DiI による心灌流を用いた Teleost 脳および下垂体の血管の標識

要約

本稿は、DiI の心臓灌流を固定で希釈し、メダカ (Oryzias latipes) をモデルとして使用し、脳と下垂体組織に焦点を当てて、teleost 魚の血管を標識するための迅速なプロトコールについて説明する。

要約

血管は、脊椎動物のすべての組織を innervate し、必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供することによって生存を可能にします。それは開発の間に機能し始める最初の器官の1つである。血管形成のメカニズムは、高い科学的、臨床的関心の対象となっています。.しかし、成人では、他の組織の深部への局在のために、ほとんどの生物動物の血管系を可視化することは困難である。それにもかかわらず、内分泌学や神経生物などのいくつかの研究において、血管の可視化は依然として重要である。ゼブラフィッシュにはいくつかの遺伝子導入ラインが開発されていますが、蛍光タンパク質の発現によって血管が直接視覚化されるため、他の teleost 種にはそのようなツールは存在しません。モデルとしてメダカ (Oryzias latipes) を使用して、現在のプロトコルは、DiI を含む固定液と心臓を介して等量によって脳と下垂体の血管を標識するための迅速かつ直接的な技術を提示します。このプロトコルは、脳と下垂体細胞が全体の組織または厚い組織スライスにおける血液脈管系と相互作用する方法についての我々の理解を改善することができます.

概要

血管は、すべての臓器に必要な栄養素、酸素、ホルモンシグナルを提供するため、脊椎動物の身体に不可欠な役割を果たします。また、がん開発に関与していることが発見されて以来、臨床研究において注目を集めています。多くの刊行物が血管の成長と形態形成を可能にするメカニズムを調査しており、その形成に重要な多数の遺伝子が同定されているが、その相互作用に関しては多くの理解が残っている細胞または組織と循環血液との間。

脳と下垂体の血液血管系の可視化が重要です。.脳内のニューロンは、酸素とグルコース³の高い供給を必要とし、下垂体は、脳からの信号を受信し、異なるにそれぞれのホルモンを送信する血流を使用して8つの重要なホルモン産生細胞の種類が含まれています末梢器官^4,5.哺乳動物において、その中央値と称される視床下部の基部にある門脈システムは、脳と下垂体⁶とを結んでおり、このような明確な血中ブリッジは teleost 魚には記載されていない。実際には、魚類では、preoptico 視床下部ニューロンは直接下垂体⁷のパルスに軸索を投影し、主に異なる内分泌細胞の種類を直接^8、9に innervate。しかし、これらのニューロンのいくつかは、血管外空間に位置する神経終末を有し、毛細血管¹⁰に近接している。したがって、teleost の魚と哺乳類の違いはそれほど明確ではなく、血液の脈管構造と脳と下垂体細胞との間の関係は teleost 魚においてより大きな調査を必要とする。

ゼブラフィッシュは、多くの局面において、他の脊椎動物種¹¹に対して解剖学的および機能的に匹敵する血管系を有する。これは、血管系の成分が蛍光レポータータンパク質¹²で標識されているいくつかのトランスジェニック線の開発のおかげで主に心血管研究のための強力な脊椎動物モデルとなっている。しかし、正確な循環系の解剖学的構造は、種によって、あるいは同じ種に属する2人の個体間でも変化し得る。したがって、血管の可視化は、今後ツールが存在しない他の teleost 種においても高い関心を持つ可能性がある。

哺乳動物および魚類の両方で血管を標識するいくつかの技術が記載されている。これらには、脈管系特異的遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション、アルカリホスファターゼ染色、microangiography、および色素注射が含まれる (レビューについては¹³を参照)。蛍光性の脂溶性カチオン indocarbocyanine 色素 (DiI) は、脂質りん中に保持されている膜脂質横移動を研究するために最初に使用され、そしてそれを介して移行することができる^14,15,16.実際、DiI の分子は、2つの炭化水素鎖と発色団で構成されている。炭化水素鎖はそれに接触している細胞の脂質二重層細胞膜に統合されるが、発色団はその表面¹⁷上に残る。一度膜に、DiI 分子は、DiI 溶液と直接接触していない膜構造を染色するのに役立つ脂質二重層内に横方向に拡散します。心臓灌流によって DiI 溶液を注入すると、化合物と接触しているすべての内皮細胞に標識し、血管の直接標識を可能にする。今日 DiI は、単一分子イメージング、運命のマッピング、ニューロンのトレースなどの他の染色の目的にも使用されます。興味深いことに、いくつかの蛍光色素が存在し (異なる波長の発光)、他の蛍光標識との組み合わせを可能にし、DiI の横方向の拡散とともに、ライブおよび固定組織¹⁸の両方で発生する可能性があります。¹⁹.

