Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

Resumen

El artículo describe un protocolo rápido para etiquetar los vasos sanguíneos en un pez teleósteo por perfusión cardíaca de DII diluido en fijador, usando medaka (Oryzias latipes) como modelo y centrándose en el cerebro y el tejido pituitario.

Resumen

Los vasos sanguíneos inervan todos los tejidos en los vertebrados, lo que permite su supervivencia proporcionando los nutrientes necesarios, oxígeno, y las señales hormonales. Es uno de los primeros órganos que empiezan a funcionar durante el desarrollo. Los mecanismos de formación de los vasos sanguíneos se han convertido en un tema de alto interés científico y clínico. En los adultos sin embargo, es difícil visualizar la vasculatura en la mayoría de los animales vivos debido a su localización profunda dentro de otros tejidos. Sin embargo, la visualización de los vasos sanguíneos sigue siendo importante para varios estudios como Endocrinología y Neurobiología. Mientras que varias líneas transgénicas se han desarrollado en el pez cebra, con los vasos sanguíneos directamente visualizados a través de la expresión de proteínas fluorescentes, no existen tales herramientas para otras especies teleósteo. Usando medaka (Oryzias latipes) como modelo, el protocolo actual presenta una técnica rápida y directa para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis mediante el perfundiendo a través del corazón con fijador que contiene DII. Este protocolo permite mejorar nuestro entendimiento sobre cómo las células cerebrales y pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejidos enteros o rebanadas gruesas de tejido.

Introducción

Los vasos sanguíneos desempeñan una parte esencial del cuerpo vertebrado, ya que proporcionan los nutrientes necesarios, el oxígeno y las señales hormonales a todos los órganos. También, desde el descubrimiento de su participación en el desarrollo del cáncer¹, han recibido mucha atención en la investigación clínica. Aunque una serie de publicaciones han investigado los mecanismos que permiten el crecimiento de los vasos sanguíneos y la morfogénesis, y un gran número de genes importantes para su formación se han identificado², queda mucho por entender en cuanto a la interacción entre las células o los tejidos y la sangre circulante.

La visualización de la vasculatura sanguínea en el cerebro y la hipófisis es importante. Las neuronas en el cerebro requieren un alto suministro de oxígeno y glucosa³, y la hipófisis contiene hasta ocho importantes tipos de células productoras de hormonas que utilizan el flujo sanguíneo para recibir la señal del cerebro y enviar sus respectivas hormonales a diferentes órganos periféricos^4,5. Mientras que en los mamíferos, el sistema del portal en la base del hipotálamo llamado la eminencia mediana, une el cerebro y la hipófisis⁶, tal un puente sanguíneo claro no se ha descrito en el pez teleósteo. De hecho, en teleosts, neuronas preoptico-hipotalámica proyectar directamente sus axones en el pars nerviosa de la hipófisis⁷ y en su mayoría inervate los diferentes tipos de células endocrinas directamente^8,9. Sin embargo, algunas de estas neuronas tienen sus terminaciones nerviosas ubicadas en el espacio extravascular, cerca de los capilares sanguíneos¹⁰. Por lo tanto, la diferencia entre el pez teleósteo y los mamíferos no es tan clara, y la relación entre la vasculatura sanguínea y el cerebro y las células pituitarias requiere una mayor investigación en los peces teleósteo.

El pez cebra tiene, en muchos aspectos, un sistema vascular anatómico y funcionalmente comparable a otras especies de vertebrados¹¹. Se ha convertido en un poderoso modelo de vertebrados para la investigación cardiovascular principalmente gracias al desarrollo de varias líneas transgénicas donde los componentes del sistema vascular están etiquetados con proteínas reporteras fluorescentes¹². Sin embargo, la anatomía exacta del sistema circulatorio puede variar entre especies, o incluso entre dos individuos pertenecientes a la misma especie. Por lo tanto, la visualización de los vasos sanguíneos puede ser de gran interés también en otras especies teleósteo para las cuales no existen herramientas de transgénesis.

Se han descrito varias técnicas para etiquetar los vasos sanguíneos tanto en mamíferos como en teleostos. Estos incluyen la hibridación in situ para genes específicos de la vasculatura, la tinción de fosfatasas alcalinas, la microangiografía y las inyecciones de tinte (para una revisión ver¹³). Colorante indocarbocianine catiónico fluorescente lipofílico (DII) primero se utilizó para estudiar la movilidad lateral de lípidos de membrana, ya que se retiene en las bicapas de lípidos y puede migrar a través de él^14,15,16. De hecho, una molécula de DiI se compone de dos cadenas de hidrocarburos y cromos. Mientras que las cadenas de hidrocarburos se integran en la membrana de la célula bicapa lipídica de las células en contacto con ella, los cromos permanecen en su superficie¹⁷. Una vez en la membrana, las moléculas DiI se difunden lateralmente dentro de la bicapa lipídica que ayuda a manchar las estructuras de la membrana que no están en contacto directo con la solución DiI. Inyectar una solución DiI a través de la perfusión cardíaca, por lo tanto etiquetará todas las células endoteliales en contacto con el compuesto permitiendo el etiquetado directo de los vasos sanguíneos. Hoy DiI también se utiliza para otros fines de tinción, como la imagen de una sola molécula, mapeo del destino, y rastreo neuronal. Curiosamente, existen varios fluoróforos (con diferentes longitudes de onda de emisión) permitiendo la combinación con otras etiquetas fluorescentes, y la incorporación, así como la difusión lateral de DiI puede ocurrir en los tejidos vivos y fijos^{18, 19}.

