Маркировка кровеносных сосудов в телемост мозга и гипофиза использованием сердечной перфузии с DiI-фиксативный

Резюме

В статье описывается быстрый протокол для маркировки кровеносных сосудов в телеост рыбы сердечной перфузии DiI разбавленной в фиксаторе, используя medaka (Oryzias latipes) в качестве модели и упором на мозг и гипофиз ткани.

Аннотация

Кровеносные сосуды иннервируют все ткани у позвоночных, позволяя их выживание, обеспечивая необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы. Это один из первых органов, чтобы начать функционировать во время развития. Механизмы формирования кровеносных сосудов стали предметом высокого научного и клинического интереса. У взрослых, однако, трудно визуализировать сосуды в большинстве живых животных из-за их локализации глубоко в других тканях. Тем не менее, визуализация кровеносных сосудов остается важным для нескольких исследований, таких как эндокринология и нейробиология. В то время как несколько трансгенных линий были разработаны в зебрафиш, с кровеносными сосудами непосредственно визуализированы через экспрессию флуоресцентных белков, нет таких инструментов существуют для других видов телеост. Использование medaka (Oryzias latipes) в качестве модели, текущий протокол представляет собой быструю и прямую технику для обозначения кровеносных сосудов в мозге и гипофиза, наполнив через сердце с фиксатором, содержащим DiI. Этот протокол позволяет улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.

Введение

Кровеносные сосуды играют важную часть тела позвоночных, поскольку они обеспечивают необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы для всех органов. Кроме того, с момента открытия их участия в развитии рака¹, они получили большое внимание в клинических исследованиях. Хотя ряд публикаций исследовали механизмы, позволяющие рост кровеносных сосудов и морфогенез, и большое количество генов, важных для их формирования были определены², многое еще предстоит понять в отношении взаимодействия между клетками или тканями и циркулирующей кровью.

Визуализация сосудов крови в головном мозге и гипофиза имеет важное значение. Нейроны в головном мозге требуют высокой поставки кислорода и глюкозы³, и гипофиза содержит до восьми важных гормонов-производящих типов клеток, которые используют кровоток, чтобы получать сигнал от мозга и отправить свои гормоны в различные периферийные органы^4,5. В то время как у млекопитающих, порталная система в основании гипоталамуса имени среднего выдающего, связывает мозг и гипофиз⁶, такой ясный мост крови не был описан в телеост рыбы. Действительно, в teleosts, преоптико-гипоталамические нейроны непосредственно проект их аксоны в парс нервной гипофиза⁷ и в основном innervate различных типов эндокринных клеток непосредственно^8,9. Тем не менее, некоторые из этих нейронов имеют свои нервные окончания, расположенные во внесосудистом пространстве, в непосредственной близости от капилляров крови¹⁰. Таким образом, разница между телеост рыбы и млекопитающих не так ясно, и связь между сосудами крови и мозга и гипофиза клетки требует большего изучения в телеост рыбы.

Зебрафиш имеет, во многих аспектах, анатомически и функционально сопоставимы сосудистой системы с другими видами позвоночных¹¹. Он стал мощной моделью позвоночных для сердечно-сосудистых исследований в основном благодаря развитию нескольких трансгенных линий, где компоненты сосудистой системы помечены флуоресцентными белками репортера^12. Тем не менее, точная анатомия системы кровообращения может варьироваться между видами, или даже между двумя лицами, принадлежащими к тому же виду. Таким образом, визуализация кровеносных сосудов может представлять большой интерес и в других видах телеост, для которых трансгенез инструменты не существуют.

Несколько методов были описаны для обозначения кровеносных сосудов у млекопитающих и телеост. К ним относятся на месте гибридизации для сосуд-специфических генов, щелочной фосфатазы окрашивания, микроангиографии, и красителя инъекции (для обзора см.¹³). Флуоресцентные липофильные катионные инокарбоциановые красители (DiI) был впервые использован для изучения боковых подвижности мембранных липидов, поскольку он сохраняется в липидных двуслойных и может мигрировать через него^14,15,16. Действительно, молекула DiI состоит из двух углеводородных цепей и хромофоров. В то время как углеводородные цепи интегрируются в липидную двухслойную клеточную мембрану клеток клеток, соприкасающихся с ним, хромофоры остаются на его поверхности^17. Оказавшись в мембране, молекулы DiI рассеиваются боково внутри липидного двухслойного, который помогает запятнать мембранные структуры, которые не находятся в непосредственном контакте с раствором DiI. Инъекция раствора DiI через перфузию сердца, поэтому пометить все эндотелиальные клетки в контакте с соединением, позволяющим прямой маркировки кровеносных сосудов. Сегодня DiI также используется для других целей окрашивания, таких как одномолекулярная визуализация, картирование судьбы и отслеживание нейронов. Интересно, что существует несколько флюорофоров (с различными длинами волн эмиссии), что позволяет сочетание с другими флуоресцентными этикетками, и включение, а также боковое распространение DiI может произойти как в живых, так и в фиксированных тканях^{18, 19}.

