Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Zusammenfassung

Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

Methoden, die auf homologe Rekombination basieren, um Gene zu modifizieren, haben die biologische Forschung erheblich gefördert. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind eine strenge Methode zur Untersuchung der Entwicklung und Krankheit von Säugetieren. Unser Labor hat mehrere GEMMs von Prostatakrebs (PCa) entwickelt, die keine Expression eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene mit dem standortspezifischen Cre-loxP-Rekombinatosasesystem und einem Prostata-spezifischen Promotor haben. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Methode zur Nekropsie dieser PCa GEMMs, die sich in erster Linie auf die Zerlegung von Prostatatumoren der Maus konzentriert. Neue Methoden, die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, haben die Kultur epitheliaaler Zellen erleichtert, Organsysteme in vitro in drei Dimensionen zu modellieren. Wir beschreiben auch eine 3D-Zellkultur-Methode, um Tumor-Organoide aus Maus-PCa GEMMs zu generieren. Die präklinische Krebsforschung wurde von 2D-Zellkultur und zelllinienabgeleiteten oder vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen dominiert. Diese Methoden fehlen Tumor-Mikroumgebung, eine Einschränkung der Verwendung dieser Techniken in präklinischen Studien. GEMMs sind physiologisch relevanter für das Verständnis von Tumorgenese und Krebsprogression. Tumororganoidkultur ist ein In-vitro-Modellsystem, das Tumorarchitektur und Zelllinieneigenschaften rekapituliert. Darüber hinaus ermöglichen 3D-Zellkulturmethoden das Wachstum normaler Zellen zum Vergleich mit Tumorzellkulturen, die mit 2D-Zellkulturtechniken nur selten möglich sind. In Kombination hat die Verwendung von GEMMs und 3D-Zellkultur in präklinischen Studien das Potenzial, unser Verständnis der Krebsbiologie zu verbessern.

Einleitung

Seit den späten 1980er Jahren hat die Fähigkeit, Gene durch homologe Rekombination zu verändern, die Untersuchung biologischer Systeme stark vorangebracht¹. Induzible, gewebe- oder zellspezifische promotorische Systeme und standortspezifische Rekombinatore wie Cre-loxP haben fortgeschrittene genetische Studien, indem sie die Kontrolle über genetische Veränderungen sowohl zeitlich als auch räumlich erleichtern^{2,3, 4}. Die Kombination dieser genetischen Strategien hat eine breite Palette von experimentellen Modellsystemen^5,6,7geschaffen.

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind ein integrales Werkzeug, um zu beurteilen, wie einzelne Gene oder Gengruppen die Entwicklung und Krankheit von Säugetieren beeinflussen. In der präklinischen Krebsforschung sind GEMMs die physiologisch relevanteste und strengste Methode zur Untersuchung der Krebsentwicklung, Progression und Behandlung⁸. Unser Labor ist spezialisiert auf die Erzeugung und Charakterisierung von Krebs-GEMMs.

Der am häufigsten diagnostizierte nicht-kutane Krebs bei Männern in den Vereinigten Staaten ist Prostatakrebs (PCa). Die Mehrheit der Patienten mit PCa haben eine Erkrankung mit geringem Risiko und eine hohe Überlebenswahrscheinlichkeit, aber die Überlebensraten sinken drastisch, wenn die Krankheit im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird oder wenn eine gezielte Hormontherapie das Fortschreiten zu einer aggressiven, nicht heilbaren PCa induziert. Subtypen^9,10. Unser Labor hat GEMMs entwickelt, die Flockenallele eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene verwenden. Rekombination und Verlust der Tumorsuppressor-Genexpression tritt speziell in der Prostata auf, da wir ein Transgen mit Cre-Rekombinantase flussabwärts des Probasinpromotors eingeführt haben, der nur in den Prostataepithelzellen aktiviert ist^{11, 12}. Wir haben auch unsere GEMMs gezüchtet, um ein Cre-Reporter-Transgen namens mT/mG zu enthalten, das eine tomatenfluoreszierende Proteinexpression in Zellen ohne Cre- und grüne fluoreszierende Protein-Expression (GFP) in Zellen mit Cre¹³induziert. Während die Präsentation dieser Methode und unsere repräsentativen Ergebnisse GEMMs zeigen, die wir in unserem Labor untersuchen, kann dieses Protokoll verwendet werden, um Prostatakrebs-Organoide aus jedem Mausmodell zu erzeugen. Jedoch, wie im Detail in unserem repräsentativen Ergebnisabschnitt diskutiert, haben wir beobachtet, dass bestimmte Tumoreigenschaften für die Erzeugung von Prostatakrebs-Organoid optimal sind.

