Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Özet

Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.

Özet

Genleri değiştirmek için Homolog rekombinasyon dayalı Yöntemler önemli ölçüde biyolojik araştırma ilerletti. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri (GEMMs) memeli gelişimi ve hastalığı okumak için titiz bir yöntemdir. Laboratuvarımız, siteye özel CRE-loxP Rekombinaz sistemi ve prostat spesifik promotör kullanılarak bir veya birden fazla tümör bastırıcı genlerin ifadesinin bulunmadığı prostat kanseri (PCa) çeşitli GEMMs geliştirdi. Bu yazıda, öncelikle fare prostat tümörlerinin diseksiyonu üzerinde duruluyor, bu PCA gemms otopsi için yöntemi açıklanmaktadır. Son on yıl içinde geliştirilen yeni yöntemler, üç boyutta organ sistemlerine model olarak epitelyal türev hücrelerin kültürünü kolaylaştırmış durumdadır. Biz de detay bir 3D hücre kültürü yöntemi fare PCa GEMMs tümör organoids oluşturmak için. Klinik öncesi kanser araştırması 2B hücre kültürü ve hücre çizgisinin türetildiği veya hasta tarafından türetilen xenograft modellerinin hakimiyetindedir. Bu yöntemler tümör mikroçevre eksikliği, klinik öncesi çalışmalarda bu teknikleri kullanarak bir sınırlama. GEMMs daha fizyolojik-tümör ve kanser ilerlemesini anlamak için ilgilidir. Tümör nevuslardır kültürü, tümör mimarisini ve hücre soy özelliklerini tekrar eden bir in vitro model sistemidir. Ayrıca, 3D hücre kültürü yöntemleri tümör hücresi kültürlerine kıyasla normal hücrelerin büyümesini sağlar, 2D hücre kültürü tekniklerini kullanarak nadiren mümkündür. Kombinasyon halinde, ön klinik çalışmalarda GEMMs ve 3D hücre kültürünün kullanımı kanser biyolojisi anlayışımızı iyileştirmek için potansiyele sahiptir.

Giriş

1980 ' lerin sonlarında, Homolog rekombinasyon tarafından genler değiştirmek için yeteneği büyük ölçüde biyolojik sistemlerin çalışma Gelişmiş¹. İndüklenebilir, doku veya hücreye özgü promotor sistemleri ve CRE-loxp gibi siteye özgü rekombinazlar, hem geçici olarak hem de uzamsal olarak^2,3, genetik modifikasyonlar üzerinde kontrol kolaylaştırarak genetik çalışmalar gelişmiş ⁴' ü yapın. Bu genetik stratejilerin kombinasyonu deneysel model sistemleri^5,6,7geniş bir dizi yarattı.

Genetik olarak tasarlanan fare modelleri (GEMMs), bireysel genler veya genler gruplarının memelin gelişimini ve hastalığı nasıl etkilediğini değerlendirmek için ayrılmaz bir araçtır. Klinik öncesi kanser araştırmalarında, GEMMs kanser gelişimi, progresyon ve tedavi⁸' i incelemek için en fizyolojik olarak alakalı ve titiz bir yöntemdir. Bizim laboratuar üreten ve kanser GEMMs karakterize uzmanlaşmıştır.

Amerika Birleşik Devletleri 'nde erkekler arasında en yüksek tanısı olmayan kutanöz kanser prostat kanseri (PCa). PCa olan hastaların çoğunluğu düşük riskli hastalık ve yüksek hayatta kalma olasılığı vardır, ancak hastalık ileri aşamalarında teşhis edildiğinde ya da hedeflenen hormonal tedavi agresif, non-tedavi edilemez PCa ilerlemesi indükler ise hayatta kalma oranları büyük ölçüde düşüş alt türler^9,10. Laboratuvarımız bir veya daha fazla tümör bastırıcı genlerin floxed alleni kullanan GEMMs geliştirdi. Yeniden kombinasyon ve tümör bastırıcı gen ifade kaybı özellikle prostat oluşur çünkü biz CRE Rekombinaz aşağı aşağı probasin organizatör ile bir transgeni tanıtıldı sadece prostat epitelyal hücrelerde aktive^{11, 12}. biz de bir CRE muhabiri transgene MT/mg denilen içeren bizim gemms yetiştirilen var, CRE ve yeşil floresan protein (Gfp) hücre içinde c-¹³Ile hücrelerde eksik hücrelerde domates floresan protein ifadesi indükler. Bu yöntemin sunumu ve temsilcimiz, laboratuvarımızda çalışmamızda GEMMs 'i gösterirken, bu protokol herhangi bir fare modelinden prostat kanseri organoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Ancak, temsili sonuçlar bölümünde ayrıntılı olarak tartışıldığı gibi, bazı tümör özelliklerinin prostat kanseri nevuslardır üretimi için optimum olduğunu gözlemledik.

