הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

Summary

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

Abstract

כלי הדם מinnervate את כל הרקמות בחוליות, ומאפשרים את הישרדותה על ידי מתן החומרים המזינים, החמצן והאותות ההורמונליים הנחוצים. זהו אחד האיברים הראשונים להתחיל לתפקד במהלך הפיתוח. מנגנונים של היווצרות כלי הדם הפכו להיות נושא של עניין מדעי וקליני גבוה. אצל מבוגרים עם זאת, קשה לדמיין את היום ברוב חיות החיים בשל הלוקליזציה שלהם עמוק בתוך רקמות אחרות. עם זאת, הדמיה של כלי הדם ממשיכה להיות חשובה למספר מחקרים כגון אנדוקרינולוגיה ונוירוביולוגיה. בעוד כמה קווים טרנסגניים פותחו ב zebrafish, עם כלי הדם לדמיין ישירות דרך הביטוי של חלבונים פלורסנט, אין כלים כאלה קיימים עבור מינים teleost אחרים. הפרוטוקול הנוכחי מציג טכניקה מהירה וישירה כדי לתייג כלי דם במוח ובבלוטת יותרת, באמצעות השימוש בשיטת "הצדקה" (Oryzias) כמודל. פרוטוקול זה מאפשר שיפור של ההבנה שלנו על איך בתאי המוח ובלוטת ההיפופיזה לקיים אינטראקציה עם דם ובללטורה ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

Introduction

כלי הדם משחקים חלק חיוני של הגוף בעלי החוליות כפי שהם מספקים את החומרים המזינים הדרושים, חמצן ואותות הורמונליים לכל האיברים. גם, מאז התגלית של המעורבות שלהם בפיתוח סרטן¹, הם קיבלו הרבה תשומת לב במחקר קליני. למרות שמספר פרסומים חקרו את המנגנונים המאפשרים צמיחה של כלי דם ומורפולגנזה, ומספר רב של גנים חשובים להיווצרות שלהם זוהו², הרבה נשאר להבין בקשר לאינטראקציה בין תאים או רקמות לדם מחזורי.

, ויזואליזציה של דם ובלוטת יותרת המוח. זה חשוב נוירונים במוח דורשים אספקת גבוהה של חמצן וגלוקוז³, ואת בלוטת ההיפופיזה מכיל עד שמונה סוגי תאים חשובים הורמון מייצר המשתמשות זרימת הדם כדי לקבל אות מהמוח ולשלוח הורמונים שלהם שונים איברים היקפיים^4,5. בעוד ביונקים, מערכת הפורטל בבסיס של ההיפותלמוס בשם הוד רוממותו, מקשרת את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה⁶, כגון גשר דם ברור לא תוארה ב teleost דגים. אכן, ב teleosts, preoptico-הנוירונים היפוטתלמי ישירות פרויקט אקסונים שלהם לתוך pars נרבוזה של בלוטת יותרת⁷ ובעיקר innervate סוגי תאים האנדוקרינית שונים ישירות^8,9. עם זאת, כמה נוירונים אלה יש קצות העצבים שלהם ממוקם בחלל extravascular, בקרבת מקום נימים בדם¹⁰. לכן, ההבדל בין הדגים teleost ויונקים הוא לא כל כך ברור, ואת הקשר בין הדם ובדיקת המוח ואת התאים בלוטת ההיפופיזה דורש חקירה גדולה יותר של הדגים teleost.

Zebrafish יש, בהיבטים רבים, מערכת כלי דם המקבילה מבחינה אנטומית ופונקציונלית למינים אחרים בעלי חוליות¹¹. זה הפך למודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור מחקר לב וכלי דם בעיקר בזכות הפיתוח של קווים טרנסגניים מספר שבו מרכיבים של מערכת כלי הדם מסומנים עם חלבונים כתבת פלורסנט¹². עם זאת, אנטומיה מדויקת של מערכת הדם עשויה להשתנות בין מינים, או אפילו בין שני אנשים השייכים לאותו מינים. לכן, הדמיה של כלי הדם עשויה להיות בעלת עניין רב גם במינים אחרים של teleost שבהם כלים טרנסגנזה אינם קיימים.

