Ferramentas caseiras simples para lidar com moscas de frutas —Drosophila melanogaster

Resumo

Descrito aqui é o uso de várias ferramentas caseiras para transferir, Chill, e matar a Drosophilaadulta, bem como para limpar frascos de cultura de vidro e coletar ovos. Estas ferramentas são fáceis de fazer e são bastante eficientes no manuseio da Drosophila.

Resumo

A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, é amplamente utilizada tanto na pesquisa biológica quanto na educação em biologia. Manipulação de moscas adultas é comum, mas difícil na prática, como moscas adultas voam. Demonstrado aqui é como fazer algumas ferramentas simples e rentáveis para abordar problemas difíceis no manuseio da Drosophila. Furos em rolhas de espuma são feitas e pontas de pipeta ou funis são inseridos nos furos. As moscas movem-se então somente em uma direção na ponta da pipeta/assemblage do funil, permitindo o controle eficiente da transferência da Drosophila adulta dentro ou fora de um frasco. Protocolos existentes foram modificados para cool-anestesiando moscas por refrigeração em gelo esmagado e transferi-los para uma superfície fria, dura IcePack. O IcePack é coberto com uma parte de gaze médica que mantem moscas imobilizadas da água condensada quando examinado um stereomicroscope. As moscas são finalmente eutanasiado para a contagem e triagem ou descartados por microondulação. Uma gaiola em forma de garrafa também foi desenvolvida para a coleta de ovos, bem como um dispositivo de poupança de mão de obra e protocolo de acompanhamento para frascos de cultura de vidro de limpeza.

Introdução

A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, é um organismo modelo amplamente utilizado na educação biológica de pesquisa e biologia para estudar uma ampla gama de tópicos^1,2. Os problemas básicos de manipulação de Drosophila são a transferência de adultos de frasco para injetáveis e imobilização das moscas para que eles são mais fáceis de manusear, como todos os adultos (exceto para alguns mutantes^3,4) pode voar.

Convencionalmente, um pesquisador transfere moscas de um frasco para outro, segurando dois frascos boca-a-boca, batendo as moscas para baixo ou permitindo moscas para voar em outro frasco, em seguida, separando e reconectando ambos os frascos⁴. Obviamente, isso requer que a abertura de dois frascos com o mesmo diâmetro, e é difícil controlar a quantidade de moscas transferidas. Enquanto isso, isso requer mãos rápidas para conseguir o trabalho feito, e escapar moscas perdidas pode resultar em problemas para o laboratório ou sala de aula. Adicionar moscas virgens extras ou moscas masculinas a uma cruz já preparada é outra tarefa rotineira em experimentos de Drosophila . Convencionalmente, as moscas devem ser imobilizadas no frasco cruzado antes da adição de moscas extra.

A Drosophila adulta é rotineiramente anestesiada por éter, co₂ou refrigeração⁵. Em comparação com a exposição ao éter e ao co₂ , o resfriamento é o agente mais eficiente em termos de custo para imobilizar a Drosophila adulta e o menos prejudicial para as moscas e pesquisadores (especialmente estudantes jovens)^6,7. No entanto, a água que se condensa continuamente sobre a superfície fria ou câmara molha as moscas. É difícil determinar os fenótipos de moscas molhadas, e podem facilmente tornar-se danificados durante a manipulação^8,9. Isso manteve o método de refrigeração de se tornar mais amplamente aceito.

As ferramentas para o transferência da mosca e um método para refrigerar da mosca foram descritas previamente¹⁰. Nisto, uma técnica de refrigeração modificada da anestesia é relatada que é segura, de confiança, e praticável para experimentos de Drosophila . Também descrito neste artigo são 1) métodos para matar adultos para a contagem, triagem, ou descartando, 2) dispositivos e protocolos de poupança de trabalho para a limpeza de frascos de cultura de vidro, e 3) uma gaiola simples para a coleta de ovos. As ferramentas facilmente projetadas e rentáveis descritas aqui podem ser usadas para abordar as difíceis questões de manuseio de mosca, e esses métodos foram testados e são comprovados para serem robustos, confiáveis e fáceis de manusear para pesquisadores experientes e novatos.