El formaldehído, descubierto por Ferdinand Blum en 1893, se ha utilizado ampliamente hasta el día de hoy como el producto químico preferido para la fijación del tejido^20,21. Muestra una amplia especificidad para la mayoría de los objetivos celulares y preserva la estructura celular^22,23. También preserva las propiedades fluorescentes de la mayoría de los fluoróforos, y por lo tanto se puede utilizar para fijar animales transgénicos para los cuales las células dirigidas expresan proteínas reporteras fluorescentes.

En este manuscrito, un protocolo anterior desarrollado para etiquetar los vasos sanguíneos en pequeños modelos experimentales de mamíferos²⁴ se ha adaptado al uso en peces. Todo el procedimiento tarda solo un par de horas en realizarse. Se demuestra cómo perfumar una solución fijadora de formaldehído que contiene DiI en el corazón de pescado con el fin de etiquetar directamente todos los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis de la medaka modelo de pescado. Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, que se encuentra principalmente en Japón. Es un organismo modelo de investigación con un conjunto de herramientas moleculares y genéticas disponibles²⁵. Por lo tanto, la identificación de los vasos sanguíneos en esta especie, así como en otros permitirá mejorar nuestra comprensión sobre cómo el cerebro y las células pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejido entero o rebanadas de tejido grueso.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todo el manejo de los animales se realizó de acuerdo con las recomendaciones para el cuidado y el bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida, y bajo la supervisión de los investigadores autorizados.

1. preparación de instrumentos y soluciones

1. Preparar la solución de acción DiI disolver 5 mg de cristal DiI en 1,5 mL tubo de plástico con 1 mL de 96% EtOH. Vórtice durante 30 s y manténgase cubierto con papel de aluminio.
   Nota: La solución de la acción DiI se puede conservar en la oscuridad a-20 ° c durante varios meses.
2. Preparar el soporte para peces (figura 1a) cortando un trozo de poliestireno a 5 cm de longitud, 3 cm de ancho, y 2 cm de espesor, y encolado a un plato de plástico de 9 cm de diámetro. Hacer un agujero en forma de bote de 3 cm con una hoja de bisturí en el poliestireno.
3. Prepare el sistema de perfundiendo (figura 2) añadiendo una cánula de plástico de 30-50 cm de largo en el extremo de la aguja.
4. Preparar 40 mL de solución fresca de paraformaldehído al 4% (PFA) diluyendo 10 mL de 16% de PFA con 30 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS) en un tubo de plástico de 50 mL.
5. Prepare 10 mL de solución Fixative/DiI diluyendo 1 mL de la solución de acción DiI en 9 mL de PFA recién preparada al 4% en un tubo de plástico de 10 mL. Mantener en la oscuridad hasta su uso.
   Nota: Los cristales DiI que no se disuelven se pueden mantener en el tubo de solución de stock, y se puede añadir nuevo etanol para preparar nueva solución de la acción DiI (ver paso 1,1).
6. Preparar 50 mL de acción de tricaína (MS-222).
   1. Disolver 200 mg de Tricaine en polvo en 48 mL de H₂O. Añadir 2 ml de la base de Tris de 1 M (pH 9). Ajustar a pH 7 con 1 M HCl y almacenar a-20 ° c.
7. Diluir 5 mL de la culata de Tricaine en 50 mL de agua limpia en un vaso pequeño.
8. Prepare varias pipetas de vidrio de 5 cm (figura 2) estirando un capilar de vidrio con un extractor de piletas siguiendo las instrucciones del fabricante.

2. disección y perfusión

Nota: La PFA es un compuesto tóxico volátil, por lo tanto, la disección y la perfusión se deben realizar en una campana o en una habitación ventilada, y el usuario debe llevar una máscara de gas.

