Angiografía por fluorescencia para la evaluación de la perfusión del aneurisma y la paciencia de la arteria parental en modelos de aneurisma de rata y conejo

Resumen

Presentamos un protocolo para evaluar eficientemente la perfusión del aneurisma y la patencia de los recipientes del aneurisma de las paredes laterales en ratas y conejos, utilizando la videoangiografía por fluorescencia a base de fluoresceína (FVA). Con un valor predictivo positivo del 92,6%, es un método simple pero muy eficaz y económico sin necesidad de equipos especiales.

Resumen

El tratamiento del aneurisma cerebral se centra en lograr la oclusión completa, así como en preservar el flujo sanguíneo en la arteria principal. Fluoresceina sódica y verde indocyanina se utilizan para permitir la observación del flujo sanguíneo y el estado de perfusión de los vasos, respectivamente. El objetivo de este estudio es aplicar FVA para verificar el flujo sanguíneo en tiempo real, el estado de perfusión de los vasos y la oclusión de los aneurismas después de la inducción de aneurismas laterales en conejos y ratas, así como para validar el procedimiento en estas especies.

Se crearon veinte aneurismas de las paredes laterales en 10 conejos suturando una bolsa descelularizada de los vasos arteriales en la arteria carótida de un conejo donante. Además, se crearon 48 aneurismas de paredes laterales microquirúrgicas en 48 ratas. Durante el seguimiento a los meses posteriores a la creación, se diseccionó el complejo de arteria/aneurisma principal y se realizó FVA utilizando una inyección intravenosa de fluoresceína (10%, 1 ml) a través de un cateterismo en venas de oído en conejos y una catroización venosa femoral en ratas. Luego se cosechaban aneurismas y la patencia se evaluó macroscópicamente.

Macroscópicamente, 14 de los 16 aneurismas en conejos indicaron que no había perfusión residual de arterias madre con luminas totalmente ocluidas, sin embargo 11 (79%) fueron detectados por FVA. Se excluyeron cuatro aneurismas debido a problemas técnicos. En ratas, la perfusión de aneurisma residual se observó macroscópicamente en 25 de los 48 casos. De los 23 sin evidencia macroscópica de perfusión, el FVA confirmó la incidencia de 22 aneurismas (96%). No hubo eventos adversos asociados con la FVA. La fluoresceína es fácilmente aplicable y no se necesita ningún equipo especial. Es un método seguro y extremadamente eficaz para evaluar la integridad de la arteria principal y la patencia del aneurisma/perfusión residual en un entorno experimental con conejos y ratas. FVA utilizando fluoresceína como agente de contraste parece ser eficaz en el control de la patencia de los aneurismas y el vaso subyacente e incluso se puede adaptar a la cirugía de bypass.

Introducción

La evidencia de la obliteración completa del aneurisma y la integridad de la arteria de los padres es de suma importancia en la cirugía de aneurisma. Existen varias opciones para confirmar la patencia de la arteria principal y la oclusión del aneurisma, como la ecografía Doppler, la angiografía cerebral convencional (DSA), la angiografía por tomografía computarizada (CTA) o la angiografía por resonancia magnética (MRA)^{1, 2}. Sin embargo, se trata de métodos costosos y lentos que a menudo no están disponibles en un entorno de laboratorio. Además, pueden tener efectos secundarios relevantes, como la exposición a la radiación o la necesidad de sedación adicional de animales experimentales para evitar el artefacto del movimiento.

Con un número creciente de nuevos dispositivos endovasculares que están surgiendo, existe una necesidad consecutiva de pruebas preclínicas de tales dispositivos. Sin embargo, estos estudios a menudo se basan en el análisis post mortem (por ejemplo, macropatología e histología) y carecen de información sobre la perfusión dinámica. Además, para el investigador puede ser crucial obtener información inmediata y fiable durante un procedimiento quirúrgico experimental. La angiografía por fluorescencia es una técnica de visualización rentable y fácil de realizar^1,3,4.