מספר טכניקות תוארו לתייג כלי דם בשני היונקים והטלאוסטים. אלה כוללים היברידיזציה באתרו עבור גנים ספציפיים ואסילטורה, כתמים הזרחן אלקליין, microangiography, וזריקות צבע (עבור סקירה ראה¹³). ליפולי פלורסנט indocarbocyanine צבען (dii) השתמשו לראשונה כדי ללמוד ממברנה לאורך ניידות לרוחב כפי שהוא נשמר bilayers ליפיד והוא יכול להעביר דרך זה^14,15,16. ואכן, מולקולה של DiI מורכבת משתי שרשראות פחמנים וכרומואופהורס. בעוד שרשראות פחממים לשלב את קרום התא bilayer השומנים של התאים במגע עם זה, ראשון להישאר על פני השטח שלה¹⁷. פעם אחת בקרום, מולקולות DiI לפזר בתוך השומנים bilayer שעוזר להכתים מבנים ממברנה כי הם לא במגע ישיר עם פתרון DiI. הזרקת פתרון DiI דרך הפרזיה לב, ולכן מתייג את כל תאי האנדותל במגע עם התרכובת המאפשרת תיוג ישיר של כלי הדם. היום DiI משמש גם למטרות כתמים אחרים, כגון הדמיה מולקולה אחת, מיפוי הגורל, ומעקב עצבי. מעניין, מספר fluorophores קיים (עם אורכי גל שונים של פליטה) המאפשר את השילוב עם תוויות פלורסנט אחרות, ואת התאגדות, כמו גם את הדיפוזיה לרוחב של DiI יכול להתרחש הן לחיות וקבוע רקמות^{18, . בן 19}

פורמלדהיד, התגלה על ידי פרדיננד בלום ב-1893, שימש באופן נרחב ליום הנוכחי ככימיקל המועדף לקיבוע רקמות^20,21. הוא מראה ספציפיות למרבית היעדים הסלולאריים ומשמר את המבנה התאי^22,23. הוא גם שומר על תכונות פלורסנט של רוב fluorophores, ובכך ניתן להשתמש כדי לקבוע בעלי חיים טרנסגניים שבהם תאים ממוקדות לבטא העיתונאי פלורסנט חלבונים.

בכתב יד זה, פרוטוקול קודם שפותח כדי לתייג כלי דם בדגמי יונקים קטנים וניסיוניים²⁴ הותאם לשימוש בדגים. ההליך כולו לוקח רק כמה שעות לבצע. זה מדגים כיצד לעשות פתרון קבע של פורמלדהיד המכיל dii בלב הדג כדי לתייג ישירות את כל כלי הדם במוח ואת בלוטת ההיפופיזה של הדג המודל הצדקה. מאקה הוא דג מים מתוקים קטן יליד אסיה, שנמצא בעיקר ביפן. זה אורגניזם מודל מחקר עם חבילה של כלים מולקולריים וגנטיים זמינים²⁵. לכן, זיהוי כלי הדם במין זה כמו גם באחרים יאפשר לשפר את ההבנה שלנו על איך המוח ואת התאים בבלוטת ההיפופיזה אינטראקציה עם דם ובלוטת הדם ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים התבצע על פי המלצות הטיפול והרווחה של בעלי חיים מחקריים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מוסמכים.