1. Prepare las herramientas de disección incluyendo tijeras pequeñas, y un fórceps afilado y uno fuerte antes de la disección.
2. Llene la jeringa con la solución preparada de PFA/DiI colocándola en el tubo de 50 mL y dibujando. A continuación, coloque la aguja con la cánula en el extremo de la jeringa (figura 2).
3. Fije la jeringa al Banco utilizando varios trozos de cinta colocados en diferentes direcciones, ajuste la posición del microscopio y el asiento para obtener una buena posición para la disección y para presionar el pistón de la jeringa (figura 1B).
   Nota: En este protocolo, el codo se utiliza para presionar hacia abajo el pistón de la jeringa, pero se pueden utilizar otras opciones de posibilidades, por ejemplo, la asistencia de otra persona.
4. Eutanasia al pez con una sobredosis de tricaína colocando el pez en la solución preparada en el paso 1,7. Espere 30 s y pruebe los reflejos del pez agarrando su aleta caudal con el fórceps. El pez se puede utilizar cuando ha dejado de responder a los estímulos.
5. Coloque el pez en el sostenedor del pez con su abdomen hacia arriba y PIN una aguja en la extremidad de la cabeza y otra encima de la cola para mantener el pescado en su lugar.
6. Abra el abdomen anterior con las tijeras cortando horizontalmente la capa superficial de la piel.
7. Con fórceps, retire la piel por encima del corazón hasta que se provea un acceso claro al ventrículo y al bulbo arterioso (figura 3).
8. Añadir una Piera de vidrio en la extremidad del capilar y romper el extremo de la punta de la Piera de vidrio.
   Nota: El orificio de la punta rota debe ser lo suficientemente grande como para dejar salir el líquido, pero todavía lo suficientemente pequeño para entrar fácilmente en el tejido. La Piera de vidrio se puede reutilizar si no está rota o obstruida.
9. Acerque la Piela de vidrio al ventrículo y agregue presión al pistón de la jeringa con el codo para forzar la salida del líquido.
10. Fijar el ventrículo cardíaco con la Piera de vidrio y añadir presión a la jeringa.
11. Directamente después, perforar el seno venoso con fórceps para permitir que la sangre deje la circulación.
    Nota: El ventrículo cardíaco se vuelve más frágil debido al fijador. También se vuelve menos rojo como la sangre se diluye con la solución Fixative/DiI.
12. Desde el ventrículo, ajuste el ángulo de la Piera de vidrio para encontrar la entrada del el bulbo arterioso. Traiga la Piera que se abre dentro del bulbo arterioso como se muestra en la figura 2, y agregue más presión a la jeringa.
    Nota: El bulbo arterioso es transparente y el tejido es elástico. Al reemplazar la sangre con DiI/fijador, la Piera de vidrio dentro del corazón debe ser más visible y añadiendo presión, el tamaño del bulbo arterioso debe expandirse. Este paso es crucial para asegurarse de que se ha utilizado suficiente presión para reemplazar toda la sangre con la solución Fixative/DiI, y que todos los vasos sanguíneos se han alcanzado. A menudo, cuando se tiene éxito, el PFA provoca contracciones musculares y el pez se va a mover.
13. Continúe añadiendo presión sobre la jeringa durante 30-60 s aún manteniendo la Piera de vidrio en el interior del el bulbo arterioso.
14. Retire la de vidrio y las agujas del pescado.
15. Diseccionar el cerebro y la hipófisis, e incubar los tejidos en fresco 4% PFA en PBS para 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
    Nota: La disección del cerebro y la hipófisis anteriormente se ha descrito en detalle de dos maneras diferentes por Fontaine et al.²⁶ y Ager-Wick et al.²⁷. Debido a la fijación, el tejido se vuelve bastante duro y el eslabón frágil entre el cerebro y la hipófisis puede romperse. Después de la disección, el procesamiento posterior a la fijación también se puede realizar durante la noche a 4 ° c.
16. Enjuague el tejido dos veces en PBS durante 10 minutos antes de prepararse para la toma de imágenes.
    Nota: A continuación, se puede montar el tejido entre el deslizamiento y el resguardo de la cubierta con espaciadores entre el medio y el soporte de montaje para la imagen confocal (ver figura 4), o seccionado con un vibratomo como se describe detalladamente en Fontaine et al.²⁶ antes de montar entre deslizamiento y tapa para la toma de imágenes con un microscopio Estereomicroscopio (ver figura 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Este protocolo demuestra un procedimiento paso a paso para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro de medaka y la hipófisis, y al mismo tiempo fijar el tejido. Después del etiquetado por inyección cardíaca de una solución fijadora que contiene DiI en el corazón, los vasos sanguíneos se pueden observar en rodajas usando un estereomicroscopio fluorescente (figura 4) o en tejido entero usando un microscopio confocal (figura 5). Ya sea en la rebanada de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

La perfusión cardíaca con DII previamente se ha utilizado para etiquetar los vasos sanguíneos en varias especies modelo²⁴, incluyendo el pez teleósteo¹³_.

Como DiI es entregado directamente a la membrana de la célula endotelial por perfusión en la vasculatura, es posible aumentar la relación señal-ruido mediante el aumento de la concentración de DiI en la solución fijadora. Además, el fluoróforo proporciona una coloración i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL Syringe PP/PE without needle	Sigma	Z116866-100EA	syringes
BD Precisionglide syringe needles	Sigma	Z118044-100EA	needles 18G (1.20*40)
Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm	sutter instrument	BF120-94-10	glass pipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D-282
LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm	Portex	800/110/340/100	canula
Phosphate Buffer Saline (PBS) solution	Sigma	D8537-6X500ML
Pipette puller	Narishige	PC-10
Plastic Petri dishes	VWR	391-0442
Super glue gel	loctite	c4356
Tricaine (ms-222)	sigma	E10521-50G