니다. 이러한 상황에서, 바이알 B를 바이알 A위에 반전시키고 파리가 바이알 B로 기어 올라갈 수 있게 한다.
4. T 스토퍼를 F 스토퍼에서 분리합니다. 잔류한 바이알A가 다른 바이알로 순간적으로 옮겨질 필요가 있는 경우 200 μL 마이크로원각지 튜브로 T 스토퍼의 피펫 팁 끝을 캡; 그렇지 않으면 T 스토퍼를 제거하고 바이알 A. F-스토퍼를 제거하고 바이알 B를 다시 연결합니다.

3. 차가운 파리를 움직이지 못하게 하는 것

1. 사용하기 전에 -20°C 의 냉동고에 단단한 재자유 얼음팩을 보관하십시오.
2. 20 분 동안 실온 (RT)에서 차갑고 단단한 아이스 팩을 놓습니다. 의료 거즈는 다음 비행 냉각에서 재사용할 수 있습니다. 동시에, 분쇄 된 얼음에 빈 유리병을 냉각.
3. 차가운 빈 유리병 (CEV)에 고정 될 필요가 성인 파리를 전송합니다. 두 개의 이송 바이알이 분리되면 CEV를 페트리 접시 나 플러그로 덮고 CEV를 분쇄 된 얼음에 밀어 떨어 뜨려 CEV의 모든 파리를 바닥까지 누릅니다. 모든 파리가 움직이지 않게 될 때까지 이 과정을 여러 번 반복합니다. 파리는 30s 이내에 고정됩니다. 다음으로 CEV를 얼음에 1분 간 놓습니다. 마취를 위해 한 번에 너무 많은 파리를 옮기는 것은 바람직하지 않습니다.
4. 차가운 파리를 얼음 팩을 덮는 의료 거즈에 붓습니다. 페인트 브러시로 겹치는 파리를 펼치고 각 파리가 아이스팩의 차가운 표면에 의해 냉각될 수 있는지 확인합니다. 차가운 단단한 아이스팩이 약간 부풀어 오면 수건위에 놓고 평평한 면에 놓습니다.
5. 스테레오 현미경에서 무대 클립을 제거하고 플라스틱 필름으로 무대를 덮고 아이스 팩을 무대에 놓습니다. 상단 조명을 켜고 (차가운 광원이 바람직하다), 입체 현미경을 집중하고 차가운 파리가 명확하게 볼 수 있을 때까지 아이스 팩을 이동합니다.

4. 계산, 분류 또는 폐기를 위해 성인 파리를 죽이는 행위

1. 성인이 빈 유리병으로 파리를 옮기고 페트리 접시로 덮습니다.
2. 바이알을 뒤집어 전자 레인지에 1 분 + 20 초 동안 가열하고 죽은 파리가 페트리 접시에 떨어 지게합니다.
3. 보호 작업 장갑을 착용하고 전자 레인지에서 유리병을 꺼냅니다. 죽은 파리를 백서 카드에 붓고, 입체 현미경으로 미세 한 바늘로 파리를 계산하거나 검사하고 관찰 후 쓰레기통에 플라이 시체를 폐기하십시오.
4. 원치 않는 파리를 죽이려면 전자 레인지에서 파리를 2-3 분 동안 가열 한 다음 시체를 쓰레기통에 두릅니다.
   참고: 날개가 야생 형 파리에서 볼 수있는 복부의 끝을 넘어 확장하는 경우 시체에서 판단하기 어렵기 때문에 검사를 위해 일부 날개 돌연변이 균주 (예 : 날개 길이 돌연변이)를 죽이는 것은 바람직하지 않습니다.

5. 병 모양의 달걀 수집 케이지에서 파리를 입 /내로 옮기

참고: 위에서 언급했듯이, T-및 F-스토퍼는 달걀 수집 케이지안팎으로 파리를 이송하는 데 사용됩니다. 파리는 이 과정을 통해 마취될 필요가 없습니다. 사과 주스 배지, 계란 수집 및 디코리오니화 를 준비하는 등의 기타 세부 사항은 문헌^12에서확인할 수 있다.