Son on yıl içinde, epitelyal orijinli dokulardan oluşan yeni kültür hücreleri yöntemleri, org sistemleri içinde vitro^14,15modellik yeteneğimizde önemli gelişmelere yol açmıştır. "3D hücre kültürü" terimi, organoidlerin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan tekniklere atfedilmiştir, bu da genellikle Organ-spesifik hücre sırlarıyla tahrik edilen ikincil mimarisi birleştiren hücrelerden oluşan yapılar olarak tanımlanabilir. özellikleri¹⁶. Bu yeni yöntemler, hücrelerin uzun vadeli büyüme için dönüşüm veya ölümsüzleştirme gerektirmeyen klasik 2D hücre kültüründen farklıdır; Böylece, normal hücrelerin 3D kültürler hastalıklı hücrelere kıyasla olabilir. Bu özellikle normal hücre kontrol kültürlerinin genellikle mevcut olmadığı kanser araştırmalarında değerlidir. Buna ek olarak, organoids kendiliğinden uygun farklılaşan hücre türleri ile ikincil doku mimarileri oluşturmak, onları daha iyi bir model sistemi 2D hücre hatları¹⁷daha kanser anlamak için yapmak. Laboratuvarımız bizim PCA gemms izole tümör sorunu 3D nevuslardır hatları yarattı bizim in vivo veri tamamlamak ve gemms mümkün olmayacaktır deneyler gerçekleştirmek için.

Bu yazıda, farklı fare prostat lobları ve metastatik lezyonların diseksiyonu da dahil olmak üzere PCA gemms tam otopsi için yazılı ve görsel protokoller sunuyoruz. Daha önce Drost ve Al tarafından yayınlanan bir protokol temelinde fare prostat tümörlerinden organoidler oluşturmak için adım adım bir yöntem tarif ve gösteriyoruz. normal fare prostat epitelyal dokusundan organoidler türetmek için¹⁸.

Protokol

Burada açıklanan hayvan prosedürleri, laboratuvar hayvansal kaynaklar bölümü 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıABUC) onayı ile, Roswell Park kapsamlı Kanser Merkezi, Buffalo, New York 'ta yapıldı.

Not: Organoidlerin nesil için Ayrıca birlikte prostat veya prostat tümörlerinin yalıtmak için disseke erkek fareler en az cinsel olgunluk yaşına ulaşmalıdır-yaklaşık 8-10 hafta yaş. Belirli yaş fareleri çalışmalar arasında farklılık gösterebilir. Yaş seçerken göz önünde bulundurulması gereken bazı faktörler arasında, prostat hücresi popülasyonlarında yaşa bağlı değişiklikler, belirli Promoter odaklı CRE transgenlerin yaşa bağımlı ifadesi ve belirli bir GEMM 'de prostat tümörü ilerlemesi bulunmaktadır.

