Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Özet

Bu makalede, bir teleost balık kan damarlarında etiketleme için hızlı bir protokol açıklar dıı kalp perfüzyon tarafından fiktatif olarak seyreltilebilir, Medaka kullanarak (Oryzias latipes) bir model olarak ve beyin ve hipofiz doku odaklanmak.

Özet

Kan damarlarında omurgada tüm dokularda inler, gerekli besin sağlayarak onların hayatta kalma sağlayan, oksijen, ve hormonal sinyaller. Kalkınma sırasında işleyişi başlatmak için ilk organlardan biridir. Kan damar oluşumu mekanizmaları yüksek bilimsel ve klinik ilgi konusu haline gelmiştir. Ancak yetişkinlerde, diğer dokularda lokalizasyonu nedeniyle en canlı hayvanlarda damarlarını görselleştirmek zordur. Bununla birlikte, kan damarlarının görselleştirme Endokrinoloji ve Nörobiyoloji gibi çeşitli çalışmalar için önemli kalır. Çeşitli transjenik çizgiler zebrafish geliştirilmiştir iken, doğrudan floresan proteinleri ifadesi ile görüntülenen kan damarları ile, bu tür araçlar diğer teleost türleri için mevcut. Kullanarak Medaka (Oryzias latipes) bir model olarak, mevcut protokol, beyin ve hipofiz kan damarları etiket ile fiksatif ile kalp aracılığıyla durumu ile hızlı ve doğrudan bir teknik sunar dıı. Bu protokol, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızın iyileştirilmesi sağlar.

Giriş

Tüm organlar için gerekli besin, oksijen ve hormonal sinyaller sağlamak gibi kan damarlarının omurga vücudun önemli bir parçası oynamak. Ayrıca, kanser gelişimi¹, onların katılımı keşif beri, onlar klinik araştırmalarda çok dikkat aldılar. Her ne kadar yayınlar bir dizi kan damarının büyümesi ve morfojenine izin veren mekanizmaları araştırmış olsa da, oluşumları için önemli olan çok sayıda gen tespit edilmiştir², bir lot etkileşimi ile ilgili anlaşılabilir kalır hücreler, dokular ve dolaşım kanı arasında.

Beyin ve hipofiz kan damar görselleştirme önemlidir. Beynin nöronlar oksijen ve glukoz³yüksek bir tedarik gerektirir ve hipofiz beyinden sinyal almak ve farklı kendi hormonları göndermek için kan akışını kullanan sekiz önemli hormon üreten hücre tipleri içerir Periferik organlar^4,5. Memelilerde ise, hipotalamus tabanında Portal sistemi Median Kardinal adlı, beyin ve hipofiz⁶bağlar, böyle bir açık kan Köprüsü teleost balık tarif edilmedi. Gerçekten de, teleosts, preoptico-hipotalamik nöronlar doğrudan hipofiz pars nervoza içine akons proje⁷ ve çoğunlukla farklı endokrin hücre türleri doğrudan invate^8,9. Ancak, bazı bu nöronların sinir uçları ekstrasküler uzayda bulunan, kan kapillaries yakın çevresinde¹⁰. Bu nedenle, teleost balık ve memeliler arasındaki fark o kadar açık değildir, ve kan damar ve beyin ve hipofiz hücreleri arasındaki ilişki teleost balık daha fazla soruşturma gerektirir.

Zebrafish, birçok yönden, anatomik ve fonksiyonel olarak karşılaştırılabilir damar sistemi diğer omurgacı türler¹¹vardır. Vasküler sistemin bileşenlerinin floresan muhabir proteinleri¹²ile etiketlendiği çeşitli transjenik hatların geliştirilmesi sayesinde kardiyovasküler araştırmalar için güçlü bir omurga modeli haline gelmiştir. Ancak, tam dolaşım sistemi anatomisi türler arasında, hatta aynı türe ait iki kişi arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, kan damarlarının görselleştirme nakliyle araçları mevcut olmayan diğer teleost türler de yüksek ilgi olabilir.