1. 계란 수집 케이지를 사과 주스 플레이트에 넣거나 사과 주스 플레이트를 청량 음료 병으로 만든 케이지에 장착합니다. 파라핀 필름 스트립으로 두 구성 요소 주위의 관절을 밀봉합니다.
2. 가능한 한 많은 파리를 케이지에 넣고 파리를 옮김 을 옮김으로 케이지에 다시 연결합니다.
3. 케이지에서 파리의 음식을 변경하려면 케이지에 있는 파리를 빈 유리병으로 옮니다.
4. 사과 주스 플레이트를 교체하고 다시 밀봉 한 다음 유리병에서 케이지로 파리를 옮김을 옮김하십시오.
5. 계란 수집이 끝나면 파리를 빈 유리병으로 옮기고 배양 바이알로 옮긴다.

6. 유리 문화 유리 병 청소

참고: 일반적으로, 오래된 문화 유리병은 살아있는 파리를 포함합니다. 여기에 설명된 프로토콜에서, 이 파리들은 트랜스제닉 파리가 아니라면 세척 전에 죽일 필요가 없다.

1. 젖은 스테인레스 스틸 스폰지로 유리 배양 바이알에서 영구 마커 잉크를 제거합니다.
2. 흐르는 물에 배양 바이알을 담그십시오.
   1. 실험실 싱크대에 물을 채우고 액체 식기 세척 비누를 물에 넣고 섞습니다.
   2. 배양 바이알을 물에 담근 다음 플러그를 제거하여 물이 바이알로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다. 물에 있는 접시 세제는 남은 성인 파리가 바닥으로 가라앉고 물에 익사하게 합니다.
   3. 오래된 문화용 바이알을 물에 적어도 30분 동안 담가 둡니다.
3. 드릴의 척을 풀고 테스트 튜브 브러시를 삽입하고 척을 다시 조입니다. 회전 선택기의 방향을 확인하고 드릴이 시계 방향으로 회전하는지 확인합니다. 속도 트리거를 조정하고 최대 속도가 500rpm 미만인지 확인합니다.
4. 배양 바이알을 청소합니다.
   1. 배양 바이알을 대략 청소합니다.
      1. 비 지배적 인 손에 긴 커프 고무 장갑을 놓고 물에서 유리병을 잡습니다.
      2. 무선 튜브 브러시 드라이버를 맨손으로 잡고 브러시를 배양 바이알에 짜내고 방아쇠를 쥐십시오.
         참고: 배터리를 물에 담그지 마십시오. 회전 브러시는 오래된 음식, 번데기 등을 분해하고 폐기물의 95 % 이상을 제거합니다.
      3. 폐기물을 별도의 쓰레기통에 버리기. 각 유리병에 있는 폐기물의 대부분이 청소될 때까지 이 과정을 반복하십시오.
   2. 배양 바이알을 철저히 청소하십시오.
      1. 튜브 브러쉬를 청소하고, 싱크대를 배수하고 청소한 다음 깨끗한 물로 다시 채웁니다.
      2. 섹션 6.4.1에 기재된 바와 같이 각 배양 바이알로부터 잔류폐기물을 제거한다.

결과

T-및 F 스토퍼는 모든 플라이 전송 활동에 적응하고 사용할 수 있는 간단한 도구 세트로 개발되었습니다. 오래된 문화에서 여러 신선한 문화로 파리를 전송하는 것은 신선한 바이알의 플러그를 제거하고, F-스토퍼로 교체한 다음, 오래된 바이알에서 파리를 두드리고, 신속하게 플러그를 제거하고, T 스토퍼로 교체하는 것입니다. 오래된 음식이 컴팩트한 경우 오래된 바이알...

토론

Drosophila 양육 및 실험에 관련 된 기본 활동을 처리 하기 위한 몇 가지 수 제 도구는이 종이에 설명 되어 있습니다. 이러한 도구는 간단하지만 오히려 효과적입니다. 사실상, 모든 실험실은 이러한 도구를 쉽게 만들 수 있으며, 연구 또는 교육 실험실은 아마도 로컬로 사용할 수없는 기성 대안을 찾을 필요가 없습니다.

플라이 전송은 Drosophila 실험에서 가장 일반적?...

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