Fluoreszenz-Angiographie zur Bewertung von Aneurysmperfusion und Elternarterienpatenz in Ratten- und Kaninchen-Aneurysmus-Modellen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur effizienten Bewertung der Aneurysmenperfusion und der Gefäßdurchgängigkeit von Seitenwandaneurysmen bei Ratten und Kaninchen unter Verwendung von Fluorescein-basierter Fluoreszenz-Videoangiographie (FVA). Mit einem positiven Vorhersagewert von 92,6% ist es eine einfache, aber sehr effektive und wirtschaftliche Methode ohne spezielle Ausrüstung erforderlich.

Zusammenfassung

Die Behandlung des Gehirnaneurysm konzentriert sich auf die Erzielung einer vollständigen Okklusion sowie die Erhaltung des Blutflusses in der Elternarterie. Fluorescein-Natrium und Indocyaningrün werden verwendet, um die Beobachtung des Blutflusses bzw. des Gefäßperfusionsstatus zu ermöglichen. Ziel dieser Studie ist es, FVA anzuwenden, um den Blutfluss in Echtzeit, den Gefäßdurchblutungsstatus und die Okklusion von Aneurysmen nach Induktion von Seitenwandaneurysmen bei Kaninchen und Ratten zu überprüfen und das Verfahren bei diesen Arten zu validieren.

Zwanzig Sidewall-Aneurysmen wurden in 10 Kaninchen durch DasAsidieren eines dezellularisierten arteriellen Gefäßbeutels auf der Halsschlagader eines Spenderkaninchens geschaffen. Darüber hinaus wurden 48 mikrochirurgische Seitenwandaneurysmen bei 48 Ratten erstellt. Während der Nachbeobachtung nach einem Monat nach der Entstehung wurde der Elternarterien-/Aneurysmenkomplex seziert und FVA mit einer intravenösen Fluorescein-Injektion (10%, 1 ml) über eine Ohrvenenkatheterisierung bei Kaninchen und einer femoralen Venenkathhäreisierung bei Ratten durchgeführt. Aneurysmen wurden dann geerntet und die Durchgängigkeit makroskopisch ausgewertet.

Makroskopisch deuteten 14 von 16 Aneurysmen bei Kaninchen auf keine Restdurchlässigkeit der Elternarterie mit völlig verdeckter Leuchtdichte hin, jedoch 11 (79%) wurden von fvA erkannt. Vier Aneurysmen wurden wegen technischer Probleme ausgeschlossen. Bei Ratten wurde die Restaneurysmenperfusion in 25 von 48 Fällen makroskopisch beobachtet. Von den 23 ohne makroskopischen Nachweise einer Perfusion bestätigte die FVA die Inzidenz von 22 Aneurysmen (96%). Es gab keine unerwünschten Ereignisse im Zusammenhang mit FVA. Fluorescein ist leicht anwendbar und es wird keine spezielle Ausrüstung benötigt. Es ist eine sichere und äußerst effektive Methode zur Bewertung der Integrität der Elternarterie und der Aneurysmenkongoncy/Restperfusion in einer experimentellen Umgebung mit Kaninchen und Ratten. FVA mit Fluorescein als Kontrastmittel scheint bei der Kontrolle der Durchgängigkeit von Aneurysmen und dem darunter liegenden Gefäß wirksam zu sein und kann sogar an Bypass-Operationen angepasst werden.

Einleitung

Der Nachweis einer vollständigen Auslöschung des Aneurysmus und der Arterienintegrität der Eltern ist bei der Aneurysmchirurgie von größter Bedeutung. Es gibt mehrere Möglichkeiten, Elternarterienkongierung und Aneurysmverschluss zu bestätigen, wie Doppler-Sonographie, konventionelle zerebrale Angiographie (DSA), Computertomographie-Angiographie (CTA) oder Magnetresonanz-Angiographie (MRA)^{1, 2}. Es handelt sich jedoch um teure und zeitaufwändige Methoden, die im Labor oft nicht verfügbar sind. Darüber hinaus können sie relevante Nebenwirkungen wie Strahlenexposition oder die Notwendigkeit einer zusätzlichen Sedierung von Versuchstieren haben, um Bewegungsartefakt zu vermeiden.