1. fare ProstateTumor ve metastatik tümörler diseksiyon ve görüntüleme

1. Hazırlık
   1. Gerekli steril diseksiyon araçlarını edinin. 15 cm Cetvelli, hassas denge, analitik denge,% 70 etanol ile sprey şişesi, phospho-tamponlu tuzlu (PBS) ve kağıt havlular ile temiz steril yüzeyde sahne diseksiyon alanı.
   2. Nevuslardır nesil için kullanılmamalıdır visseral organlar ve kemikler için fikreatif çözümlerin hazırlanması
      1. Viseral organlar için: PBS 'de% 4 civarında formaldehite (PFA) hazırlayın. Bir fare için,% 4 PFA 20 ml, 2 15 ml konik borular içine kısım yapmak ve kullanım kadar oda sıcaklığında tutun.
      2. Uzun kemikler için: aliquot 10 mL önceden yapılmış 10% nötr tampon formalin (NBF) 1 15 mL konik tüp ve kullanım kadar oda sıcaklığında tutun.
   3. Tedavi edilmeyen 10 cm 'lik yemekleri elde et ve steril olmayan PBS ile doldur-Bunlar, Diseksiyon mikroskobu kullanarak ince diseksiyon sırasında organlar için geçici konteynerler olarak hizmet edecektir.
      Not: Steril aletler organoidler oluşturmak için diseksiyon dokularda kullanılır. Steril olmayan aletler, arka ekstremite ilk kesi ve diseksiyon için kullanılır.
2. Ötenazi ve ilk kesi
   1. 5 dakika boyunca 2,0 L/dk akış hızını kullanarak Co₂ boğulma tarafından fareyi ötenere. kafesten fareyi çıkarın ve servikal dislocation gerçekleştirin. Fare vücut ağırlığı ve kaydını ölçmek için hassas dengesini kullanın.
   2. Bir kağıt havlu üstüne fareyi yerleştirin ve fare kafası araştırmacı uzak bakan ile diseksiyon yüzeyi ventral tarafı yukarı yönlendirmek. Onun ekstremite dışarı uzanan ve bir tek kullanımlık iğne ile forepaws ve arka pençeleri her piercing tarafından tahta için fareyi Affix.
   3. Bir sprey şişesi kullanarak, 70% etanol ile fare kürk ikiye katlar. Non-Steril Diseksiyon makas ve düz forseps kullanarak, fare penisinin hemen üstünde çimdik ve sadece kürk yoluyla küçük bir kesi yapmak.
   4. Sadece kürk yoluyla fare boynuna kesi orta çizgi devam edin. Sadece kürk yoluyla fare ventral düzlemden ilk kesi noktasından bilateral kesikler olun.
   5. Kürkü kavrayın ve dikkatle farenin derisinden çekin. Hem karın hem de torasik boşlukların erişimine izin vermek için kürkü tahta kadar sabitleyin.
3. Erkek ürogenital sistemin en bloktan çıkarılması
   1. Steril Diseksiyon makas ve düz forseps kullanarak, dikkatle rektum üzerinde 0,75 cm hakkında cilt üzerinden kesilmiş. Karın boşluğunda herhangi bir organ rahatsız etmeden göğüs kafesi kadar kesi orta çizgi devam edin. Dikkatle cilt uzağa çekin ve tüm karın boşluğu açığa çıkarmak için tahta pin.
      Not: Bu dokuların organoidler oluşturmak için kullanılacaktır gibi, bu enstrümanlar hazırlama alanında fare veya herhangi bir yüzey dışında dokunmak izin vermez.
   2. Şekil 1A'daki diyagrama göre ürogenital sistem ve diğer organları incelemek, sayılar ile organları fare kaldırılacak sırasını gösteren.
   3. Mesane bulmak, sonra ya sol veya sağ yağ Pad kavramak ve testis ortaya çıkarmak için yukarı çekin. Dikkatle ürogenital bölgenin geri kalanından testis uzaklaştırın ve bir kenara koyun. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın.
      Not: En iyi doku kalitesini elde etmek ve prostat tümörlerinin ayrıntılı tümör karakterizasyonu, tüm ürogenital bölgenin fare en bloku¹⁹' dan kaldırılmasını gerektirir. Ürogenital bölgenin ilk olarak kaldırılması önerilir (Şekil 1A).
   4. Mesane kavramak ve dikkatle böylece ürogenital bölgenin birlikte kaldırma, altında üretra açığa çekin. Mesane tutarak, böylece dorsal prostat alt karşı ve üretra kesme makas yönlendirmek. Tüm ürogenital bölge daha sonra Karın boşluğundan serbest bırakılacak.