Çeşitli teknikler hem memeliler ve teleosts kan damarlarında etiket açıklanmıştır. Bu, damar spesifik genler için situ hibridizasyon dahil, alkalin fosfataz boyama, mikroanjiyografi, ve boya enjeksiyonları (bir inceleme için bakınız¹³). Floresan lipophilik katyonik indocarbocyanine boya (diI) ilk olarak lipid bilayers korunur ve bunu üzerinden göç edebilir membran lipidler lateral hareketlilik çalışması için kullanılan^14,15,16. Nitekim, dıı bir molekül iki hidrokarbon zincirleri ve chromophores oluşur. Hidrokarbon zincirleri ile temas hücrelerinde lipid fosfolipid hücre membranı entegre iken, chromophores yüzeyinde kalır¹⁷. Membranda, dıı molekülleri, DLI çözeltisi ile doğrudan temas etmeyen membran yapılarını lekeleymenize yardımcı olan lipid fosfolipid içinde lateral olarak diffdür. Kardiyak perfüzyon yoluyla bir dıı çözeltisi enjekte, bu nedenle kan damarlarının doğrudan etiketleme sağlayan bileşik ile temas tüm endotel hücreleri etiketleyecektir. Bugün dıı aynı zamanda tek molekül görüntüleme, kader haritalama ve nöronal izleme gibi diğer boyama amaçları için kullanılır. İlginçtir, çeşitli fluorophores var (emisyon farklı dalga boyları ile) Diğer Floresan etiketleri ile kombinasyon sağlayan, ve birleşme yanı sıra dıı lateral difüzyon hem canlı ve sabit dokularda oluşabilir^{18, 19 yaşında}.

1893 yılında Ferdinand Blum tarafından keşfedilen formaldehit, doku fikyasyonu için tercih edilen kimyasal olarak günümüze kadar yaygın olarak kullanılmıştır^20,21. Çoğu hücresel hedefler için geniş spesifisite gösterir ve hücresel yapısı^22,23korur. Aynı zamanda en fluorophores floresan özelliklerini korur, ve böylece hedeflenen hücreler floresan muhabir proteinleri ifade etmek için transgenik hayvanları sabitmek için kullanılabilir.

Bu yazıda, küçük deneysel memelilerde²⁴ kan damarları etiketlemek için geliştirilen bir önceki protokol balık kullanımına adapte edilmiştir. Tüm prosedür gerçekleştirmek için sadece birkaç saat sürer. Doğrudan beyin ve model balık Medaka hipofiz tüm kan damarlarını etiketlemek için balık kalbi dıı içeren formaldehit bir fixatif çözeltisi serpmek gösterilmiştir. Medaka Asya 'ya özgü küçük bir tatlı su balığı, öncelikle Japonya 'da bulundu. Bu bir araştırma modeli organizma ve moleküler ve genetik Araçlar²⁵kullanılabilir bir paketi ile. Bu nedenle, bu türün yanı sıra diğerlerinin yanı sıra kan damarlarının tanımlanması, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızı iyileştirmeye izin verecektir.

Protokol

Tüm hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi 'nde araştırma hayvanlarının bakımı ve refahı için tavsiyelerine göre ve yetkili müfettişlerin gözetiminde yapıldı.