In den letzten zehn Jahren haben neue Methoden zur Kultivierung von Zellen aus Geweben epithelialen Ursprungs zu signifikanten Fortschritten in unserer Fähigkeit geführt, Organsysteme in vitro^14,15zu modellieren. Der Begriff "3D-Zellkultur" wurde den Techniken bei der Herstellung und Aufrechterhaltung von Organoiden zugeschrieben, die im Allgemeinen als Strukturen definiert werden können, die aus Zellen bestehen, die sekundäre Architektur zusammenfügen, die durch organspezifische Zelllinien angetrieben wird. Merkmale¹⁶. Diese neuen Methoden unterscheiden sich von der klassischen 2D-Zellkultur dadurch, dass Zellen keine Transformation oder Verewigung für langfristiges Wachstum erfordern; So können 3D-Kulturen normaler Zellen mit erkrankten Zellen verglichen werden. Dies ist besonders wertvoll in der Krebsforschung, wo normale Zellkontrollkulturen in der Regel nicht verfügbar waren. Darüber hinaus bilden Organoide spontan sekundäre Gewebearchitekturen mit entsprechend differenzierten Zelltypen, was sie zu einem besseren Modellsystem macht, um Krebs in vitro zu verstehen als 2D-Zelllinien¹⁷. Unser Labor hat 3D-Organoidlinien aus Tumorproblem erstellt, die aus unseren PCa GEMMs isoliert wurden, um unsere In-vivo-Daten zu ergänzen und Experimente durchzuführen, die bei GEMMs nicht möglich wären.

In diesem Artikel stellen wir schriftliche und visuelle Protokolle für die komplette Nekropsie von PCa GEMMs vor, einschließlich der Zerlegung von verschiedenen Mausprostatalappen und metastasierenden Läsionen. Wir beschreiben und zeigen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Erzeugung von Organoiden aus Maus-Prostatatumoren auf der Grundlage eines Protokolls, das zuvor von Drost et al. veröffentlicht wurde, um Organoide aus normalem Maus-Prostatagewebe abzuleiten¹⁸.

Protokoll

Die hier beschriebenen Tierprozeduren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York durchgeführt.

HINWEIS: Männliche Mäuse, die seziert werden, um Prostata- oder Prostatatumoren für die Erzeugung von Organoiden zu isolieren, sollten mindestens das Alter der Geschlechtsreife erreicht haben – etwa 8-10 Wochen alt. Spezifische Spezifienalter von Mäusen können von Studien zu Studien variieren. Einige Faktoren, die bei der Wahl des Alters zu berücksichtigen sind, sind altersabhängige Veränderungen in Prostatazellpopulationen, altersabhängige Expression spezifischer promotorischer Cre-Transgene und die Rate der Prostatatumorprogression in einem bestimmten GEMM.