   5. Ürogenital bölgeyi PBS ile dolu 10 cm 'lik bir çanak içine koyun. Hala idrar ile dolu ise, küçük bir kesi yaparak mesane drenaj. Analitik denge kullanarak, ürogenital sistem ve kayıt tartmak.
4. Pelvik lenf nodları, dalak, karaciğer, böbrek, akciğer, Tibia ve femur ekstraksiyonu
   1. Ürogenital Sistemin çıkarılması, Ürogenital Sistemin hemen arkasında konumlandırılmış Pelvik lenf nodları ortaya çıkarır (Şekil 1A) ve omurganın her iki tarafında. Lenf nodları sadece metastatik lezyonlar içeriyorsa veya lokal inflamasyon varsa görünür olacaktır. Lenf düğümünün altında düz forseps yönlendirmek ve lenf düğümü kaldırmak için yukarı çekin. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın.
   2. Rektum ile düz forseps ve kesme tutun. Mezenterik lenf nodlarında metastatik lezyonlar arayan, tüm kolon ve ince bağırsak çözmek için rektum çekin. Tüm ileum kaldırıldığında, mide ortaya çıkarmak için duodenum üzerinde çekmeye devam edin. Tamamen mide kaldırmak ve atmak için özofagus kes. Lenf nodlarında metastatik lezyonlar gözlemlenirse, bağırsak ve depolardan 10 cm 'lik bir tabak içinde dikkatlice uzaklaştırın.
   3. Karnının açığa çıkması ve çıkarılması karının dorsal tarafındaki dalağı çekecektir (Şekil 1A). Dalağı çıkarın ve 4% PFA yerleştirin. Dalak, son derece hücresel olduğu için hemotoxylin için bir boyama kontrolü olarak hizmet vermektedir.
      Not: Nevuslardır nesil için kullanılmamalıdır visseral dokularda gece% 4 PFA, PBS ile yıkanmış ve daha sonra% 70 etanol yerleştirilir sabitlenir.
   4. Karın üst kesiminde karaciğeri çıkarın (Şekil 1A). Karaciğer metastatik yük dayanarak, bireysel loblar dissected olabilir, ya da tüm karaciğer dikkatle diyafram boyunca kesme tarafından kaldırılabilir. (Şu anda diyaframı kesmeyin). PBS 10 cm çanak karaciğer yerleştirin.
   5. Karaciğerin çıkarılması, omurganın her iki tarafındaki böbrekleri tamamen açığa çıkarır (Şekil 1A). Böbrekler-böbrek lenf nodları ile birlikte, düğümler metastatik lezyonlar varsa-böbrek altında düz forseps yerleştirerek ve yukarı çekerek. Diğer taraf için aynı prosedürü yapın.
   6. Torasik boşluğu açığa çıkarmak için, ribcage boyunca dikkatle diyaframı keser. Diyaframın delici torasik boşlukta negatif basıncı serbest bırakacaktır ve kalp ve akciğerleri açığa (Şekil 1A).
   7. Sternum tutun ve daha fazla torasik boşluğu açmak için yukarı çekin. Torasik lenf nodlarında metastatik lezyonlar için kaburga kafesi boyunca torasik boşluğun ventral yüzüne dikkat edin ve varsa, parçala.
   8. Hala sternum tutarak, kalp ve akciğerleri erişmek için ventral kaburga kafesi kesip. Kalbi tutun, yukarı çekin ve akciğerlerin altına kesin. Tam olarak kalp ve akciğerleri kaldırmak için, tüm anterior kan damarlarını ve trakea kesip. Doku PBS yerleştirin ve dikkatle akciğer dokusu veya akciğer metastatik lezyonlara zarar vermeden kalp çıkarın.
   9. Steril olmayan düz forseps ve Diseksiyon makas alın ve femur başında arka bacak kesti. Dikkatle femur kavramak ve kürk arka bacak çıkarın.
   10. Arka bacak bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve arka pençe kavramak. Tek kenarlı jilet kullanın hurda/Tibia ve femur tüm kas ve bağ dokusu uzağa kesti. Patella posterior kesme ve arka pençe kaldırarak Tibia kaldırmak tarafından Tibia femur çıkarın. Tibia ve femur 10% NBF yerleştirin. Diğer tarafta aynı prosedürü yapın.
       Not: Metastatik lezyonlar için fare uzun kemikleri incelemek amacıyla, fibula bozulmamış olması gerekmez. Uzun kemikler, bir hafta boyunca% 10 NBF 'de düzeltilecektir, ardından nötr EDTA çözümü²⁰' yi kullanarak decalcified olacaktır. Üç hafta sonra, kemikler% 70 etanol için transfer edilecektir.