1. הכנת המכשירים והפתרונות

1. להכין פתרון מלאי DiI המסת 5 מ"ג של קריסטל DiI ב 1.5 mL שפופרת פלסטיק עם 1 מ ל של 96% אטוח. מערבולת עבור 30 ולהמשיך לכסות באמצעות רדיד אלומיניום.
   הערה: פתרון המניה DiI ניתן לשימור בחשיכה ב-20 ° c במשך מספר חודשים.
2. הכן את מחזיק הדגים (איור 1א) על-ידי גזירה של פוליסטירן לאורך של 5 ס מ, רוחב 3 ס"מ, ו-2 ס מ עובי, ומדביק אותו לצלחת פלסטיק בקוטר 9 ס מ. הפוך חור בצורת סירה בגודל 3 ס מ עם להב אזמל בפוליסטירן.
3. הכן מערכת מבשם (איור 2) על-ידי הוספת צינורית פלסטיק באורך 30-50 ס מ בקצה המחט.
4. הכינו 40 mL של טרי 4% הפתרון פאראפורמלדהיד (בתחתית) על ידי דילול 10 מ ל של 16% בתחתית עם 30 מ ל של פוספט באגירה תמיסת מלח (PBS) בצינור פלסטיק 50 mL.
5. הכינו 10 מ ל של פתרון fixative/DiI על ידי דילול 1 מ ל של פתרון מלאי DiI ב 9 מ ל של טרי מוכן 4% כלטין בצינור פלסטיק 10 mL. . שמור באפלה עד השימוש
   הערה: גבישים DiI כי הם לא מומס ניתן לשמור בצינור פתרון המניה, אתנול חדש ניתן להוסיף כדי להכין פתרון מלאי חדש DiI (ראה שלב 1.1).
6. להכין 50 mL של tricaine (MS-222) מניות.
   1. התמוססות 200 מ"ג של אבקת Tricaine ב 48 מ ל של H₂O. Add 2 mL של 1 M בסיס טריס (pH 9). התאם ל-pH 7 עם HCl 1 M וחנות ב-20 ° c.
7. לדלל 5 מ ל של מלאי Tricaine ב 50 mL של מים נקיים בזכוכית קטנה.
8. הכינו מספר ברטט זכוכית בגודל 5 ס מ (איור 2) על ידי מתיחת נימי זכוכית עם פולר פיפטה בעקבות הוראות היצרן.

2. חיתוך ופרזיה

הערה: למעלה הוא תרכובת הפכפכה רעילה, ולכן יש לבצע את הניתוח והפרזיה במכסה המנוע או בחדר מאוורר, והמשתמש חייב לענוד מסכת גז.