1. Dissektion und Bildgebung von Maus-Prostatatumor und metastasierenden Tumoren

1. Vorbereitungen
   1. Erhalten Sie die notwendigen sterilen Sezierwerkzeuge. Bühnenrortungsfläche auf sauberer, steriler Oberfläche mit 15 cm Lineal, Präzisionsbalance, analytischem Gleichgewicht, Sprühflasche mit 70% Ethanol, phosphogepufferter Salzwäsche (PBS) und Papiertüchern.
   2. Vorbereitung von fixativen Lösungen für viszerale Organe und Knochen, die nicht für die Organoiderzeugung verwendet werden dürfen
      1. Für viszerale Organe: Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS vor. Für eine Maus 20 ml von 4% PFA machen, aliquot in zwei 15 ml konische Rohre und halten bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch.
      2. Für lange Knochen: Aliquot 10 ml vorgefertigtes 10% neutral gepuffertes Formalin (NBF) in einem 15 ml konischen Rohr und bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch aufbewahren.
   3. Unbehandeltes 10 cm Geschirr erhalten und mit nicht sterilen PBS füllen – diese dienen als temporäre Behälter für Organe während der Feinsektion mit einem Seziermikroskop.
      HINWEIS: Sterile Werkzeuge werden zum Sezieren von Geweben zur Erzeugung von Organoiden verwendet. Nicht-sterile Werkzeuge werden für den anfänglichen Einschnitt und die Zerlegung der Hinterbeine verwendet.
2. Euthanasie und Ersterschnitt
   1. Euthanisieren Sie die Maus durch CO2-Erstickung mit einer Durchflussrate von 2,0 l/min für 5 min. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und führen Sie zervikale Dislokation durch. Verwenden Sie die Präzisionswaage, um das Körpergewicht und die Aufzeichnung der Maus zu messen.
   2. Legen Sie die Maus auf ein Papiertuch und orientieren Sie sich an der sezierenden Oberfläche ventrale Seite nach oben mit dem Kopf der Maus weg vom Ermittler. Befestigen Sie die Maus an der Tafel, indem Sie ihre Gliedmaßen ausstrecken und jede der Vorderpfoten und Hinterpfoten mit einer Einwegnadel durchbohren.
   3. Mit einer Sprühflasche das Fell der Maus mit 70% Ethanol dosieren. Mit nicht-sterilen Sezierschere und geradeZange, kneifen Sie nur über dem Penis der Maus und machen einen kleinen Schnitt durch das Fell nur.
   4. Setzen Sie den Schnitt Mittellinie bis zum Hals der Maus nur durch das Fell. Machen Sie bilaterale Einschnitte vom Punkt des anfänglichen Einschnitts durch die ventrale Ebene der Maus nur durch das Fell.
   5. Greifen Sie das Fell und ziehen Sie es vorsichtig weg von der Haut der Maus. Pin das Fell an das Brett, um den Zugang zu den Bauch- und Brusthöhlen zu ermöglichen.
3. Extraktion des männlichen Urogenitalsystems en bloc
   1. Mit steriler Sezierschere und geraden Zangen vorsichtig durch die Haut ca. 0,75 cm über dem Rektum schneiden. Setzen Sie den Schnitt Mittellinie bis zum Brustkorb fort, ohne Organe in der Bauchhöhle zu stören. Ziehen Sie vorsichtig die Haut weg und heften Sie sich an das Brett, um die gesamte Bauchhöhle freizulegen.
      HINWEIS: Lassen Sie diese Instrumente nicht die Außenseite der Maus oder eine Oberfläche im Staging-Bereich berühren, da diese Gewebe verwendet werden, um Organoide zu erzeugen.
   2. Sezieren Sie das Urogenitalsystem und andere Organe gemäß dem Diagramm in Abbildung 1A, mit Zahlen, die die Reihenfolge angeben, in der die Organe von der Maus entfernt werden.