ホルムアルデヒドは、1893年にフェルディナンド・ブルームによって発見され、組織固定^20,21のための好ましい化学物質として現在の日に広く使用されるようになった。それはほとんどの細胞のターゲットのための広い特異性を示し、細胞構造^22,23を維持する。また、ほとんどの蛍光色素の蛍光特性を保持しているため、標的細胞が蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニック動物の固定に使用することができます。

この原稿においては、小実験哺乳動物モデル²⁴における血管を標識するために開発された以前のプロトコルは、魚類における使用に適合している。手順全体を実行するには数時間しかかかりません。これは、直接脳内のすべての血管とモデル魚のメダカの下垂体にラベルを付けるために魚の心臓に DiI を含むホルムアルデヒドの定着性溶液を perfuse する方法を示しています。メダカはアジア原産の小さな淡水魚で、主に日本で見られます。これは、利用可能な分子および遺伝学的ツールのスイートと研究モデルの生物であります²⁵.したがって、この種だけでなく、他の人における血管の同定は、脳と下垂体細胞が全体の組織または厚い組織スライス中の血液脈管系と相互作用する方法についての我々の理解を改善することを可能にする。

プロトコル

すべての動物の取り扱いは、ノルウェー生命科学大学の研究動物のケアと福祉のための勧告に従って行われ、認定研究者の監督下にありました。

1. 機器とソリューションの準備

1. 1 mL の 96% Etoh 中で 1.5 mL プラスチックチューブに DiI 結晶の DiI を溶解させる。30 s のための渦およびアルミニウムホイルを使用して覆われ続ける。
   注:DiI 原液は、数ヶ月間、-20 ° c で暗所で保存することができます。
2. ポリスチレンの小片を5cm の長さ、3cm の幅、および2cm の厚さに切断し、直径9cm のプラスチック皿に接着することによって、魚のホルダー (図 1A) を準備します。ポリスチレンのメスの刃が付いている3cm のボート型の穴を作りなさい。
3. 針の先端に 30-50 cm の長いプラスチックカニューレを加えて、等量システム (図 2) を準備します。
4. 50 mL のプラスチックチューブに、30 mL のリン酸緩衝食塩水溶液 (PBS) で 16% PFA を 10 mL 希釈して、40 mL のフレッシュ 4% パラホルムアルデヒド溶液 (PFA) を調製します。
5. DiI の原液 1 mL を 10 mL のプラスチックチューブに新しく調製した 4% PFA を 9 mL に希釈して、10 mL の固定液/DiI 溶液を調製します。使用するまで暗闇の中で保管してください。
   注:溶解されていない DiI 結晶は、原液チューブに保持することができ、新しいエタノールは、新しい DiI ストック溶液を調製するために追加することができます (ステップ1.1 を参照)。
6. 50 mL の tricaine (MS-222) ストックを準備します。
   1. 溶解 200 mg の Tricaine 粉末を 48 mL の H₂O. 1 M トリスベース (pH 9) の 2 Ml を追加します。1 M HCl で pH 7 に調整し、-20 ° c で保管してください。
7. 小さいガラスのきれいな水の 50 mL の Tricaine の在庫の5つの mL を希薄にしなさい。
8. メーカーの指示に従ってピペットの引き手とガラス毛細管を伸ばすことによって、いくつかの5cm ガラスピペット (図 2) を準備します。