1. הכינו את כלי החיתוך, כולל מספריים קטנים, ומלקחיים חזקים וחד אחד לפני הניתוח.
2. מלאו את המזרק בתמיסה המוכנה של הלגון/DiI על-ידי הצבתו בשפופרת 50 mL ורישום למעלה. ואז הניחו את המחט בצינורית בקצה המזרק (איור 2).
3. לתקן את המזרק על הספסל באמצעות כמה פיסות קלטת להציב בכיוונים שונים, להתאים את המיקום של המיקרוסקופ ואת המושב כדי לקבל עמדה טובה לניתוח ולחיצה על המזרק בוכנה (איור 1B).
   הערה: בפרוטוקול זה, המרפק משמש כדי להקיש את המזרק בוכנה, אבל אפשרויות אחרות ניתן להשתמש, למשל, סיוע מאדם אחר.
4. המתת חסד הדג עם מנת יתר של tricaine ידי הצבת הדג בפתרון הכין בשלב 1.7. לחכות 30 s ולבדוק את הרפלקסים של הדג על ידי לתפוס את הפין שלה caudal עם מלקחיים. ניתן להשתמש בדגים כאשר הוא מפסיק להגיב לגירויים.
5. מניחים את הדג במחזיק הדג עם הבטן שלו מול ולהצמיד מחט אחת לתוך הקצה של הראש ועוד אחד מעל הזנב כדי לשמור את הדג במקום.
6. פתח את הבטן הקדמית עם המספריים על ידי גזירה אופקית של שכבת העור השטחית.
7. באמצעות מלקחיים, להסיר את העור מעל הלב עד הגישה ברורה אל החדר ואת הריוסוס בולבוס מסופק (איור 3).
8. הוסיפו פיפטה מזכוכית בקצות הקפילר ושוברים את סוף קצהו של פיפטה הזכוכית.
   הערה: החור של קצה שבור צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר את הנוזל החוצה, אבל עדיין קטן מספיק כדי להיכנס בקלות את הרקמה. ניתן להשתמש בצנרת הזכוכית אם לא נשברה או סתומה.
9. הביאו את פיפטה הזכוכית קרוב לחדר והוסיפו לחץ למזרק בוכנה עם המרפק כדי לאלץ את הנוזל לצאת.
10. הצמד את חדר הלב עם הצנרת זכוכית תוך הוספת לחץ על המזרק.
11. מיד לאחר מכן, נקב venosus סינוס עם מלקחיים כדי לאפשר לדם לעזוב את זרימת הדם.
    הערה: חדר הלב הופך להיות שברירי יותר בגלל הקיבעון. זה גם הופך להיות פחות אדום כמו הדם הוא מדולל עם פתרון fixative עצמי/DiI.
12. מחדר החדר, התאימו את זווית הפיפטה של הזכוכית כדי למצוא את הכניסה של הריוסוס הבולבוס. הביאו את הפיפטה שנפתח בתוך הריויוסוס, כמוצג באיור 2, והוסיפו עוד לחץ למזרק.
    הערה: הריוסוס הבולבוס הוא שקוף והרקמה גמישה. בעת החלפת דם עם DiI/fixative, הצנרת זכוכית בתוך הלב צריך להיות גלוי יותר על ידי הוספת לחץ, הגודל של בולבוס הריוסוס צריך להתרחב. שלב זה חיוני כדי לוודא כי הלחץ מספיק שימש כדי להחליף את כל הדם עם פתרון fixative/DiI, וכי כל כלי הדם הושגו. לעתים קרובות כאשר מוצלחת, הלבלבין הכפילה מעוררת התכווצויות שרירים הדג יהיה לנוע.
13. להמשיך להוסיף לחץ על המזרק עבור 30-60 s עדיין שמירה על הצנרת זכוכית בתוך הריוסוס בולבוס.
14. הסירו את הפיפטה מזכוכית. ואת המחטים מהדגים
15. מנתחים את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה, ורקמות הדגירה ב-4% בכיוון השני ב PBS עבור 2 h בחושך בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתוח מוחי ובלוטת יותרת המוח בעבר תואר בפירוט בשתי דרכים שונות מאת פונטיין ואח '²⁶ ואגר-Wick ואח '²⁷. בגלל הקיבעון, הרקמה הופכת קשה למדי והקשר שברירי בין המוח לבלוטת יותרת ההיפופיזה עלול להישבר. לאחר הניתוח ניתן גם לבצע עיבוד קיבעון לילה ב -4 ° c.
16. שטפו את הרקמה פעמיים ב-PBS במשך 10 דקות לפני ההכנה להדמיה.
    הערה: לאחר מכן ניתן לטעון את הרקמה בין שקופית לכריכה כיסוי עם מרווחים בין ובין הרכבה בינונית לדימות ממוקד (ראה איור 4), או שנות מנות עם הרטט כמתואר בפירוט בפונטיין ואח '²⁶ לפני ההרכבה בין שקופית ושובר כיסוי לדימות עם stereomicroscope (ראה איור 4).

תוצאות

פרוטוקול זה מדגים הליך צעד אחר צעד כדי לתייג את כלי הדם במוח מאקה ובלוטת היותרת, ובאותו זמן לתקן את הרקמה. לאחר תיוג על ידי הזרקה לב של פתרון קבע המכיל dii ללב, כלי הדם ניתן לצפות על פרוסות באמצעות stereomicroscope פלורסנט (איור 4) או על רקמות שלמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (

Discussion

הפרזיה לב עם DiI בעבר השתמשו כדי לתייג כלי דם במספר מיני דגם²⁴, כולל teleost דגים¹³_.

כפי dii מועברת ישירות קרום התא אנדותל על ידי זלוף ב vasculature ניתן להגדיל את היחס אות אל הרעש על ידי הגברת ריכוז dii בפתרון הקבע. בנוסף, fluorophore מספק מכתים אינטנסיבי כאשר מתרג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL Syringe PP/PE without needle	Sigma	Z116866-100EA	syringes
BD Precisionglide syringe needles	Sigma	Z118044-100EA	needles 18G (1.20*40)
borosilicate glass 10cm OD1.2mm	sutter instrument	BF120-94-10	glass pipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D-282
LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm	Portex	800/110/340/100	canula
Phosphate Buffer Saline (PBS) solution	Sigma	D8537-6X500ML
pipette puller	Narishige	PC-10
plastic petri dishes	VWR	391-0442
Super glue gel	loctite	c4356
tricaine (ms-222)	sigma	E10521-50G