   11. Arka ekstremite çıkardıktan sonra, gelecek Genotipleme için bir kulak veya kuyruk kesme alın. Fare karkas ve tüm doku sabit veya nevuslardır nesil için kullanılan değil atın.
5. Prostat tümörünün diseksiyonu
   Not: Fare prostat lob diseksiyon sadece bir diseksiyon mikroskop kullanılarak elde edilebilir¹⁹. Ancak, prostat tümörü yükü o kadar yüksek olabilir ki, bireysel lob 'lar ayırt edilemez ve diseksiyon mikroskop olmadan yapılabilir. Yine de, bireysel prostat lob diseksiyonu için tam protokol aşağıda açıklanmıştır.
   1. Ürogenital bölgeyi, bir Diseksiyon mikroskobu altında 10 cm 'lik bir PBS çanak içine yerleştirin ve sidik tarafını, araştırmacıya karşı karşıya gelen mesane ve seminal veziküller ile yönlendirmek. Ürogenital bölgenin tüm manipülasyon steril aletler kullanılarak yapılmalıdır.
   2. Prostat tümörünün genel fenotipini değerlendir-büyük ihtimalle, PCa GEMMs 'de sıvı dolu veya katı bir tümör gözlenir (Şekil 2a, B).
      Not: Akışkan dolu tümörlerde sıklıkla anterior prostat bölgesinde yer almaktadır (Şekil 2A). Sıvı dolu tümörler, öncelikle bağ dokusu ile yetersiz epitelyal bileşenlerden oluşur-böylece bu tümörler tümör epitelyal hücrelerinin düşük sayıda nedeniyle nevuslardır nesil için optimum değildir, temsili sonuçlarında tartışılacaktır Bölüm.
   3. Sıvı dolu tümörler varsa, tümör küçük bir delik poke. Ürogenital bölgeyi PBS 'nin yeni 10 cm 'lik bir tabağına yerleştirin.
   4. Dominant el olmayan baskın el ve kavisli forseps düz forseps bir çift alın. Ürogenital bölgeyi dorsal yüzüne çevirin. Proksimal prostat bölgesini arayın (Şekil 1B), hangi üretra pembe/kırmızı renk ile tespit edilebilir. Üretra kavramak ve eğri forseps ile ürogenital doku işlemek için sıkıca tutun.
      Not: Prostat diseksiyonu sırasında, her zaman mesane konumunu not alın, bu bireysel prostat lob bulmak için en basit yoldur (Şekil 1B).
6. Ürogenital bölgeden prostat olmayan dokuların çıkarılması
   1. Ürogenital bölgenin dorsal yüzünde hala iken, seminal vezikül tabanı bulun. Dikkatle seminal vezikül çıkarın ve atın. Aynı prosedürü karşı tarafta gerçekleştirin.
      Not: Bu prostat diseksiyonu ile müdahale yapışkan ve opak salgıları sıvı serbest bırakacaktır gibi, seminal vezikül delinme kaçının. Seminal vezikül delinmiş ise, kalan ürogenital bölgeyi taze PBS ile yeni 10 cm ye aktarın.
   2. Vas deferens ve forseps kavisli tarafı kullanarak mümkün olduğunca çok yağlı ve bağ dokusu çıkarın ve atın.
   3. Hala sıkıca üretra/proksimal prostat bölgesi tutarak, ince, sivri makas bir çift kullanın üretradan mesane kaldırmak için.
7. Bireysel prostat lobları izolasyonu
   1. Anterior prostat bulun (Şekil 1B). Düz forseps ile proksimal prostat bölgesi/üretra sıkıca tutmak için emin olun. Ön prostat bölgesini doğrudan forseplerin kavisli tarafı ile dokuyu hemen tutarak ve mesane ve prostatın geri kalanından sıkıca çekerek çıkarın. Dokuyu PBS 'ye yerleştirin.
      Not: Tüm prostat bölgeleri için, tümörün boyutuna bağlı olarak dokuyu çıkarmak için diseksiyon makası gerekebilir.
   2. Ventral prostat bölgesini bulun (Şekil 1B). Ventral prostat bölgesini adım 1.5.7 aynı şekilde çıkarın.
   3. Diseksiyon bu noktada, sadece lateral ve dorsal prostat bölgeleri mevcut olmalıdır, proksimal prostat bölgesi hala düz forseps tarafından kavrayarak ediliyor iken. Lateral ve dorsal prostat bölgelerini değerlendir (Şekil 1B). Lateral bölge dorsal bölgeden ayırt edilebilir ise, adım 1.5.7 açıklandığı gibi lateral prostat bölgesini çıkarın. Aynı prosedürü karşı tarafta yapın.
   4. 1.5.7 adımda açıklandığı gibi dorsal prostat bölgesini çıkarın. Proksimal prostat bölgesini% 4 PFA olarak yerleştirin, üretranın kas dokusu içindeki yapısı nevuslardır nesil için uygun değildir.

