Generación de organoides tumorales a partir de modelos de ratón de ingeniería genética del cáncer de próstata

Resumen

Mostramos un método para la necropsia y la disección de modelos de cáncer de próstata de ratón, centrándose en la disección tumoral de próstata. También se presenta un protocolo paso a paso para la generación de organoides tumorales de próstata de ratón.

Resumen

Los métodos basados en la recombinación homóloga para modificar genes han ido avanzando significativamente en la investigación biológica. Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEMM) son un método riguroso para estudiar el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. Nuestro laboratorio ha desarrollado varios GEMMs de cáncer de próstata (PCa) que carecen de la expresión de uno o múltiples genes supresores de tumores utilizando el sistema de recombinas Cre-loxP específico del sitio y un promotor específico de la próstata. En este artículo, describimos nuestro método para la necropsia de estos GEM DeP PCa, centrándose principalmente en la disección de tumores de próstata de ratón. Los nuevos métodos desarrollados en la última década han facilitado el cultivo de células derivadas del epitelial para modelar sistemas de órganos in vitro en tres dimensiones. También detallamos un método de cultivo celular 3D para generar organoides tumorales a partir de GemM PCa de ratón. La investigación preclínica del cáncer ha estado dominada por el cultivo celular 2D y los modelos de xenoinjertos derivados de la línea celular o derivados del paciente. Estos métodos carecen de microambiente tumoral, una limitación del uso de estas técnicas en estudios preclínicos. Los GEMM son más fisiológicamente relevantes para entender la tumorigenesis y la progresión del cáncer. El cultivo organoide tumoral es un sistema modelo in vitro que recapitula la arquitectura tumoral y las características del linaje celular. Además, los métodos de cultivo celular 3D permiten el crecimiento de células normales para la comparación con los cultivos celulares tumorales, rara vez es posible utilizando técnicas de cultivo de células 2D. En combinación, el uso de GEMMs y cultivo de células 3D en estudios preclínicos tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la biología del cáncer.

Introducción

Desde finales de la década de 1980, la capacidad de alterar genes mediante la recombinación homóloga ha avanzado en gran medida el estudio de los sistemas biológicos¹. Los sistemas promotores inducibles, tisulares o celulares específicos y las recombinaciones específicas del sitio, como Cre-loxP, tienen estudios genéticos avanzados al facilitar el control de las modificaciones genéticas tanto temporal como espacialmente^{2,3, 4}. La combinación de estas estrategias genéticasha creado una amplia gama de sistemas de modelos experimentales 5,^6,7.

Los modelos de ratón de ingeniería genética (GEM) son una herramienta integral para evaluar cómo los genes individuales o grupos de genes afectan el desarrollo y la enfermedad de los mamíferos. En la investigación preclínica del cáncer, los GEMM son el método más fisiológicamente relevante y riguroso para estudiar el desarrollo, progresión y tratamiento del cáncer^8. Nuestro laboratorio se especializa en la generación y caracterización de GEM DeNado sin cáncer.

El cáncer no cutáneo más altamente diagnosticado entre los hombres en los Estados Unidos es el cáncer de próstata (PCa). La mayoría de los pacientes con PCa tienen enfermedad de bajo riesgo y alta probabilidad de supervivencia, pero las tasas de supervivencia disminuyen drásticamente cuando la enfermedad se diagnostica en etapas avanzadas o si la terapia hormonal dirigida induce la progresión a la PCa agresiva y no curable subtipos^9,10. Nuestro laboratorio ha desarrollado GEMMs que utilizan alelos floxed de uno o más genes supresores de tumores. La recombinación y la pérdida de la expresión génica supresora tumoral se produce específicamente en la próstata porque hemos introducido un transgén con Cre recombinase aguas abajo del promotor probasin activado sólo en las células epiteliales de próstata^{11, 12}. También hemos criado nuestros GEMMs para contener un transgén de reportero Cre llamado mT/mG, que induce la expresión de proteína fluorescente de tomate en células que carecen de Cre y proteína fluorescente verde (GFP) expresión en células con Cre¹³. Si bien la presentación de este método y nuestros resultados representativos muestran GEMMs que estudiamos en nuestro laboratorio, este protocolo se puede utilizar para generar organoides de cáncer de próstata a partir de cualquier modelo de ratón. Sin embargo, como se discutió en detalle en nuestra sección de resultados representativos, hemos observado que ciertas características tumorales son óptimas para la generación de organoides de cáncer de próstata.