Protocolo

1. preparando ferramentas e acessórios

1. Pontas/rolhas de funil
   1. Obter duas fichas de esponja (o diâmetro das fichas deve ser ligeiramente maior do que o diâmetro interno dos frascos utilizados para transferir moscas). Faça um furo nos centros das fichas de esponja com um ferro de solda elétrico aquecido.
   2. Obter duas pontas de pipeta de 1 mL, cortar um ao meio transversalmente com uma faca afiada, e descartar a extremidade pontiaguda. Em seguida, corte 1,5 cm da extremidade pontiaguda da segunda ponta da pipeta. Cole as sobras das duas pontas da pipeta junto com um adesivo para todos os fins para fazer uma ponta de pipeta alongada (Figura 1a).
   3. Insira um funil e a ponta da pipeta alongada nas fichas de esponja para fazer uma rolha de ponta e funil (doravante denominada T-e F-Stoppers) e tampe a ponta da pipeta com um tubo de microcentrífuga de 100 μL (Figura 1a).
      Nota: O comprimento da haste do funil deve ser maior do que a altura da ficha. Se for menor ou igual à altura da ficha, as moscas escaparão da abertura da haste. O fim da haste do funil deve ser situado pelo menos 2 cm acima da superfície do meio de cultura ou do fundo de um frasco vazio. Os funis pequenos (por exemplo, diâmetro do disco < 60 milímetros) com diâmetros internos pequenos da abertura da haste (< 5 milímetros) são preferíveis. Um vidro ou um funil plástico podem ser usados para fazer um F-bujão. Entretanto, os Funis plásticos são preferíveis para classes da biologia, porque quebram menos prontamente do que funis de vidro.
2. Agulhas de microdissecação
   1. Obtenha lápis mecânicos que se sintam confortáveis na mão e nos pinos de insetos que correspondem aos diâmetros (por exemplo, 0,5 mm, 0,7 mm) de seus recargas de chumbo.
   2. Corte as extremidades largas dos pinos do inseto com um par de alicates e arquivo o corte liso. Substitua o chumbo pelos pinos (Figura 1b). Pressione o botão de clique e alimente 0,5 – 1 cm de um pino para realizar uma dissecção. Limpe o pino e empurre-o completamente de volta para o eixo do lápis após uma atividade de dissecção para torná-lo seguro para qualquer pessoa manipular.
      Nota: As agulhas de microdissecação são úteis não somente nas dissecções dos órgãos tais como as glândulas salivares larval mas igualmente em contar e em classificar moscas adultas inoperantes.
3. De duros
   1. Obtenha vários de rígidos recongeláveis (de de grande porte são preferíveis). A Figura 1C mostra um de que funcionaram bem, que mede 26,5 cm x 14,5 cm x 2,5 cm e tem os lados superiores e inferiores que são completamente lisos.
   2. Corte a gaze médica (não estéril) em partes que são ligeiramente menores do que as superfícies frias dos de que cobrem. Por exemplo, um pedaço de gaze médica ligeiramente menor do que 26,5 cm x 14,5 cm é preferível para cobrir um IcePack mostrado na Figura 1C.
      Nota: Os acessórios necessários para estas ferramentas de refrigeração incluem: uma caixa de gelo (nós usamos uma caixa de 25 cm x 15 cm x 15 cm de espuma para uma pessoa e 37 cm x 28 cm x caixa de 20 cm para mais de uma pessoa), que é usado para armazenar gelo esmagado; um par de pinças de ponto fino, que são usados para agarrar moscas refrigeradas por suas asas e transferi-los para um frasco; um par de luvas protetoras do trabalho, que são usadas para tomar de refrigerados fora de um congelador de-20 ° c; e película plástica, que é usada para cobrir o estágio de um stereomicroscope.
4. Gaiola da coleção do ovo de Drosophila
   Nota: Pronto-made Drosophila coleção Egg gaiolas estão disponíveis a partir de muitas empresas de biotecnologia¹¹. Descrito aqui é uma pequena gaiola de coleta de ovos em forma de garrafa acrílica para pratos de Petri de 60 mm (Figura 1D esquerda; o design da gaiola é mostrado no meio). Pode ser adaptado para outros tamanhos do prato de Petri (por exemplo, 100 milímetros, 35 milímetros). Isto permite a transferência de moscas para dentro ou para fora da gaiola com facilidade. Uma gaiola simples pode ser preparada como segue.
   1. Use um cortador de pressão para cortar uma garrafa de bebida plástica macia (500 mL, diâmetro interno ca. 65 mm) em uma proporção aproximada de 2:1 (extremidade pontiaguda: extremidade sem corte) e descarte a extremidade sem corte.
   2. Enrole uma tira de papel de cartão em torno de uma placa de suco de maçã (diâmetro interno 60 mm) com fita adesiva [a placa de suco de maçã é usada para coletar ovos (Figura 1e, à direita)].
5. Excitador sem corda da escova do tubo
   1. Obtenha um driver de broca sem fio (velocidade máxima = 500 rpm).
   2. Obter uma escova de tubo que tem cerdas ao longo de seus lados, bem como a sua frente. Idealmente, o diâmetro da escova deve ser ligeiramente maior do que o diâmetro dos frascos de cultura que precisam ser limpos. Cortar a extremidade da pega para que possa ser inserida na bucha de perfuração (Figura 1D).
      Nota: Os acessórios necessários para estas ferramentas de limpeza incluem esponjas de aço inoxidável e luvas de borracha de manguito longo.