2. prostat tümör dokusundan 3D Organoidlerin üretimi

Not: Şekil 3 , tümör organoidlerin oluşturulması için prosedürün resimsel bir açıklamasını gösterir.

1. Hazırlık
   1. Aşağıdaki değişikliklerle drost ve al.¹⁸ ' e göre fare prostat nevuslardır medya hazırlayın. Noggin ve r-Spondin için rekombinant proteinler yerine şartlanma ortamını kullanın ve hem Noggi hem de ar-Spondin-Klima ortamı için% 10 yerine% 1 (v/v) oranında son konsantrasyon kullanın.
      Not: Ha-Mouse noggin-FC veya ha-Mouse Rspo1-FC ile stabil transfekte HEK293 hücreler sırasıyla noggin-veya R-spondin-Klima orta üretmek için kullanılır. Bu hücre hatları Stanford Üniversitesi 'nde Calvin Kuo Laboratuvarı 'ndan bir hediye.
   2. 5 mg/ml 'lik son konsantrasyona gelişmiş dmem/F12 (+ + +) medya ile 20 mg/ml kolajenaz II seyreltilerek 15 ml 'lik bir tüpte sindirim solüsyonu hazırlayın. 10 μM son konsantrasyonda kolajenaz II çözüme Y-27632 kaya inhibitörü ekleyin.
      Not: Sindirim tamponunun dokuya oranı 1 mL ila 50 mg 'dır ve Drost ve al.¹⁸' e göre kullanılır.
2. Tümör dokusunun mincing ve sindirimi
   1. Hücre kültürü kaputunda, prostat tümör dokusunu steril bir 10 cm kültür yeminde yerleştirin, nekrotik dokuyu kesip atın.
   2. Kalan prostat tümör dokusunu 1 mm³ küpler halinde steril kavisli forseps ile doku parçaları tutarak ve Diseksiyon makas ile kesme Mince.
   3. The 15 mL tüp içinde kıyılmış tümör parçaları koyun sindirim tampon ile forseps kavisli tarafı ile onları scooping tarafından. 37 °C ' de, 1,5 ila 2 saat sallayarak tümör dokusunu sindirin. her 20 dakikada bir sindirim ilerlemesini kontrol edin.
      Not: Şu anda,-20 °C depolama ve buz üzerinde çözülme en az 2 mL matris çıkarın. Matris 1 ml plakaya yaklaşık 3 h çözülmeye alacaktır.
   4. Doku sindirimi sonrası, 175 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika santrifüj tüpü hücre Pelet formu.
   5. Supernatant çıkarın, hücre peletini gevşetmek için tüp Flick, ve 10 μM Y-27632 kaya inhibitörü ile tamamlayıcı ön ısıtılmış tripsin 1 ml hücre Pelet pelletini. Tüpü 5 dakika boyunca 37 °C su banyosuna koyun.
   6. İnkübasyon sonrası, standart P1000 ucu ile 5 kez yukarı ve aşağı pipet. Başka bir 5 dakika için 37 °C su banyosu için tüp geri dönün ve adım 2.2.6 tekrarlayın.
      Not: Prosedürün Şu anda, 55 °C ' lik kuluçvörü içine koyarak steril 6-iyi hücre kültürü çanak sıcak.
3. Matris içinde hücreler ve Resuspension sayma
   1. 9 mL soğuk AdDMEM/F12 (+ + +) ekleyerek hücreleri yıkayın ve 175 x g 'de tüpü 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler.
   2. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın, peletin gevşetmek için tüp Flick, ve soğuk AdDMEM/F12 10 mL ekleyerek hücreleri tekrar yıkayın (+ + +). 4 °C ' de 5 dakika için 175 x g 'de tüpü Santrifüjü.
   3. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın, peletin gevşetmek için tüp Flick, hücreleri pelletini 1 ml addmem/F12 (+ + +), ve Standart prosedüre göre bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını saymak.
   4. Yedi-sekiz kubbeler bir iyi bir 6 iyi yemek zaman organoids matris içinde bir drop-Wise moda kaplama uygun . Yaklaşık 200 μL matris 7-8 kubbeleri üretecektir. Gelecekteki Deneysel amaçlar için kaç organoidin kuyuya ihtiyaç olduğunu karar verin ve gerekli matris hacmini hesaplayın. Daha sonra, 1,0 x 10⁶ hücre/ml matrisin son konsantrasyonuna sahip olmak için gereken hücre içeren çözümün hacmini hesaplayın.
   5. Hücreleri saydıktan sonra, 175 x g 'de 4 °c ' de 5 dk santrifüjler. Supernatant kaldırmak, peletin gevşetmek için tüp Flick ve adım 2.3.4 hesaplanan matris hacminde hücreleri pelletini.
      Not: Matrix sadece 4 °C ' de sıvı şeklinde kalır; Matris stok tüpleri ve matris hücre çözümlerini her zaman buzda saklayın.
4. Kaplama matris kubbeleri ve medya uygulaması
   1. Kabarcık tanıtmadan hücreleri eşit şekilde dağıtmak için matris hücresi çözümünü P200 pipet ile karıştırın. 55 °C ' lik kuluçoradan 6-kuyu kültürü tabağı çıkarın.
   2. Dikkatle pipet 200 μL matris hücre çözeltisi ve hızlı bir şekilde kubbeler oluşturmak için çözüm bırakın.
   3. 2.4.2 adımı tekrarlayın. Matris hücresi çözeltisi hacmi harcanıncaya kadar. Kubbeler, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca katılaşma sağlar.
   4. 6-well çanak ters çevirin ve 20 dakika boyunca Katılaşma devam etmek için bir 37 °C kuluçl içine çanak koymak.
   5. İnkübasyon sonra, her kuyu için 2 ml fare prostat nevuslardır medya ekleyin. 10 μM son konsantrasyonu 1 nM ve Y-27632 kaya Inhibitörü son konsantrasyon için her iyi sentetik androjen R1881 ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve plakayı 37 °C ' lik bir kuluçinatörün içine yerleştirin.
      Not: Nevuslardır kültür medyanın 10 μM Y-27632 kaya inhibitörü ile sadece 1 hafta sonra nevuslardır nesil ile takviye edilmesi gerekir.