En la última década, nuevos métodos de cultivo de células de tejidos de origen epitelial han dado lugar a avances significativos en nuestra capacidad de modelar sistemas de órganos in vitro^14,15. El término "cultivo celular 3D" se ha atribuido a las técnicas involucradas en el establecimiento y mantenimiento de organoides, que generalmente pueden definirse como estructuras compuestas por células que ensamblan arquitectura secundaria impulsada por el linaje celular específico de órganos características¹⁶. Estos nuevos métodos son distintos del cultivo celular 2D clásico en que las células no requieren transformación o inmortalización para el crecimiento a largo plazo; por lo tanto, los cultivos 3D de células normales se pueden comparar con las células enfermas. Esto es particularmente valioso en la investigación del cáncer donde los cultivos normales de control celular no han estado típicamente disponibles. Además, los organoides forman espontáneamente arquitecturas de tejidos secundarios con tipos celulares adecuadamente diferenciados, lo que los convierte en un mejor sistema modelo para entender el cáncer in vitro que las líneas celulares 2D^17. Nuestro laboratorio ha creado líneas organoides 3D a partir de problemas tumorales aislados de nuestros GemM PCa para complementar nuestros datos in vivo y realizar experimentos que no serían factibles en GEMMs.

En este artículo, presentamos protocolos escritos y visuales para la necropsia completa de los GEM DeP PCa, incluyendo la disección de diferentes lóbulos de la próstata del ratón y lesiones metastásicas. Describimos y mostramos un método paso a paso para generar organoides a partir de tumores de próstata de ratón basado en un protocolo publicado previamente por Drost et al. para derivar organoides del tejido epitelial de próstata de ratón normal¹⁸.

Protocolo

Los procedimientos animales descritos aquí se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Departamento de Recursos Animales de Laboratorio, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, Nueva York.

NOTA: Los ratones machos que se diseccionen para aislar la próstata o los tumores de próstata durante la generación de organoides deben haber alcanzado al menos la edad de madurez sexual, aproximadamente 8-10 semanas de edad. Las edades específicas de los ratones pueden variar entre los estudios. Algunos factores a tener en cuenta al elegir la edad incluyen cambios dependientes de la edad en la población de células de próstata, expresión dependiente de la edad de Cre transgenes específicos impulsados por el promotor, y la tasa de progresión del tumor de próstata en un GEMM en particular.