   3. Finden Sie die Blase, dann greifen Sie das Fettpolster nach links oder rechts und ziehen Sie nach oben, um den Hoden zu belichten. Sezieren Sie vorsichtig den Hoden vom Rest der Urogenitalregion und legen Sie ihn beiseite. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen Seite durch.
      HINWEIS: Um die optimale Gewebequalität und die detaillierte Tumorcharakterisierung von Prostatatumoren zu erreichen, muss der gesamte Urogenitalbereich aus der Maus en bloc¹⁹entfernt werden. Es wird empfohlen, zuerst den Urogenitalbereich zu entfernen (Abbildung 1A).
   4. Greifen Sie die Blase und ziehen Sie vorsichtig nach oben, so dass sich der Urogenitalbereich zusammenhebt und die Harnröhre darunter freilegt. Während Sie die Blase halten, orientieren Sie die Schere so, dass sie an der Unterseite der dorsalen Prostata sind und schneiden Sie die Harnröhre. Die gesamte Urogenitalregion wird dann aus der Bauchhöhle freigesetzt.
   5. Den Urogenitalbereich in eine 10 cm große Schale geben, die mit PBS gefüllt ist. Wenn noch mit Urin gefüllt, entleeren Sie die Blase, indem Sie einen kleinen Schnitt. Wiegen Sie mit der analytischen Waage das Urogenitalsystem und zeichnen Sie auf.
4. Extraktion von Beckenlymphknoten, Milz, Leber, Niere, Lunge, Tibia und Oberschenkelknochen
   1. Das Entfernen des Urogenitalsystems setzt die Beckenlymphknoten frei, die direkt hinter dem Urogenitalsystem (Abbildung 1A) und auf beiden Seiten der Wirbelsäule positioniert sind. Die Lymphknoten sind nur sichtbar, wenn sie metastasierende Läsionen enthalten oder wenn es eine lokale Entzündung gibt. Richten Sie die geraden Zangen unter dem Lymphknoten aus und ziehen Sie nach oben, um den Lymphknoten zu entfernen. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen Seite durch.
   2. Greifen Sie das Rektum mit den geraden Zangen und schneiden. Ziehen Sie auf dem Rektum, um den gesamten Dickdarm und Dünndarm zu entwirren, auf der Suche nach metastasierenden Läsionen in den mesenterischen Lymphknoten. Wenn das gesamte Ileum entfernt wird, ziehen Sie weiter auf dem Zwölffingerdarm, um den Magen zu entblößen. Schneiden Sie die Speiseröhre, um den Magen vollständig zu entfernen und zu entsorgen. Wenn metastasierende Läsionen in den Lymphknoten beobachtet werden, sezieren Sie vorsichtig weg vom Darm und lagern Sie in einer 10 cm Schale PBS.
   3. Das Aussetzen und Entfernen des Magens wird die Milz von der Rückenseite des Bauches ziehen (Abbildung 1A). Entfernen Sie die Milz und legen Sie sie in 4% PFA. Die Milz dient als Färbungskontrolle für Hemotoxylin, da es sehr zellulär ist.
      HINWEIS: Viszerale Gewebe, die nicht für die Organoiderzeugung verwendet werden, werden über Nacht in 4% PFA fixiert, mit PBS gewaschen und dann in 70 % Ethanol gegeben.
   4. Entfernen Sie die Leber im oberen Teil des Bauches (Abbildung 1A). Basierend auf der metastasierenden Belastung in der Leber können einzelne Lappen seziert oder die gesamte Leber durch vorsichtiges Schneiden entlang der Membran entfernt werden. (Schneiden Sie das Zwerchfell zu diesem Zeitpunkt nicht durch). Die Leber in eine 10 cm große Schale PBS geben.
   5. Die Entfernung der Leber wird die Nieren auf beiden Seiten der Wirbelsäule vollständig aussetzen (Abbildung 1A). Entfernen Sie die Nieren – zusammen mit den Nierenlymphknoten, wenn die Knoten metastasierende Läsionen haben – indem Sie die geradezange Zange unter die Niere legen und nach oben ziehen. Führen Sie das gleiche Verfahren für die andere Seite durch.