2. transferência de moscas adultas do frasco para injetáveis a para o frasco B

Nota: A transferência de moscas adultas de um frasco para outro é a prática mais comum realizada em experimentos de Drosophila [por exemplo, transferir moscas da cultura antiga (a) para a cultura fresca (b) ou de um frasco cruzado (a) para esvaziar o frasco (b)] para anestesiar. O protocolo aqui descrito pode ser usado para qualquer atividade de transferência de mosca adulta. Salvo indicação em contrário, este protocolo é utilizado para transferir moscas do frasco para injetáveis a para o frasco B ao longo deste papel.

1. Verifique cuidadosamente a haste do funil de uma rolha de F e a ponta da pipeta de uma rolha em T e, em seguida, limpe as moscas que permanecem nas rolhas com um soprador de ar de borracha. Este passo é de suma importância, especialmente quando um conjunto de T-e F-Stoppers é usado para a transferência contínua de diferentes linhas de Drosophila .
2. Bata as moscas no frasco A e substitua a ficha por uma rolha em T e, em seguida, ligue o frasco B com uma rolha F.
3. Inverter o frasco a sobre o frasco para injetáveis B, insira a extremidade da ponta da pipeta da rolha em T na abertura do funil da rolha F, bata a orla do frasco invertido a para permitir que as moscas escapem da ponta da pipeta e através da haste do funil, e deixe cair no frasco B. Se algum alimento velho no frasco A se torna menos compacto, pode cair quando o frasco A é invertido e batido. Em tal situação, inverta o frasco B sobre o frasco a e permita que as moscas rastejem para cima no frasco para injetáveis B.
4. Separe o bujão-T da rolha F. Tampe a extremidade da ponta da pipeta do bujão-T com um tubo de microcentrifugação de 200 μL se as moscas restantes no frasco a necessitar de ser transferidas para outros frascos momentaneamente; caso contrário, retire o bujão em T e reconecte o frasco a. Retire o tampão F e reconecte o frasco B.