1. Disección e imágenes de tumor de ratón y tumores metastásicos

1. Preparaciones
   1. Obtenga las herramientas de disección estériles necesarias. Zona de disección de etapa en una superficie estéril limpia con una regla de 15 cm, equilibrio de precisión, equilibrio analítico, botella de pulverización con 70% etanol, solución salina fosfo-buffered (PBS) y toallas de papel.
   2. Preparación de soluciones fijativas para órganos viscerales y huesos que no se utilizarán para la generación de organoides
      1. Para órganos viscerales: Preparar 4% paraformaldehyde (PFA) en PBS. Para un ratón, hacer 20 mL de 4% PFA, alícuota en dos tubos cónicos de 15 ml y mantener a temperatura ambiente hasta su uso.
      2. Para huesos largos: Aliquot 10 mL de formalina tamponada (NBF) prefabricada 10% neutra en un tubo cónico de 15 ml y mantener a temperatura ambiente hasta su uso.
   3. Obtener platos de 10 cm sin tratar y llenar con PBS no estéril - estos servirán como recipientes temporales para los órganos durante la disección fina utilizando un microscopio de disección.
      NOTA: Las herramientas estériles se utilizan para diselar tejidos para generar organoides. Las herramientas no estériles se utilizan para la incisión inicial y la disección de las extremidades posteriores.
2. Eutanasia e incisión inicial
   1. Euthanizar el ratón mediante asfixia de CO₂ utilizando un caudal de 2,0 L/min durante 5 min. Retire el ratón de la jaula y realice la luxación cervical. Utilice la balanza de precisión para medir el peso corporal y el registro del ratón.
   2. Coloque el ratón encima de una toalla de papel y oriente sobre el lado ventral de la superficie de la disección hacia arriba con la cabeza del ratón mirando lejos del investigador. Fije el ratón al tablero estirando sus extremidades y perforando cada una de las patas delanteras y traseras con una aguja desechable.
   3. Con una botella de spray, douse el pelaje del ratón con 70% de etanol. Usando tijeras de disección no estériles y fórceps rectos, pellizca justo encima del pene del ratón y haz una pequeña incisión a través del pelaje solamente.
   4. Continúe la línea media de la incisión hasta el cuello del ratón a través del pelaje solamente. Realice incisiones bilaterales desde el punto de la incisión inicial a través del plano ventral del ratón a través del pelaje solamente.
   5. Sujete el pelaje y tire con cuidado de la piel del ratón. Anclar el pelaje a la tabla para permitir el acceso a las cavidades abdominal y torácica.
3. Extracción del sistema urogenital masculino en bloque
   1. Usando tijeras de disección estériles y fórceps rectos, corte cuidadosamente a través de la piel unos 0,75 cm por encima del recto. Continúe la línea media de la incisión hasta la caja torácica sin alterar ningún órgano de la cavidad abdominal. Tire con cuidado de la piel y ancle a la tabla para exponer toda la cavidad abdominal.
      NOTA: No permita que estos instrumentos toquen el exterior del ratón o cualquier superficie en el área de ensayo, ya que estos tejidos se utilizarán para generar organoides.
   2. Diseccionar el sistema urogenital y otros órganos de acuerdo con el diagrama de la Figura 1A,con números que indican el orden en que los órganos se extraerán del ratón.
   3. Encuentra la vejiga, luego agarra la almohadilla de grasa hacia la izquierda o la derecha y tira hacia arriba para exponer el testículo. Diseccionar cuidadosamente el testículo del resto de la región urogenital y dejar a un lado. Haga el mismo procedimiento en el otro lado.
      NOTA: Para lograr la calidad óptima del tejido y la caracterización detallada de los tumores de próstata es necesario extraer toda la región urogenital del ratón en el bloque^19. Se recomienda extirpar primero la región urogenital (Figura1A).
   4. Sujete la vejiga y tire cuidadosamente hacia arriba para que la región urogenital se levante, exponiendo la uretra debajo. Mientras sostiene la vejiga, oriente las tijeras para que estén contra la parte inferior de la próstata dorsal y corte la uretra. Toda la región urogenital se liberará de la cavidad abdominal.
   5. Ponga la región urogenital en un plato de 10 cm lleno de PBS. Si aún está lleno de orina, drene la vejiga haciendo una pequeña incisión. Usando la balanza analítica, sopesar el sistema urogenital y registrar.