Da immer mehr neue endovaskuläre Geräte entstehen, besteht ein ständiger Bedarf an präklinischen Tests solcher Geräte. Diese Studien stützen sich jedoch häufig auf postmortale Analysen (z. B. Makropathologie und Histologie) und es fehlen Informationen über dynamische Perfusion. Darüber hinaus kann es für den Forscher von entscheidender Bedeutung sein, während eines experimentellen chirurgischen Eingriffs sofortige und zuverlässige Informationen zu erhalten. Fluoreszenz-Angiographie ist eine kostengünstige und einfach durchzuführende Visualisierungstechnik^1,3,4.

Als solche, Indocyaningrün (ICG) Video-Angiographie wird oft in klinischen neurochirurgischen Verfahren verwendet und wurde ausgiebig untersucht^5,6. Fluorescein Video Angiography (FVA) ist eine alternative Technik, mit dem zusätzlichen Vorteil, ein Fluoreszenzsignal zu schaffen, das innerhalb des Wellenlängenbereichs des menschlichen Sehens liegt und somit mit bloßem Auge ohne erweiterte Infrarotkamera gesehen werden kann. ⁷. Fluorescein Video-Angiographie wird seltener in der klinischen zerebrovaskulären Chirurgie verwendet und Berichte über FVA in experimentellen Umgebungen sind knapp^1,4.

Ziel dieses Berichts ist es, die Durchführbarkeit und den Umfang der Anwendung von FVA in der präklinischen zerebrovaskulären Forschung von Ratten und Kaninchen aufzuzeigen.

Protokoll

Die Nagetiere wurden in einer Tierpflegeeinrichtung untergebracht und Experimente wurden vom Tierschutzausschuss der Universität Bern (BE 108/16) und (BE65/16) geprüft und genehmigt. Alle Tiere wurden auf einer Standard-Labordiät mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten. Alle Tierversuche wurden unter sorgfältiger Berücksichtigung der 3Rs (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) durchgeführt. Zehn weibliche neuseeländische Weiße Kaninchen und 48 männliche Wistar-Ratten wurden aufgenommen. ARRIVE-Richtlinien wurden strikt befolgt⁸.

HINWEIS: Zwanzig Seitenwandaneurysmen wurden in 10 Kaninchen durch Dasasaatieren eines dezellularisierten arteriellen Gefäßbeutels auf der Halsschlagader eines Spenderkaninchens erstellt. Darüber hinaus entstanden 48 mikrochirurgische Seitenwandaneurysmen bei 48 Ratten, wie vor^4,9beschrieben. Das bildgebende Verfahren und die makroskopische Analyse wurden 4 Wochen nach der Aneurysmerstellung durchgeführt.

1. Aufbereitung des für die Fluorescein-Videoangiographie benötigten Materials

1. Ändern Sie die Taschenlampe, indem Sie auf einen blauen Bandpassfilter tippen (siehe Materialtabelle), der als Anregungsfilter fungiert. Die Fackel sollte dann nur blaues Licht aussenden. Verwenden Sie schwarzes Band, um ein Auslaufen von ungefiltertem Licht zu vermeiden.
2. Statten Sie die Kamera (z. B. am Mikroskop befestigt) mit einem grünen Bandpassfilter aus (siehe Materialtabelle), der als Emissionslichtfilter fungiert. Nur grünes Licht sollte nun durchgehen können.

2. Vorbereitung von Arbeitsplatz und Materialien

1. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionslösung.
2. Bedecken Sie den Tisch mit sterilen Vorhängen, um eine Kontamination zu verhindern.
3. Verwenden Sie sterile Instrumente für die Operation.