   6. Um die Brusthöhle freizulegen, schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig entlang des Brustkorbs. Durch das Durchbohren des Zwerchfells wird der Unterdruck in der Brusthöhle freigesetzt und Herz und Lunge freisetzen (Abbildung 1A).
   7. Greifen Sie das Brustbein und ziehen Sie nach oben, um die Brusthöhle weiter zu öffnen. Beobachten Sie die ventrale Fläche der Brusthöhle entlang des Rippenkäfigs auf metastasierende Läsionen in den brustbrustigen Lymphknoten und sezieren Sie, falls vorhanden.
   8. Während Sie das Brustbein noch halten, schneiden Sie den ventralen Rippenkäfig weg, um auf das Herz und die Lunge zuzugreifen. Greifen Sie das Herz, ziehen Sie nach oben und schneiden Sie unter der Lunge. Um Herz und Lunge en bloc vollständig zu entfernen, schneiden Sie alle vorderen Blutgefäße und die Luftröhre. Legen Sie das Gewebe in PBS und entfernen Sie vorsichtig das Herz, ohne das Lungengewebe oder die metastasatheischen Lungenläsionen zu schädigen.
   9. Nehmen Sie die nicht sterilen geraden Zangen und sezieren Schere und schneiden Sie das Hinterbein an der Spitze des Oberschenkelknochens. Greifen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen und entfernen Sie das Hinterbein aus dem Fell.
   10. Legen Sie das Hinterbein auf ein Papiertuch und greifen Sie die Hinterpfote. Verwenden Sie die einschneidige Rasierklinge, um alle Muskeln und Bindegewebe von der Tibia und Demfemur zu verschrotten / zu schneiden. Entfernen Sie den Oberschenkelknochen von der Tibia, indem Sie hinter der Patella die Patellasehne schneiden und entfernen Sie die Tibia, indem Sie die Hinterpfote entfernen. Platzieren Sie die Tibia und den Oberschenkelknochen in 10% NBF. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen Seite durch.
       HINWEIS: Zur Untersuchung der langen Knochen der Maus auf metastasierende Läsionen muss die Fibel nicht intakt sein. Die langen Knochen werden in 10% NBF für eine Woche fixiert und dann mit neutraler EDTA-Lösung²⁰entkalkt. Nach drei Wochen werden die Knochen auf 70% Ethanol übertragen.
   11. Nach dem Entfernen der Hinterbeine, nehmen Sie ein Ohr oder Schwanz schneiden für zukünftige Genotypisierung. Entsorgen Sie den Mauskadaver und das gesamte Gewebe, das nicht fixiert oder für die Organoiderzeugung verwendet werden soll.
5. Zerlegung des Prostatatumors
   HINWEIS: Die Zerlegung von Mausprostatalappen kann nur mit einem Sezierendes Mikroskop erreicht werden¹⁹. Die Prostatatumorbelastung kann jedoch so hoch sein, dass einzelne Lappen nicht unterschieden werden können und die Zerlegung ohne Mikroskop durchgeführt werden kann. Dennoch wird das vollständige Protokoll zur Zerlegung einzelner Prostatalappen unten beschrieben.
   1. Legen Sie den Urogenitalbereich in eine 10 cm große Schale PBS unter einem Sezierendes Mikroskop und richten Sie die ventrale Seite nach oben mit der Blase und den Samenbläschen, die vom Forscher weggerichtet sind. Alle Manipulationen der Urogenitalregion sollten mit sterilen Instrumenten erfolgen.
   2. Beurteilen Sie den allgemeinen Phänotyp des Prostatatumors - höchstwahrscheinlich wird entweder ein flüssigkeitsgefüllter oder ein solider Tumor in PCa GEMMs beobachtet (Abbildung 2A, B).