1. enstrümanlar ve çözümlerin hazırlanması

1. Hazırlamak dıı stok solüsyonu çözünme 5 mg dıı kristal 1,5 mL plastik tüp ile 1 mL 96% EtOH. 30 s için Vortex ve alüminyum folyo kullanılarak kaplı tutun.
   Not: Dıı stok solüsyonu birkaç ay boyunca karanlıkta-20 °C ' de kullanılabilir.
2. Balık tutucusu hazırlayın (Şekil 1a) 5 cm uzunluğunda, 3 cm genişliğinde ve 2 cm kalınlığında bir polistiren parçasını keserek ve 9 cm çapında plastik bir tabak yapıştırarak. Polistiren bir neşter bıçağı ile 3 cm tekne şeklinde bir delik olun.
3. İğne ekstremite 30-50 cm uzunluğunda plastik kanül ekleyerek perfkullanma sistemi (Şekil 2) hazırlayın.
4. Hazırlamak 40 mL taze 4% paraformaldehit çözeltisi (PFA) ile seyreltilerek 10 mL 16% PFA ile 30 mL fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bir 50 mL plastik tüp.
5. 10 ml plastik tüpte 9 mL taze hazırlanmış 4% PFA olarak 1 mL dıı stok çözeltisi seyreltilerek 10 mL fixative/dıı çözeltisi hazırlayın. Kullanıma kadar karanlıkta tutun.
   Not: Çözülmüş olmayan dıı kristalleri stok çözüm tüpü tutulabilir, ve yeni etanol yeni dıı stok çözümü hazırlamak için eklenebilir (bkz. Adım 1,1).
6. Hazırlamak 50 mL tricaine (MS-222) stok.
   1. Çözülür 200 H₂O, 48 ml 'de tricaine toz mg. 2 ml 1 M Tris tabanı (pH 9) ekleyin. 1 M HCl ile pH 7 ' ye ayarlayın ve-20 °C ' de saklayın.
7. Küçük bir cam 50 mL temiz su içinde Tricaine stokta 5 mL seyreltmeli.
8. Üreticinin talimatlarını takiben bir pipet çektirme ile cam kapiller uzatarak 5 cm 'lik cam pipetleri (Şekil 2) hazırlayın.

2. diseksiyon ve perfüzyon

Not: PFA toksik uçucu bir bileşiktir, bu nedenle diseksiyon ve perfüzyon bir kaput veya havalandırmalı bir odada yapılmalıdır, ve Kullanıcı bir gaz maskesi giymelidir.

1. Diseksiyon öncesinde küçük makas ve bir keskin ve bir güçlü forseps dahil diseksiyon araçlarını hazırlayın.
2. 50 mL tüp içine yerleştirerek ve yukarı çizim, PFA/dıı hazırlanmış çözeltisi ile şırınga doldurun. Sonra iğneleri şırınganın ekstremite kanül ile yerleştirin (Şekil 2).
3. Farklı yönlere yerleştirilen bant birkaç parça kullanarak tezgah için şırınga Fix, mikroskopla konumunu ayarlamak ve diseksiyon için iyi bir pozisyon elde etmek ve şırınga piston basarak için koltuk (Şekil 1B).
   Not: Bu protokolde, dirsek şırınga pistonu aşağı basmak için kullanılır, ancak diğer olanaklar seçenekleri, örneğin, başka bir kişiden yardım kullanılabilir.
4. Adım 1,7 hazırlanan çözüme balık yerleştirerek tricaine aşırı doz ile balık euthanize. 30 s bekleyin ve forseps ile kaudal Fin kaparak balık refleksleri test edin. Balık, uyaranlara yanıt vermemeye çalışırken kullanılabilir.
5. Balık tutucusu ile karın yukarı dönük ve kafa ekstremite içine bir iğne pin ve kuyruk üzerinde başka bir yerde balık tutmak için balığı yerleştirin.
6. Yatay cildin yüzeysel tabakası keserek makas ile ön karın açın.
7. Forseps kullanarak, ventrikül ve bulbus arteriozus açık bir erişim sağlanıncaya kadar kalbin üstündeki cildi çıkarın (Şekil 3).
8. Kapiller ekstremite bir cam pipet ekleyin ve Cam Pipet ucunun ucunu kırın.
   Not: Kırık ucu delik yeterince sıvı dışarı izin büyük olmalıdır, ama hala yeterince kolayca doku girmek için küçük. Cam Pipet kırık veya tıkanmış değilse yeniden kullanılabilir.
9. Cam Pipet ventrikül yakın getirin ve sıvı dışarı zorlamak için dirsek ile şırınga pistonlu basınç ekleyin.
10. Şırınga basınç eklerken kalp ventrikül cam pipet ile pin.
11. Doğrudan sonra, kan dolaşımı bırakmak için forseps ile Sinüs Venozus Perforeli.
    Not: Kalp ventrikül, sabitleme nedeniyle daha kırılgan hale gelir. Ayrıca, kan fixative/dıı çözeltisi ile seyreltilmiş olarak daha az kırmızı olur.
12. Ventrikül gelen, bulbus arteriosus girişini bulmak için cam pipet açısını ayarlayın. Şekil 2' de görüldüğü gibi, pipet açılışını bulbus arteriozus içine getirin ve şırıngaya daha fazla basınç ekleyin.
    Not: Bulbus arteriozus saydamdır ve doku elastiktir. Dıı/fixative ile kan değiştirirken, kalbin içindeki Cam Pipet daha görünür hale gelir ve basınç ekleyerek, bulbus arteriozus boyutu genişletmek gerekir. Bu adım yeterli basınç fixative/dıı çözeltisi ile tüm kanı değiştirmek için kullanılan ve tüm kan damarlarına ulaşıldı emin olmak için çok önemlidir. Sıklıkla başarılı olduğunda, PFA kas kasılmaları provoke eder ve balık hareket edecektir.
13. 30-60 için şırıngaya basınç eklemeye devam edin, hala bulbus arteriosus içinde cam pipet tutuyor.
14. Cam Pipet ve iğneleri balıklardan çıkarın.
15. Beyin ve hipofiz incelemek ve oda sıcaklığında karanlıkta 2 h için PBS içinde taze% 4 PFA dokuları inkük.
    Not: Daha önce beyin ve hipofiz diseksiyonu Fontaine et al.²⁶ ve ager-Wick ve al.²⁷tarafından iki farklı şekilde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Sabitleme nedeniyle, doku oldukça zor hale gelir ve beyin ve hipofiz arasındaki kırılgan bağlantı kırık olabilir. Diseksiyon sonrası sabitleme işleme, 4 °C ' de bir gecede gerçekleştirilebilir.
16. Görüntüleme için hazırlanmadan önce 10 dakika boyunca PBS 'de dokusu iki kez durulayın.
    Not: Daha sonra doku, kaydırma ve kapak kayma arasında, konfeti görüntüleme için orta boşluklu ve montaj ortamına takılabilir (bkz. Şekil 4) veya Fontaine ve al.²⁶ ' da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi bir vibratomla kesilebilir bir stereomikoskop ile görüntüleme için slayt ve kapak slip (bkz. Şekil 4).