4. Extracción de ganglios linfáticos pélvicos, bazo, hígado, riñón, pulmón, tibia y fémur
   1. La extracción del sistema urogenital expone los ganglios linfáticos pélvicos, situados justo detrás del sistema urogenital (Figura1A) y a ambos lados de la columna vertebral. Los ganglios linfáticos solo serán visibles si contienen lesiones metastásicas o si hay inflamación local. Orienta los fórceps rectos debajo del ganglio linfático y tira hacia arriba para extirpar el ganglio linfático. Haga el mismo procedimiento en el otro lado.
   2. Agarre el recto con los fórceps rectos y corte. Tire del recto para desentrañar todo el colon y el intestino delgado, buscando lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos mesentéricos. Cuando se extraiga todo el íleon, continúe tirando del duodeno para exponer el estómago. Cortar el esófago para extraer completamente el estómago y desechar. Si se observan lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos, diseccione cuidadosamente del intestino y guárdela en un plato de 10 cm de PBS.
   3. Exponer y extirpar el estómago tirará del bazo del lado dorsal del abdomen (Figura1A). Retire el bazo y colóquelo en un 4% de PFA. El bazo sirve como un control de tinción para la hemotoxina, ya que es altamente celular.
      NOTA: Los tejidos viscerales que no se utilizarán para la generación de organoides se fijarán durante la noche en 4% de PFA, se lavarán con PBS y luego se colocarán en un 70 % de etanol.
   4. Retire el hígado en la parte superior del abdomen (Figura1A). Basado en la carga metastásica en el hígado, los lóbulos individuales se pueden diseccionar, o todo el hígado se puede eliminar cortando cuidadosamente a lo largo del diafragma. (No corte el diafragma en este momento). Coloque el hígado en un plato de 10 cm de PBS.
   5. Extracción del hígado expondrá completamente los riñones a ambos lados de la columna vertebral (Figura1A). Extrae los riñones, junto con los ganglios linfáticos renales, si los ganglios tienen lesiones metastásicas, colocando los fórceps rectos debajo del riñón y tirando hacia arriba. Haga el mismo procedimiento para el otro lado.
   6. Para exponer la cavidad torácica, corte cuidadosamente el diafragma a lo largo de la caja torácica. Perforar el diafragma liberará la presión negativa en la cavidad torácica y expondrá el corazón y los pulmones (Figura1A).
   7. Sujete el esternón y tire hacia arriba para abrir aún más la cavidad torácica. Observe la cara ventral de la cavidad torácica a lo largo de la caja torácica para las lesiones metastásicas en los ganglios linfáticos torácicos y diseccione, si está presente.
   8. Mientras mantiene el esternón, corte la caja torácica ventral para acceder al corazón y a los pulmones. Sujeta el corazón, tira hacia arriba y corta debajo de los pulmones. Para eliminar completamente el corazón y los pulmones en bloque, corte todos los vasos sanguíneos anteriores y la tráquea. Coloque el tejido en PBS y retire cuidadosamente el corazón sin dañar el tejido pulmonar o las lesiones metastásicas pulmonares.
   9. Tome los fórceps rectos no estériles y las tijeras diselantes y corte la pata trasera en la cabeza del fémur. Sujete cuidadosamente el fémur y retire la pata trasera del pelaje.
   10. Coloque la pata trasera sobre una toalla de papel y agarre la pata trasera. Utilice la cuchilla de afeitar de un solo filo para desechar /cortar todo el músculo y el tejido conectivo de la tibia y el fémur. Retire el fémur de la tibia cortando posteriormente a la rótula y retire la tibia quitando la pata trasera. Coloque la tibia y el fémur en un 10% de NBF. Haga el mismo procedimiento en el otro lado.
       NOTA: Para examinar los huesos largos del ratón en busca de lesiones metastásicas, el peroné no necesita estar intacto. Los huesos largos se fijarán en 10% NBF durante una semana, luego se descalcificarán utilizando la solución edástina neutra²⁰. Después de tres semanas, los huesos serán transferidos al 70% de etanol.
   11. Después de extraer las extremidades posteriores, tome un corte de oído o cola para el genotipado futuro. Deseche la carcasa del ratón y todo el tejido que no se fije ni se utilice para la generación de organoides.