      HINWEIS: Flüssigkeitsgefüllte Tumoren befinden sich oft im vorderen Prostatabereich (Abbildung 2A). Flüssigkeitsgefüllte Tumoren bestehen hauptsächlich aus Bindegewebe mit spärlichen Epithelkomponenten – daher sind diese Tumoren aufgrund der geringen Anzahl von Tumorepithelzellen nicht optimal für die Organoiderzeugung, wie in den repräsentativen Ergebnissen diskutiert wird. teil.
   3. Wenn flüssigkeitsgefüllte Tumoren vorhanden sind, schlagen Sie ein kleines Loch in den Tumor. Legen Sie den Urogenitalbereich in eine neue 10 cm Schale PBS.
   4. Nehmen Sie ein Paar gerade Zangen in der nicht-dominanten Hand und gekrümmte Zange in der dominanten Hand. Drehen Sie die Urogenitalregion in ihr dorsales Gesicht. Suchen Sie nach dem proximalen Prostatabereich (Abbildung 1B), der durch die rosa/rote Farbe der Harnröhre identifiziert werden kann. Greifen Sie die Harnröhre und halten Sie fest, um das Urogenitalgewebe mit den gekrümmten Zangen zu manipulieren.
      HINWEIS: Beachten Sie während der Prostatasektion immer die Lage der Blase, da dies der einfachste Weg ist, die einzelnen Prostatalappen zu lokalisieren (Abbildung 1B).
6. Entfernung von Nicht-Prostatagewebe aus dem Urogenitalbereich
   1. Während sie noch auf dem dorsalen Gesicht der Urogenitalregion sind, finden Sie die Basis des Samenbläschens. Entfernen Sie vorsichtig das Samenbläschen und entsorgen Sie es. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der gegenüberliegenden Seite aus.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Sperma-Vesikel zu punktieren, da dies klebrige und undurchsichtige sekretorische Flüssigkeit freisetzt, die die Prostatadissektion stört. Wenn das Samenbläschen punktiert ist, übertragen Sie den verbleibenden Urogenitalbereich auf eine neue 10 cm Schale mit frischem PBS.
   2. Entfernen und entsorgen Sie die Vas deferens und so viel Fett- und Bindegewebe wie möglich mit der gekrümmten Seite der Zange.
   3. Während Sie die Harnröhre/proximale Prostataregion noch fest halten, verwenden Sie eine feine, spitze Schere, um die Blase aus der Harnröhre zu entfernen.
7. Isolierung einzelner Prostatalappen
   1. Suchen Sie die vordere Prostata (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, die proximale Prostataregion/Harnröhre mit den geraden Zangen fest zu halten. Entfernen Sie den vorderen Prostatabereich, indem Sie das Gewebe direkt mit der gekrümmten Seite der Zange erfassen und fest von der Blase und dem Rest der Prostata wegziehen. Legen Sie das Gewebe in PBS.
      HINWEIS: Für alle Prostataregionen kann eine Schere entfernt werden, um das Gewebe zu entfernen, abhängig von der Größe des Tumors.
   2. Suchen Sie den ventralen Prostatabereich (Abbildung 1B). Entfernen Sie den ventralen Prostatabereich auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.5.7.
   3. An dieser Stelle in der Zerlegung sollten nur die seitlichen und dorsalen Prostataregionen vorhanden sein, während die proximale Prostataregion noch von den geraden Zangen erfasst wird. Bewerten Sie die lateralen und dorsalen Prostataregionen (Abbildung 1B). Wenn der laterale Bereich von der dorsalen Region unterschieden werden kann, entfernen Sie den seitlichen Prostatabereich, wie in Schritt 1.5.7 beschrieben. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der gegenüberliegenden Seite.
   4. Entfernen Sie den dorsalen Prostatabereich, wie in Schritt 1.5.7 beschrieben. Platzieren Sie die proximale Prostataregion in 4% PFA, da ihre Struktur innerhalb des Muskelgewebes der Harnröhre es für die Organoiderzeugung ungeeignet macht.