3. imobilizando moscas por refrigeração

1. Mantenha os de refreezable duros em um congelador de-20 ° c pelo menos 24 h antes do uso.
2. Coloc um IcePack refrigerado, duro na temperatura ambiente (RT) por 20 minutos. Umedeça ligeiramente uma parte de gaze médica não asséptica com alguma água running e permita que se agarre pròxima à superfície do IcePack. A gaze médica pode ser reutilizada na próxima mosca arrepiante. Ao mesmo tempo, resfrie um frasco vazio em gelo esmagado.
3. Transfira moscas adultas que precisam ser imobilizadas no frasco vazio refrigerado (CEV). Quando os dois frascos de transferência são separados, cubra o CEV com um prato de Petri ou um plugue e bata o CEV de encontro ao gelo esmagado para bater todas as moscas no CEV para baixo à parte inferior. Repita este processo várias vezes até que todas as moscas são imobilizadas. As moscas serão imobilizadas dentro de 30 s. Em seguida, coloque o CEV no gelo por 1 min. Não é aconselhável transferir muitas moscas ao mesmo tempo para anestesiando.
4. Despeje as moscas refrigeradas para fora para a gaze médica que cobre o bloco de gelo. Espalhe para fora as moscas sobrepostas com um pincel e certifique-se de que cada mosca pode ser refrigerada pela superfície fria do IcePack. Se um IcePack duro gelado incha ligeiramente, coloc o em uma toalha e trabalhe-o em seu lado liso.
5. Retire os clipes de palco do estereomicroscópio, cubra o palco com um pedaço de filme plástico, e coloque o IcePack no palco. Gire sobre a luz superior (uma fonte luminosa fria é desejável), focalize o estereomicroscópio e mova o IcePack até que as moscas refrigeradas possam ser vistas claramente.

4. matando moscas adultas para contar, ordenar ou descartar

1. Transfira moscas adultas para um frasco vazio e cubra-a com um prato de Petri.
2. Inverta o frasco para injetáveis, aqueça-o durante 1 min + 20 s num forno de microondas e deixe as moscas mortas cair na placa de Petri.
3. Coloque as luvas de protecção de trabalho e tire o frasco para injetáveis do microondas. Despeje as moscas mortas em um cartão de papel branco, contar ou examinar as moscas com uma agulha de microdissecação um estereomicroscópio, e descartar os corpos de mosca em uma lata de lixo após a observação.
4. Para matar moscas indesejadas, aqueça as moscas por 2 – 3 min em um forno de microondas, em seguida, bata as carcaças em uma lata de lixo.
   Nota: Não é aconselhável matar algumas estirpes mutantes de asa (por exemplo, mutantes de comprimento de asa) para exame, pois é difícil julgar pelas carcaças se as asas se estendem para além da ponta do abdômen, que é visto em moscas do tipo selvagem.

5. transferência voa dentro/fora da gaiola garrafa-dada forma da coleção do ovo

Nota: Como mencionado acima, T-e F-Stoppers são usados para transferir moscas dentro e fora da gaiola de coleta de ovos. As moscas não precisam ser anestesiadas durante todo esse processo. Outros detalhes, como a preparação do meio de suco de maçã, a coleta de ovos e a dechorionização, podem ser encontrados na literatura¹².

1. Insira a gaiola de coleta de ovos na placa de suco de maçã ou monte a placa de suco de maçã para a gaiola feita de um frasco de refrigerante. Selar a junta em torno dos dois componentes com uma tira de película de parafina.
2. Coloque o maior número possível de moscas na gaiola e reconecte a gaiola com uma rolha de espuma após a transferência das moscas.
3. Para mudar o alimento para moscas na gaiola, transfira as moscas na gaiola para um frasco vazio.
4. Substitua a placa de sumo de maçã e reseal-lo, em seguida, transferir as moscas do frasco de volta para a gaiola.
5. Quando a coleta de ovos termina, transfira as moscas para um frasco vazio e transfira-as para frascos de cultura.