Формальдегид, обнаруженный Фердинандом Блюмом в 1893 году, широко используется по сей день в качестве предпочтительного химического вещества для фиксации тканей^20,21. Он показывает широкую специфику для большинства клеточных целей и сохраняет клеточную структуру^22,23. Он также сохраняет флуоресцентные свойства большинства флуорофоров, и, таким образом, может быть использован для фиксации трансгенных животных, для которых целевые клетки выражают флуоресцентные белки репортера.

В этой рукописи предыдущий протокол, разработанный для обозначения кровеносных сосудов в небольших экспериментальных моделях млекопитающих^24, был адаптирован к использованию в рыбе. Вся процедура занимает всего пару часов. Он демонстрирует, как пронизать фиксаторный раствор формальдегида, содержащего DiI в сердце рыбы для того, чтобы непосредственно пометить все кровеносные сосуды в головном мозге и гипофиза модели рыбы medaka. Медака - маленькая пресноводная рыба, произрастая в Азии, в основном в Японии. Это исследовательская модель организма с набором молекулярно-генетических инструментов, доступных²⁵. Таким образом, идентификация кровеносных сосудов у этого вида, а также в других позволит улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.

протокол

Все обращение с животными осуществлялось в соответствии с рекомендациями по уходу и благополучию научных животных в Норвежском университете наук о жизни и под наблюдением уполномоченных следователей.

1. Подготовка инструментов и решений

1. Приготовьте растворимый растворение 5 мг кристалла DiI в пластиковой трубке объемом 1,5 мл с 1 мл 96% EtOH. Vortex для 30 с и держать покрыты с использованием алюминиевой фольги.
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Раствор запасов DiI можно консервировать в темноте при -20 градусов в течение нескольких месяцев.
2. Приготовьте держатель рыбы(рисунок 1А), разрезав кусок полистирола до 5 см в длину, шириной 3 см и толщиной 2 см, и приклеив его к пластиковой тарелке диаметром 9 см. Сделайте 3 см лодочного отверстия с скальпелем лезвием в полистирола.
3. Подготовьте проницательное систему(рисунок 2), добавив пластиковую канюлю длиной 30-50 см в конечности иглы.
4. Приготовьте 40 мл свежего 4% раствора параформальдегида (PFA), разбавив 10 мл 16% ПФА с 30 мл фосфатного буферного солейного раствора (PBS) в пластиковой трубке 50 мл.
5. Приготовьте 10 мл из фиксаторного/DiI раствора, разбавив 1 мл бульонного раствора DiI в 9 мл свежеприготовленного 4% PFA в пластиковой трубке объемом 10 мл. Держите в темноте до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Кристаллы DiI, которые не растворяются, могут храниться в трубе сстокового раствора, а новый этанол может быть добавлен для подготовки нового решения для акций DiI (см. шаг 1.1).
6. Приготовьте 50 мл троса трикаина (МС-222).
   1. Растворите 200 мг порошка трикаина в 48 мл H₂O. Добавить 2 мл 1 М Трис базы (pH 9). Отрегулируйте к pH 7 с 1 M HCl и храните на -20 C.
7. Разбавить 5 мл троса трикаина в 50 мл чистой воды в небольшом стакане.
8. Приготовьте несколько стеклянных пипеток 5 см(рисунок 2), растягивая стеклянный капилляр с помощью выдвижного пипетки, следуя инструкциям производителя.

2. Рассечение и перфузия

ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ ПФА является токсичным летучим соединением, поэтому вскрытие и перфузия должны выполняться в капюшоне или в проветриваемой комнате, и пользователь должен носить противогаз.