2. Erzeugung von 3D-Organoiden aus Prostatatumorgewebe

HINWEIS: Abbildung 3 zeigt eine bildliche Beschreibung des Verfahrens zur Erzeugung von Tumororganoiden.

1. vorbereitung
   1. Bereiten Sie Maus Prostata-Organoid-Medien nach Drost et al.¹⁸ mit den folgenden Änderungen. Verwenden Sie konditioniertes Medium anstelle von rekombinanten Proteinen für Noggin und R-Spondin und verwenden Sie eine Endkonzentration von 1% (v/v), statt 10%, für Noggin- und R-Spondin-konditioniertes Medium.
      HINWEIS: HEK293-Zellen, die mit HA-Maus Noggin-Fc oder HA-Maus Rspo1-Fc stabil transfiziert werden, werden zur Herstellung von Noggin- bzw. R-Spondin-konditionierten Medien verwendet. Diese Zelllinien waren ein Geschenk des Calvin Kuo Laboratory an der Stanford University.
   2. Bereiten Sie die Verdauungslösung in einem 15 ml-Rohr vor, indem Sie 20 mg/ml Kollagennase II mit Advanced DMEM/F12(+++) Medien auf eine Endkonzentration von 5 mg/ml verdünnen. Fügen Sie y-27632 Rock Inhibitor der Kollagenase-II-Lösung in einer Endkonzentration von 10 m hinzu.
      HINWEIS: Das Verhältnis von Verdauungspuffer zu Gewebe beträgt 1 ml bis 50 mg, das wir nach Drost et al.¹⁸verwenden.
2. Verarbeitung und Verdauung von Tumorgewebe
   1. In der Zellkulturhaube prostatatumorgewebe in eine sterile 10 cm Kulturschale legen, nekrotisches Gewebe sezieren und entsorgen.
   2. Schneiden Sie das verbleibende Prostatatumorgewebe in 1 mm³ Würfel, indem Sie die Gewebestücke mit den sterilen gekrümmten Zangen halten und mit einer Sezierschere schneiden.
   3. Legen Sie die gehackten Tumorstücke in das 15 ml-Rohr mit dem Verdauungspuffer, indem Sie sie mit der gekrümmten Seite der Zange aufschaufeln. Verdauen Sie das Tumorgewebe bei 37 °C mit Schütteln für 1,5 bis 2 h. Überprüfen Sie den Verdauungsfortschritt alle 20 min.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt mindestens 2 ml Matrix aus -20 °C Lagerung herausnehmen und auf Eis auftauen. 1 ml Aliquots der Matrix werden etwa 3 h zum Tauen brauchen.
   4. Nach der Gewebeverdauung zentrifugieren Sie das Zentrifugenrohr bei 175 x g für 5 min bei 4 °C, um ein Zellpellet zu bilden.
   5. Entfernen Sie den Überstand, flicken Sie das Rohr, um das Zellpellet zu lösen, und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml vorgewärmtem Trypsin wieder auf, ergänzt mit 10 'M Y-27632 Rock Inhibitor. Legen Sie das Rohr in ein 37 °C Wasserbad für 5 min.
   6. Nach der Inkubation, Pipette auf und ab 5 Mal mit einer Standard-P1000 Spitze. Geben Sie das Rohr für weitere 5 min auf 37 °C Wasserbad zurück und wiederholen Sie Schritt 2.2.6.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt im Verfahren, erwärmen Sie eine sterile 6-Well-Zell-Kulturschale, indem Sie es in einen 55 °C Inkubator.
3. Zählen von Zellen und Resuspension in Matrix
   1. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 9 ml kaltes AdDMEM/F12(+++) hinzufügen und das Rohr bei 175 x g bei 175 x g zentrifugieren, 5 min bei 4 °C.
   2. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen, das Rohr zum Lösen des Pellets ziehen und die Zellen erneut waschen, indem 10 ml kaltes AdDMEM/F12(+++) hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 175 x g für 5 min bei 4 °C.
   3. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand, ziehen Sie das Rohr, um das Pellet zu lösen, setzen Sie die Zellen in 1 ml AdDMEM/F12(+++) wieder auf und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer nach Standardverfahren.
   4. Sieben bis acht Kuppeln passen in einen Brunnen einer 6-Brunnen-Schale, wenn Organoide tropfenweise in Matrix plattiert werden. Etwa 200 l Matrix erzeugen 7-8 Dome. Entscheiden Sie, wie viele Brunnen von Organoiden für zukünftige experimentelle Zwecke benötigt werden, und berechnen Sie das benötigte Matrixvolumen. Berechnen Sie dann das Volumen der zellhaltigen Lösung, die für eine Endkonzentration von 1,0 x 10⁶ Zellen/ml Matrix erforderlich ist.
   5. Nach dem Zählen der Zellen zentrifugieren Sie bei 175 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, flicken Sie das Rohr, um das Pellet zu lösen, und suspendieren Sie die Zellen im Volumen der Matrix, berechnet in Schritt 2.3.4.
      HINWEIS: Matrix bleibt in flüssiger Form nur bei 4 °C; Matrixstockröhren und Matrixzelllösungen jederzeit auf Eis halten.
4. Beschichtung von Matrixkuppeln und Anwendung von Medien
   1. Mischen Sie Matrix-Zell-Lösung mit einer P200 Pipette, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, ohne Blasen einzuführen. Entfernen Sie das 6-Well-Kulturgericht aus dem 55 °C-Inkubator.
   2. Sorgfältig Pipetten 200 l Matrix-Zell-Lösung und schnell fallen die Lösung in einen Brunnen, um Kuppeln zu erstellen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2. bis das Volumen der Matrix-Zell-Lösung verbraucht ist. Lassen Sie die Kuppeln bei Raumtemperatur für 2 min erstarren.
   4. Drehen Sie die 6-Well-Schale auf den Kopf und legen Sie die Schale in einen 37 °C-Inkubator, um die Erstarrung für 20 min fortzusetzen.
   5. Nach der Inkubation, fügen Sie 2 ml Maus Prostata-Organoid-Medien zu jedem Brunnen. Fügen Sie synthetisches Androgen R1881 zu jedem Brunnen für eine Endkonzentration von 1 nM und Y-27632 Rock Inhibitor zu einer Endkonzentration von 10 m hinzu. Sorgfältig mischen und die Platte in einen 37 °C-Inkubator für die Kultivierung legen.
      HINWEIS: Organoide Kulturmedien müssen nur 1 Woche nach der Organoid-Generation mit 10 'M Y-27632 Rock Inhibitor ergänzt werden.