6. frascos da cultura do vidro da limpeza

Nota: Geralmente, um frasco de cultura velho contém moscas ao vivo. No protocolo descrito aqui, essas moscas não precisam ser mortas antes da limpeza, a menos que sejam moscas transgênicas.

1. Remova toda a tinta permanente do marcador dos frascos de vidro da cultura com as esponjas molhadas, do aço inoxidável.
2. Mergulhe os frascos de cultura em água corrente.
   1. Encha um dissipador do laboratório com água, adicione o sabão líquido da lavagem de louça na água, e misture-o.
   2. Mergulhe os frascos de cultura na água, em seguida, retire a ficha, permitindo que a água para correr para o frasco. O detergente do prato na água fará todo o adulto restante voa afundar-se à parte inferior e afogar-se na água.
   3. Mergulhe os frascos velhos da cultura na água por pelo menos 30 minutos.
3. Afrouxe o mandril da broca, insira a escova do tubo de ensaio e volte a apertar o mandril. Verifique a direção do seletor de rotação e certifique-se de que a broca gira no sentido horário. Ajuste o gatilho de velocidade e assegure-se de que a velocidade máxima seja inferior a 500 rpm.
4. Limpe os frascos de cultura.
   1. Limpe os frascos de cultura aproximadamente.
      1. Coloque uma luva de borracha de manguito longo na mão não dominante e segure o frasco na água.
      2. Segure o driver da escova do tubo sem fio com a mão dominante nua, aperte a escova no frasco de cultura, e aperte o gatilho.
         Nota: Não mergulhe a bateria na água. A escova rotativa vai quebrar o alimento velho, pupa, etc, e remover mais de 95% dos resíduos.
      3. Despejar os resíduos em uma lata de lixo separada. Repita este processo até que a maioria dos resíduos em cada frasco tenha sido limpo.
   2. Limpe os frascos de cultura completamente.
      1. Limpe a escova do tubo, escorra e limpe o dissipador, e encha-o com água limpa.
      2. Retire os resíduos restantes de cada frasco para injetáveis de cultura, conforme descrito na secção 6.4.1.

Resultados

As rolhas T e F foram desenvolvidas como um conjunto de ferramentas simples que podem ser adaptadas e utilizadas em qualquer atividade de transferência de mosca. A transferência de moscas de uma cultura antiga em várias culturas frescas envolve a remoção dos plugues dos frascos frescos, substituindo-os por F-rolhas, em seguida, batendo as moscas no frasco velho, removendo rapidamente o plugue, e substituindo-o por um T-rolha. Se o alimento velho é compacto, a seguir é importante la...

Discussão

Algumas ferramentas caseiras para lidar com atividades básicas envolvidas na criação e experimentação de Drosophila são descritas neste artigo. Estas ferramentas são simples, mas bastante eficaz. Virtualmente, qualquer laboratório pode fazer essas ferramentas com facilidade, e uma pesquisa ou um laboratório de ensino não precisa encontrar uma alternativa pronta que talvez não esteja disponível localmente.

Fly transferência é a prática mais comum e uma tarefa difícil em...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
a pair of pliers
cordless drill driver			max speed: 500 rpm
electric soldering iron
file
funnel			diameter of disk<60mm
ice box
insect pins
infrared thermometer			HCIYET HT-830
long cuff rubber gloves
mechanical pencils
medical gauze
microcentrifuge tube			100 ul
microwave oven
Parafilm
peri dish			internal diameter 60 mm
pipette tips			1 ml
plastic film
plastic peri dish			Φ36 mm used to cover the empty vial
point tweezers
protective work gloves
re-freezable hard icepacks			26.5×14.5×2.5 cm or larger
rubber air blower
snap cutter
soft drink bottle			500 ml, internal diameter c.a. 65 mm
sponge stopper
stainless steel sponges
tube brush
vial			Φ34 mm × 90 mm