Como tal, la angiografía por videografía verde indocyanina (ICG) se utiliza a menudo en procedimientos neuroquirúrgicos clínicos y se ha estudiado extensamente^5,6. La angiografía por videofluoresceína (FVA) es una técnica alternativa, con la ventaja adicional de crear una señal de fluorescencia que está dentro del rango de longitud de onda de la visión humana, y por lo tanto puede ser vista a simple vista sin una cámara infrarroja de espectro extendido ⁷. La angiografía por videofluoresceína se utiliza con menos frecuencia en la cirugía cerebrovascular clínica y los informes sobre La FVA en entornos experimentales son escasos^1,4.

El objetivo de este informe es demostrar la viabilidad y el alcance de las aplicaciones de La FVA en la investigación cerebrovascular preclínica de ratas y conejos.

Protocolo

Los roedores fueron alojados en un centro de cuidado de animales y los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Berna, Suiza (BE 108/16) y (BE65/16). Todos los animales se mantuvieron en una dieta de laboratorio estándar con acceso gratuito a alimentos y agua. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo una cuidadosa consideración de las 3R (reemplazo, reducción y refinamiento). Diez hembras de conejos blancos de Nueva Zelanda y 48 ratas macho Wistar fueron incluidos. Las directrices de LA ARRIVE se siguieron estrictamente⁸.

NOTA: Se crearon veinte aneurismas de las paredes laterales en 10 conejos suturando una bolsa descelularizada de los vasos arteriales en la arteria carótida de un conejo donante. Además, se crearon 48 aneurismas microquirúrgicos de la pared lateral en 48 ratas como se describió antes^de4,⁹. El procedimiento de diagnóstico por imágenes y el análisis macroscópico se realizaron 4 semanas después de la creación del aneurisma.

1. Preparación del material necesario para la angiografía por videofluoresceína

1. Modifique la linterna pegando en un filtro de paso de banda azul (consulte la Tabla de materiales), que funcionará como un filtro de excitación. La antorcha sólo debe emitir luz azul. Utilice cinta negra para evitar cualquier fuga de luz sin filtrar.
2. Equipar la cámara (por ejemplo, conectada al microscopio) con un filtro de paso de banda verde (ver la Tabla de Materiales), que funcionará como un filtro de luz de emisión. Ahora sólo la luz verde debería poder pasar.

2. Preparación del lugar de trabajo y los materiales

1. Desinfectante el espacio de trabajo con solución desinfectante.
2. Cubra la mesa con cortinas estériles para evitar la contaminación.
3. Utilice instrumentos estériles para la cirugía.

3. Preparación de animales para la cirugía

1. Pesar a los animales.
2. Inducir la anestesia y ajustar la dosis de acuerdo con el peso.
   1. Para conejos,comience la anestesia equilibrada. Proteger sus ojos con una mano durante la inyección para reducir su reacción de miedo. Cubra la jaula con una sábana para ayudar a sedar a los animales.
   2. Anestetizar ratas en una cámara de gas con 4% de isoflurano y 96% de oxígeno antes de la inyección.
3. Supervise la profundidad de la anestesia. Pellizca entre los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos para asegurarte de que los animales estén dormidos.
   1. Vuelvan a colocar los conejos sobre sus espaldas. No deben reaccionar.
   2. Para lasratas, pellizque sus colas y asegúrese de que no se observe ninguna reacción.
4. Aplicar pomada en los ojos de los roedores para evitar la sequedad. Saca las lenguas de las ratas para evitar cualquier posibilidad de tragar.
5. Comience con la preservación de la anestesia.
   1. Para conejos,cateterismo (22 G catéter IV blindado con puerto de inyección, ver la Tabla de Materiales) la vena del oído. Mantener una anestesia equilibrada. Utilice un tapón de tres vías para habilitar varias inyecciones simultáneas.
   2. Para ratas, inyectar 50 mg/kg de clorhidrato de ketamina y 0,5 mg/kg de clorhidrato de medetomidina por vía intraperitoneal. Monitoree la anestesia con un pellizco nocivo durante la cirugía. En caso de reacción, administre anestesia adicional.
6. Pegue los animales en el tablero en una posición supina y afiérase de cerca la ubicación de la incisión. Desinfectar el área con Betaseptic.
   1. Para conejos,desinfectar el cuello, especialmente alrededor del músculo esternocleidomastoideo.
   2. Para ratas, desinfecte el área de la vejiga a los transvers colon.
7. Administrar oxígeno a través de una máscara durante toda la cirugía y mantener la temperatura corporal con una almohadilla de calentamiento.