Ergebnisse

Repräsentative Nekropsiebilder einer Maus mit einem großen flüssigkeitsgefüllten primären Prostatatumor im vorderen Prostatabereich sind in Abbildung 2Adargestellt. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 2Brepräsentative Nekropsiebilder einer Maus mit einem großen festen primären Prostatatumor, für den einzelne Prostataregionen nicht zu unterscheiden sind. Fluoreszierende Dissektionsbilder zeigen den gleichen soliden Prostat...

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls zur Prostatatumorsektion und Organoiderzeugung
Die Entfernung von Nicht-Prostatagewebe und die feine Zerlegung des Prostatatumors der Maus ist entscheidend für die optimale Erzeugung von Krebsorganoiden, da sowohl Nicht-Prostata-Epithelzellen als auch normale Prostata-Epithelzellen Organoide erzeugen. Für solide Prostata-Tumoren speziell, Es ist wichtig, Bereiche des lebensfähigen Tumors zu isolieren, um Kontamination mit nekrotischem Gewebe zu entfernen,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles	Becton Dickinson	Z192430
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
32% paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
Analytical balance	Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Dissecting Board	Thermo-Fisher	36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10	Manufactured by Trevigen	Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory	Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
human recombinant Epidermal growth factor (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutamine (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetyl-L-Cysteine	Sigma	A9165
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Precision balance	Mettler Toledo	30216561
Scalpel #23	World Precision Instruments	504176
Scalpel Handle #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Single-edge carbon razor blade	Fisherbrand	12-640
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight	World Precision Instruments	14393
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated	World Precision Instruments	15915
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (Rock Inhibitor)	APExBIO	A3008