1. Подготовьте инструменты вскрытия, включая небольшие ножницы, и один острый и один сильный щипцы перед вскрытием.
2. Заполните шприц подготовленным раствором PFA/DiI, поместив его в трубку 50 мл и сформируя. Затем поместите иглу с канюлей в конечности шприца(рисунок 2).
3. Закрепите шприц на скамейке, используя несколько кусков ленты, размещенной в разных направлениях, отрегулируйте положение микроскопа и сиденья, чтобы получить хорошее положение для вскрытия и для нажатия шприца поршень (Рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ В этом протоколе локоть используется для нажатия на поршень шприца, но могут быть использованы другие варианты возможностей, например, помощь другого человека.
4. Эвтанизировать рыбу с передозировкой трикаина, поместив рыбу в раствор, приготовленный в шаге 1.7. Подождите 30 с и проверить рефлексы рыбы, захватив его каудальный плавник с щипками. Рыба может быть использована, когда она перестала реагировать на раздражители.
5. Поместите рыбу в держатель рыбы с животом вверх и приколоть одну иглу в конечности головы и еще один над хвостом, чтобы держать рыбу на месте.
6. Откройте передний живот ножницами, горизонтально разрезая поверхностный слой кожи.
7. Используя щипцы, удалите кожу над сердцем, пока не будет обеспечен четкий доступ к желудочку и артериозу bulbus(рисунок 3).
8. Добавьте стеклянную пипетку в конечности капилляра и разбейте конец кончика стеклянной пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Отверстие сломанной кончик должен быть достаточно большим, чтобы жидкость, но все еще достаточно мал, чтобы легко войти в ткань. Стеклянный пипетка можно использовать повторно, если не сломана или засорена.
9. Принесите стеклянную пипетку близко к желудочку и добавить давление в поршень шприца с локтем, чтобы заставить жидкость из.
10. Прикрепите желудочек сердца стеклянной пипеткой, добавляя давление в шприц.
11. Непосредственно после, перфорировать синус венос с щипками, чтобы кровь покинуть кровообращение.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Желудочек сердца становится более хрупким из-за фиксатора. Он также становится менее красным, как кровь разбавляется с фиксатором / DiI раствор.
12. Из желудочка, настроить угол стеклянной пипетки, чтобы найти вход в луковицы артериаза. Принесите пипетку открытия внутри люковича артериоз, как показано на рисунке 2, и добавить больше давления на шприц.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Артериоз луковицы прозрачен и ткань эластична. При замене крови DiI/фиксативным, стеклянный пипетка внутри сердца должен стать более заметным и, добавляя давление, размер артерии луковицы должен расширяться. Этот шаг имеет решающее значение, чтобы убедиться, что достаточное давление было использовано, чтобы заменить всю кровь с фиксаторным / DiI решение, и что все кровеносные сосуды были достигнуты. Часто, когда успешно, PFA провоцирует мышечные сокращения и рыба будет двигаться.
13. Продолжайте добавлять давление на шприц в течение 30-60 с по-прежнему сохраняя стеклянный пипетка внутри люковичного артериоза.
14. Снимите стеклянную пипетку и иглы с рыбы.
15. Вскрыть мозг и гипофиз, и инкубировать ткани в свежих 4% PFA в PBS в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Рассечение мозга и гипофиза ранее было подробно описано двумя различными способами Фонтейн и др.²⁶ и Ager-Wick et al.²⁷. Из-за фиксации, ткань становится довольно трудно и хрупкая связь между мозгом и гипофиза может быть нарушена. После вскрытия, после фиксации обработки также может быть выполнена на ночь при 4 градусах Цельсия.
16. Промыть ткань дважды в PBS в течение 10 минут, прежде чем готовиться к визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Ткань может быть установлена между слайд и крышка скольжения с прокладки между ними и монтаж ампентом среды для конфокальной визуализации (см. Рисунок 4), или разделены с вибратом, как описано подробно в Фонтейн и др.²⁶ до монтажа между слайд и крышка скольжения для изображения со стереомикроскопом (см. Рисунок 4).

Результаты

Этот протокол демонстрирует пошаговую процедуру маркировки кровеносных сосудов в медаке мозга и гипофиза, и в то же время исправить ткани. После маркировки путем сердечной инъекции фиксаторного раствора, содержащего DiI в сердце, кровеносные сосуды могут наблюдаться на ломтиках с помо?...

Обсуждение

Сердечная перфузия с DiI ранее была использована для обозначения кровеносных сосудов в нескольких модельных видов^24,в том числе телеост рыбы¹³_.

Поскольку DiI непосредственно доставляется в эндотелиальную клеточную мембрану путем перфузии в ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	RT 15711
5 mL Syringe PP/PE without needle	Sigma	Z116866-100EA	syringes
BD Precisionglide syringe needles	Sigma	Z118044-100EA	needles 18G (1.20*40)
borosilicate glass 10cm OD1.2mm	sutter instrument	BF120-94-10	glass pipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D-282
LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm	Portex	800/110/340/100	canula
Phosphate Buffer Saline (PBS) solution	Sigma	D8537-6X500ML
pipette puller	Narishige	PC-10
plastic petri dishes	VWR	391-0442
Super glue gel	loctite	c4356
tricaine (ms-222)	sigma	E10521-50G