4. Preparación de la arteria

1. Para obtener mejores resultados, diseccione a fondo el recipiente elegido del tejido circundante^9,10.
   1. Para ratas, identificar la vena de la cola (menos invasiva, preferiblemente utilizada para animales supervivientes) o diseccionar una vena femoral para la inyección de fluoresceína^4,11.
      NOTA: En el caso de los conejos,no se necesita más disección de vasos para la inyección de fluoresceína, ya que la vena del oído ya se está utilizando para la anestesia.
2. Coloque una almohadilla blanca debajo del recipiente elegido para aumentar el contraste con el tejido circundante.
3. Enfoque la cámara montada en el microscopio en la arteria diseccionada.

5. Angiografía por videoesceína de fluoresceína

1. Cubra la jeringa de 5 ml llena de fluoresceína sódica (100 mg/ml, ver la Tabla de Materiales)con papel de aluminio para proteger la exposición de la luz. Apague las luces (en la medida de lo posible) e inyecte fluoresceína sódica por vía intravenosa. Inyecte bajo la oscuridad para evitar el fotoblanqueo.
   1. En el caso de los conejos,inyecte 0,3 ml/kg de fluoresceína sódica a través de la tres vías en la vena del oído catecada.
   2. En elcaso de ratas, inyectar 0,4 ml/kg de fluoresceína sódica en la vena femoral a través de un catéter o una aguja de 25 G.
2. Enjuague la aguja o el catéter con una solución salina de 0,5 ml para asegurarse de que se inyecta todo el tinte.
3. Ilumina el campo quirúrgico con la linterna modificada.
4. Comience a filmar con la cámara modificada. El flujo sanguíneo debe ser visible unos segundos después de la inyección (Figura1).
   NOTA: Aquí, hemos utilizado la velocidad de fotogramas: 50 fotogramas/s, la distancia focal a 70 mm y la F3.4.

6. Análisis macroscópico

1. Reseque los aneurismas y el complejo de la arteria principal, y evalúe la paciencia macroscópicamente abriendo la arteria padre con microtijeras y evalúe el lumen de la arteria padre y el orificio del anerisma (ver Figura 1, 2)⁹. Mida el tamaño de los aneurismas. Aneurysm-parent-artery-complex puede almacenarse para su posterior análisis (por ejemplo, histología).

Resultados

Durante la cirugía se monitorizaron la frecuencia cardíaca y la presión arterial. La frecuencia cardíaca media fue de 193/min en conejos y 196/min en ratas. El peso corporal de los conejos osciló entre 3,05 y 4,18 kg, y las ratas pesaban 335-690 g.

Pudimos realizar FVA en ocho de cada diez conejos (Figura1). Cuatro exámenes de aneurisma en dos conejos no fueron grabados con la cámara debido a dificultades técnicas. No se notificaron dificultades técnicas ...

Discusión

FVA es un método prometedor y sin complicaciones para examinar los recipientes en roedores y se puede realizar con dispositivos comerciales y equipos listos para usar. La FVA se puede implementar durante cualquier cirugía donde se necesite una evaluación intraoperatoria de la integridad del vaso, ya que los vasos necesitan primero una disección adecuada.

Los autores prefirieron la inyección venosa a la inyección arterial debido al menor riesgo de eventos involuntarios como infección, is...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
For rabbits
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter	Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera	Sony NEX-5R
Catheter	22G Vasofix Safety
Disinfictant
Fluorescein sodium	Fluorescein Faure 10%
Glas plate
Green filter	Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Infusion pump	Perfusor Secura
Ketamine hydrochloride			any generic products
Needle	25G
Oxygen
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments			micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml, 50ml
Tape
Three-way-stopcock
Torch light
Xylazin			any generic products
For rats
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter	Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera	Sony NEX-5R
Disinfictant
Fluorescein sodium	Fluorescein Faure 10%
Green filter	Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Isoflurane
Ketamine hydrochloride			any generic products
Medetomidine hydrochloride			any generic products
Needle	25G
Oxygen
Plate
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments			micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml
Tape
Torch light