Sonuçlar

Ön prostat bölgesinde büyük bir sıvı dolu primer prostat tümörü olan bir fare temsili otopsi görüntüler Şekil 2agösterilir. Buna karşılık, Şekil 2B, bireysel prostat bölgeleri ayırt edilemez büyük bir katı primer prostat tümörü olan bir fare temsili nekropsy görüntüleri gösterir. Floresan diseksiyon görüntüleri aynı katı prostat tümörü gösterir Şekil 2...

Tartışmalar

Prostat tümörü diseksiyonu ve nevuslardır üretimi için protokol içinde kritik adımlar
Prostat dışı doku ve fare prostat tümörünün ince diseksiyonu kaldırılması hem prostat olmayan epitelyal hücreler ve normal prostat epitelyal hücreler organoidler oluşturacaktır beri kanser organoidlerin optimum nesil için çok önemlidir. Katı prostat tümörlerinde özellikle, uygun hücrelerin sayısını azaltacak nekrotik doku ile kontaminasyon kaldırmak için uygun tümör alanlarını i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles	Becton Dickinson	Z192430
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
Analytical balance	Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Dissecting Board	Thermo-Fisher	36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10	Manufactured by Trevigen	Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory	Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutamine (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetyl-L-Cysteine	Sigma	A9165
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Precision balance	Mettler Toledo	30216561
Scalpel #23	World Precision Instruments	504176
Scalpel Handle #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Single-edge carbon razor blade	Fisherbrand	12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight	World Precision Instruments	14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated	World Precision Instruments	15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (Rock Inhibitor)	APExBIO	A3008