Sonuçlar

Bu protokol, Medaka beyin ve hipofiz kan damarlarında etiket için adım prosedür bir adım gösterir, ve aynı zamanda doku düzeltmek. , Kalp içine dıı içeren bir fikreatif çözelti kalp enjeksiyonu ile etiketleme sonra, kan damarlarında bir floresan stereomikoskop (Şekil 4) veya tüm doku üzerinde bir Konfokal mikroskop kullanarak dilim görülebilir (Şekil 5). Kalın doku dilimi veya tüm doku üzerinde ya da, kan damar mimarisi üç boyutta gör?...

Tartışmalar

Dıı ile kardiyak perfüzyon daha önce birkaç model türleri kan damarlarını etiket için kullanılan²⁴, teleost balık dahil¹³_.

Dıı doğrudan endotel hücre membranına damar içindeki perfüzyon ile teslim edildiği gibi, fixatif çözelti içinde dıı konsantrasyonu artırarak sinyal-gürültü oranını artırmak mümkündür. Buna ek olarak, fluorophore nispeten uzun ömürlü emisyon sağlayan minimal beyazlatma ile heyec...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL Syringe PP/PE without needle	Sigma	Z116866-100EA	syringes
BD Precisionglide syringe needles	Sigma	Z118044-100EA	needles 18G (1.20*40)
borosilicate glass 10cm OD1.2mm	sutter instrument	BF120-94-10	glass pipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D-282
LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm	Portex	800/110/340/100	canula
Phosphate Buffer Saline (PBS) solution	Sigma	D8537-6X500ML
pipette puller	Narishige	PC-10
plastic petri dishes	VWR	391-0442
Super glue gel	loctite	c4356
tricaine (ms-222)	sigma	E10521-50G