5. Disección del tumor de próstata
   NOTA: La disección de los lóbulos de la próstata del ratón sólo se puede lograr con un microscopio de disección^19. Sin embargo, la carga del tumor de próstata puede ser tan alta que los lóbulos individuales no se pueden distinguir, y la disección se puede llevar a cabo sin un microscopio. Sin embargo, el protocolo completo para la disección de los lóbulos de próstata individuales se describe a continuación.
   1. Coloque la región urogenital en un plato de 10 cm de PBS bajo un microscopio de disección y oriente el lado ventral hacia arriba con la vejiga y las vesículas seminales mirando hacia fuera del investigador. Toda manipulación de la región urogenital debe hacerse utilizando instrumentos estériles.
   2. Evaluar el fenotipo general del tumor de próstata- muy probablemente, ya sea un tumor lleno de líquido o sólido se observará en Los GEM PCa (Figura2A, B).
      NOTA: Los tumores llenos de líquido a menudo se encuentran en la región de la próstata anterior (Figura2A). Los tumores llenos de líquido se componen principalmente de tejido conectivo con componentes epiteliales escasos, por lo que estos tumores no son óptimos para la generación de organoides debido al bajo número de células epiteliales tumorales, como se discutirá en los resultados representativos Sección.
   3. Si hay tumores llenos de líquido, haz un pequeño agujero en el tumor. Coloque la región urogenital en un nuevo plato de 10 cm de PBS.
   4. Tome un par de fórceps rectos en la mano no dominante y fórceps curvos en la mano dominante. Voltee la región urogenital a su cara dorsal. Busque la región prostática proximal (Figura1B), que puede ser identificada por el color rosa/rojo de la uretra. Sujete la uretra y sosténgalo firmemente para manipular el tejido urogenital con los fórceps curvos.
      NOTA: Durante la disección de próstata, siempre tome nota de la ubicación de la vejiga, ya que esta es la forma más sencilla de localizar los lóbulos de la próstata individuales (Figura1B).
6. Extirpación del tejido no prostático de la región urogenital
   1. Mientras esté en la cara dorsal de la región urogenital, encuentre la base de la vesícula seminal. Retire con cuidado la vesícula semina y deseche. Realice el mismo procedimiento en el lado opuesto.
      NOTA: Evite puncturizar la vesícula seminal, ya que liberará líquido secretor pegajoso y opaco que interfiere con la disección de próstata. Si la vesícula seminal está perforada, transfiera la región urogenital restante a un plato nuevo de 10 cm con PBS fresco.
   2. Retire y deseche el vasa deferente y tanto tejido graso y conectivo como sea posible utilizando el lado curvo de los fórceps.
   3. Mientras mantiene firmemente la región de la uretra/prostataria proximal, utilice un par de tijeras finas y puntiagudas para extraer la vejiga de la uretra.
7. Aislamiento de los lóbulos de próstata individuales
   1. Localice la próstata anterior (Figura1B). Asegúrese de mantener firmemente la región de la próstata proximal/uretra con los fórceps rectos. Retire la región prostática anterior agarrando directamente el tejido con el lado curvo de los fórceps y tirando firmemente de la vejiga y el resto de la próstata. Coloque el tejido en PBS.
      NOTA: Para todas las regiones prostáticas, es posible que se requieran tijeras disefantes para extraer el tejido, dependiendo del tamaño del tumor.
   2. Localice la región de la próstata ventral (Figura1B). Retire la región de la próstata ventral de la misma manera que en el paso 1.5.7.
   3. En este punto de la disección, sólo las regiones de próstata lateral y dorsal deben estar presentes, mientras que la región de la próstata proximal todavía está siendo agarrada por los fórceps rectos. Evaluar las regiones de próstata lateral y dorsal (Figura1B). Si la región lateral se puede distinguir de la región dorsal, retire la región de próstata lateral como se describe en el paso 1.5.7. Realice el mismo procedimiento en el lado opuesto.
   4. Retire la región de la próstata dorsal como se describe en el paso 1.5.7. Colocar la región prostática proximal en 4% PFA, ya que su estructura dentro del tejido muscular de la uretra hace que no sea adecuado para la generación de organoides.