2. 解剖および灌流

注:PFA は有毒な揮発性化合物であるため、解剖および灌流は、フードまたは換気の良い場所で行う必要があり、ユーザーはガスマスクを着用している必要があります。

1. 小さいはさみを含む解剖用具、および1つの鋭いおよび1強い鉗子を解剖の前に準備しなさい。
2. 50 mL チューブに配置することにより、PFA/DiI の調製溶液でシリンジを充填し、上に描画します。次に、シリンジの先端にカニューレを付けて針を置きます (図 2)。
3. 異なる方向に配置されたテープのいくつかの部分を使用して、ベンチにシリンジを固定し、解剖のための良好な位置を取得するために、シートの位置を調整し、シリンジのピストンを押します (図 1B)。
   注:このプロトコルでは、肘は、シリンジのピストンを押すために使用されますが、他の可能性のオプション、例えば、他の人からの支援を使用することができます。
4. Euthanize は、ステップ1.7 で調製した溶液中に魚を置くことによって、tricaine の過剰摂取で魚を投与する。30 s を待って、鉗子とその尾ひれをつかむことによって、魚の反射をテストします。この魚は、刺激に反応しなくなったときに使用することができます。
5. 魚をその腹部を上に向けて、1本の針を頭の先端に、もう1つを尾の上に固定して魚を所定の位置に保つ。
6. 皮膚の表層を水平に切断することによって、はさみで前腹部を開きます。
7. 鉗子を使用して、心室と bulbus 管への明確なアクセスが提供されるまで、心臓の上の皮膚を取り除いてください (図 3)。
8. ガラスピペットを毛細管の先端に加え、ガラスピペットの先端の端を破ります。
   注:壊れた先端の穴は液体を出すのに十分な大きさであるべきですが、それでも組織に入るには十分に小さいです。ガラス製ピペットは、壊れたり詰まったりしていなければ再利用できます。
9. ガラスピペットを心室に近づけ、肘を使って注射器のピストンに圧力をかけて液体を出します。
10. 心臓心室をガラスピペットで固定し、シリンジに圧力を加えます。
11. 直後に、ソトー氏を鉗子と venosus し、血液が循環を残すことを可能にする。
    注:心臓心室は定着性のためにより脆くなる。また、血液が定着/DiI 溶液で希釈されるほど、赤色になります。
12. 心室から、ガラスピペットの角度を調節して、bulbus 管の入口を見つけます。図 2に示すように、bulbus 管の内側にピペットの開口部を持ってきて、シリンジに圧力を加えます。
    注:Bulbus 管は透明であり、ティッシュは伸縮性がある。DiI/固定液で血液を交換するときは、心臓の内側のガラスピペットがより見やすくなり、圧力を加えることにより、bulbus 管のサイズが拡大するはずです。このステップは、固定液/DiI 溶液ですべての血液を置換するのに十分な圧力が使用されていること、およびすべての血管が到達したことを確認するために不可欠です。しばしば成功すると、PFA は筋肉の収縮を引き起こし、魚は移動します。
13. Bulbus 管の中のガラスピペットをまだ保っている 30-60 s のためのスポイトの圧力を加え続けなさい。
14. ガラスピペットと魚の針を取り外します。
15. 脳と下垂体を解剖し、室温で暗所で 2 h の PBS に 4% の新鮮な PFA で組織をインキュベートします。
    注:脳および下垂体の解剖は、以前は、フォンテーヌ et al.²⁶およびエージャー et al.²⁷によって2つの異なる方法で詳細に説明されている。固定のために、組織はかなり硬くなり、脳と下垂体との間の脆弱なリンクが壊れることがあります。解離後、後固定処理も4° c で一晩実行することができる。
16. イメージングの準備をする前に、PBS で10分間組織を2回すすいでください。
    注:次に、この組織を、共焦点イメージング用の取り付け媒体との間にスペーサーを備えたスライドとカバースリップの間にマウントし (図 4を参照)、または、間に取り付ける前にフォンテーヌ et al.²⁶で詳細に説明したようにビブラトームで断面化することができる。実体顕微鏡を使用したイメージング用のスライドとカバースリップ (図 4を参照)。

結果

このプロトコルは、メダカの脳と下垂体の血管を標識し、同時に組織を固定するための段階的な手順を示しています。DiI を含む固定液の心臓注射によって心に標識した後、蛍光実体顕微鏡 (図 4) または共焦点顕微鏡を用いた組織全体に血管を観察することができる (図 5)。厚い組織スライスまたは組織全体のいずれかに、血液脈管構造のアーキテ?...

ディスカッション

DiI を用いた心臓灌流は、以前は、teleost 魚¹³を含むいくつかのモデル種²⁴において血管を標識するために使用されてきた_。

DiI が脈管系において灌流によって内皮細胞膜に直接送達されるように、固定液中の DiI 濃度を増加させることによってシグナル対雑音比を増加させることができる。さらに、蛍光色素分子は、最小限の漂?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL Syringe PP/PE without needle	Sigma	Z116866-100EA	syringes
BD Precisionglide syringe needles	Sigma	Z118044-100EA	needles 18G (1.20*40)
borosilicate glass 10cm OD1.2mm	sutter instrument	BF120-94-10	glass pipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D-282
LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm	Portex	800/110/340/100	canula
Phosphate Buffer Saline (PBS) solution	Sigma	D8537-6X500ML
pipette puller	Narishige	PC-10
plastic petri dishes	VWR	391-0442
Super glue gel	loctite	c4356
tricaine (ms-222)	sigma	E10521-50G