2. Generación de organoides 3D a partir del tejido tumoral de próstata

NOTA: La Figura 3 muestra una descripción pictórica del procedimiento para la generación de organoides tumorales.

1. Preparación
   1. Preparar medios organoides de próstata de ratón según Drost et al.¹⁸ con las siguientes alteraciones. Utilice un medio acondicionado en lugar de proteínas recombinantes para Noggin y R-Spondin y utilice una concentración final del 1% (v/v), en lugar del 10%, tanto para el medio acondicionado por Noggin como para el medio acondicionado por R-Spondin.
      NOTA: Las células HEK293, transfectó fácilmente con un medio con condición DE Noggin-Fc o Rspo1-Fc con ratón HA, respectivamente. Estas líneas celulares fueron un regalo del Laboratorio Calvin Kuo de la Universidad de Stanford.
   2. Preparar la solución de digestión en un tubo de 15 ml diluyendo 20 mg/ml de colagenasa II con medios avanzados DMEM/F12(+++) a una concentración final de 5 mg/ml. Añadir El inhibidor de roca Y-27632 a la solución de colagenasa II a una concentración final de 10 m.
      NOTA: La relación entre el tampón de digestión y el tejido es de 1 ml a 50 mg, que utilizamos según Drost et al.¹⁸.
2. Picar y digestión del tejido tumoral
   1. En la capucha del cultivo celular, coloque el tejido tumoral de próstata en un plato de cultivo estéril de 10 cm, diseccione y deseche el tejido necrótico.
   2. Mice el tejido tumoral de próstata restante en 1 mm³ cubos sosteniendo las piezas de tejido con los fórceps curvos estériles y cortando con tijeras de disección.
   3. Coloque las piezas tumorales picadas en el tubo de 15 ml con el tampón de digestión recogiéndolas con el lado curvo de los fórceps. Digerir el tejido tumoral a 37 oC con temblordurante de 1,5 a 2 h. Compruebe el progreso de la digestión cada 20 minutos.
      NOTA: En este momento, sacar al menos 2 ml de matriz de -20 oC de almacenamiento y descongelar sobre hielo. 1 mL alícuotas de matriz tomará aproximadamente 3 h para descongelar.
   4. Después de la digestión del tejido, tubo centrífugo a 175 x g durante 5 min a 4 oC para formar un pellet celular.
   5. Retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet celular y resuspenda el pellet celular en 1 ml de trippsina precalentada suplementada con 10 M De y-27632 Inhibidor de roca. Poner el tubo en un baño de agua de 37 oC durante 5 minutos.
   6. Después de la incubación, pipeta hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una punta P1000 estándar. Vuelva a bañar el tubo a 37 oC durante otros 5 minutos y repita el paso 2.2.6.
      NOTA: En este momento en el procedimiento, calentar un plato de cultivo de células estéril de 6 pozos poniéndolo en una incubadora de 55 oC.
3. Contar células y resuspensión en matriz
   1. Lavar las células añadiendo 9 ml de AdDMEM/F12(+++) frío y centrifugar el tubo a 175 x g durante 5 min a 4 oC.
   2. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet y lave las células de nuevo añadiendo 10 ml de AdDMEM/F12 frío (+++). Centrifugar el tubo a 175 x g durante 5 min a 4oC.
   3. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet, resuspenda las células en 1 ml de AdDMEM/F12(+++), y cuente el número de células usando un hemocitómetro de acuerdo con el procedimiento estándar.
   4. Siete a ocho cúpulas caben en un pozo de un plato de 6 pozos cuando los organoides están chapados en matriz a través de una manera de gota. Aproximadamente 200 l de matriz producirán 7-8 cúpulas. Decida cuántos pozos de organoides se necesitan para propósitos experimentales futuros y calcule el volumen de matriz requerido. A continuación, calcule el volumen de solución que contiene celdas necesario para tener una concentración final de 1,0 x 10⁶ celdas/ml de matriz.
   5. Después de contar las células, centrífuga a 175 x g durante 5 min a 4 oC. Retire el sobrenadante, deslice el tubo para aflojar el pellet y vuelva a suspender las células en volumen de matriz calculado en el paso 2.3.4.
      NOTA: La matriz permanece en forma líquida sólo a 4 oC; mantener los tubos de matriz y las soluciones de células de matriz en el hielo en todo momento.
4. Cúpulas de matriz de chapado y aplicación de medios
   1. Mezcle la solución de células de matriz con un pipeta P200 para distribuir uniformemente las células sin introducir burbujas. Retire el plato de cultivo de 6 pozos de la incubadora de 55 oC.
   2. Pipetear cuidadosamente 200 l de solución de célula solución de matriz y soltar rápidamente la solución en un pozo para crear cúpulas.
   3. Repita el paso 2.4.2. hasta que se gaste el volumen de la solución de células de matriz. Deje que las cúpulas se solidifiquen a temperatura ambiente durante 2 min.
   4. Voltee el plato de 6 pozos al revés y coloque el plato en una incubadora de 37 oC para continuar la solidificación durante 20 minutos.
   5. Después de la incubación, añadir 2 ml de medios organoides de próstata de ratón a cada poca. Añadir andrógeno sintético R1881 a cada pocal para una concentración final de 1 nM e Inhibidor de roca Y-27632 a una concentración final de 10 m. Mezcle cuidadosamente y coloque la placa en una incubadora de 37 oC para el cultivo.
      NOTA: Los medios de cultivo organoides deben complementarse con un inhibidor de roca Y-27632 de 10 M durante solo 1 semana después de la generación de organoides.

Resultados

Las imágenes representativas de la necropsia de un ratón con un gran tumor de próstata primario lleno de líquido en la región anterior de la próstata se muestran en la Figura 2A. Por el contrario, la Figura 2B,muestra imágenes representativas de la necropsia de un ratón con un tumor de próstata primario sólido grande para el que las regiones de próstata individuales son indistinguibles. Las imágenes de disección flu...

Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo para la disección tumoral de próstata y la generación de organoides
La extirpación del tejido no prostático y la disección fina del tumor prostático del ratón es crucial para la generación óptima de organoides cancerosos, ya que tanto las células epiteliales no prostáticas como las células epiteliales normales de próstata generarán organoides. Para los tumores de próstata sólidos específicamente, es crucial aislar áreas de tumor viable para elimi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles	Becton Dickinson	Z192430
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
Analytical balance	Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Dissecting Board	Thermo-Fisher	36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10	Manufactured by Trevigen	Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory	Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutamine (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetyl-L-Cysteine	Sigma	A9165
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Precision balance	Mettler Toledo	30216561
Scalpel #23	World Precision Instruments	504176
Scalpel Handle #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Single-edge carbon razor blade	Fisherbrand	12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight	World Precision Instruments	14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated	World Precision Instruments	15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (Rock Inhibitor)	APExBIO	A3008