3. Vorbereitung der Tiere auf die Operation

1. Wiegen Sie die Tiere.
2. Induzieren Sie anästhesie und passen Sie die Dosis an das Gewicht an.
   1. Für Kaninchen, beginnen ausgewogene Anästhesie. Schützen Sie ihre Augen mit einer Hand während der Injektion, um ihre Angstreaktion zu reduzieren. Bedecken Sie den Käfig mit einem Blatt, um die Tiere zu beruhigen.
   2. Anästhesisieren Sie Ratten in einer Gaskammer mit 4% Isofluran und 96% Sauerstoff vor der Injektion.
3. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie. Pinch zwischen den Zehen, um sicherzustellen, dass die Tiere schlafen.
   1. Stellen Sie die Kaninchen auf den Rücken. Sie sollten nicht reagieren.
   2. Bei Ratten, kneifen ihre Schwänze und stellen Sie sicher, dass keine Reaktion beobachtet wird.
4. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Nagetiere auf, um Trockenheit zu verhindern. Ziehen Sie die Zungen der Ratten heraus, um jede Chance zu schlucken.
5. Beginnen Sie mit der Erhaltung der Anästhesie.
   1. Für Kaninchen, Katheter (22 G abgeschirmt IV Katheter mit Injektionsanschluss, siehe Tabelle der Materialien) die Ohrvene. Bewahren Sie eine ausgewogene Anästhesie auf. Verwenden Sie einen Drei-Wege-Stopphahn, um mehrere gleichzeitige Injektionen zu ermöglichen.
   2. Bei Ratten50 mg/kg Ketaminhydrochlorid und 0,5 mg/kg Medetomidinhydrochlorid intraperitoneal injizieren. Überwachen Sie die Anästhesie mit einer schädlichen Zehenprise während der Operation. Im Falle einer Reaktion zusätzliche Betäubung verabreichen.
6. Kleben Sie die Tiere in einer Supine-Position auf das Brett und rasieren Sie den Schnittort genau. Desinfizieren Sie den Bereich mit Betaseptic.
   1. Bei Kaninchen, desinfizieren Sie den Hals, vor allem um sternocleidomastoid Muskel.
   2. Für Ratten, desinfizieren Sie den Bereich von Blase zu Transvers Dickdarm.
7. Verabreichen Sie Sauerstoff durch eine Maske während der gesamten Operation und halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen.

4. Vorbereitung der Arterie

1. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sezieren Sie das gewählte Gefäß gründlich aus dem umgebenden Gewebe^9,10.
   1. Bei Rattendie Schwanzvene (weniger invasiv, vorzugsweise für überlebende Tiere) oder sezieren eine Femoralvene für die Fluorescein-Injektion^4,11.
      HINWEIS: Für Kaninchenist keine weitere Zerlegung der Gefäße für die Fluorescein-Injektion erforderlich, da die Ohrvene bereits zur Anästhesie verwendet wird.
2. Positionieren Sie ein weißes Pad unter dem gewählten Gefäß, um den Kontrast zum umgebenden Gewebe zu erhöhen.
3. Fokussieren Sie die am Mikroskop montierte Kamera auf die sezierte Arterie.

5. Fluorescein Video-Angiographie

1. Bedecken Sie die mit Fluorescein-Natrium (100 mg/ml, siehe Materialtabelle)gefüllte 5 ml Spritze mit Aluminiumfolie, um sich vor Lichteinwirkung zu schützen. Schalten Sie das Licht aus (so viel wie möglich) und injizieren Sie Fluorescein-Natrium intravenös. Injizieren Sie bei Dunkelheit, um Photobleichungen zu verhindern.
   1. Bei Kaninchen0,3 ml/kg Fluorescein-Natrium durch den Drei-Wege-Stopphahn in die katheterisierte Ohrvene injizieren.
   2. Bei Ratten0,4 ml/kg Fluorescein-Natrium über einen Katheter oder eine 25 G-Nadel in die Femoralvene injizieren.
2. Spülen Sie die Nadel oder den Katheter mit 0,5 ml Salinelösung, um sicherzustellen, dass der gesamte Farbstoff injiziert wird.
3. Beleuchten Sie das Operationsfeld mit der modifizierten Taschenlampe.
4. Beginnen Sie mit den Dreharbeiten mit der modifizierten Kamera. Der Blutfluss sollte einige Sekunden nach der Injektion sichtbar sein (Abbildung 1).
   HINWEIS: Hier haben wir Bildrate = 50 Frames/s, Brennweite = 70 mm und F3.4 verwendet.

6. Makroskopische Analyse

1. Resect die Aneurysmen und Elternarterienkomplex, und bewerten Sie die Durchgängigkeit makroskopisch durch Öffnen der Mutterarterie mit Mikroschere und bewerten Sie das Lumen der Mutterarterie und die Öffnung des Anerysmen (siehe Abbildung 1, 2)⁹. Messen Sie die Größe der Aneurysmen. Aneurysm-Eltern-Arterie-Komplex kann dann zur weiteren Analyse (z.B. Histologie) gespeichert werden.

Ergebnisse

Herzfrequenz und Blutdruck wurden während der Operation überwacht. Die durchschnittliche Herzfrequenz betrug 193/min bei Kaninchen und 196/min bei Ratten. Das Körpergewicht der Kaninchen betrug 3,05-4,18 kg, die Ratten 335-690 g.

Wir konnten FVA in acht von zehn Kaninchen durchführen (Abbildung 1). Vier Aneurysmusuntersuchungen an zwei Kaninchen wurden aufgrund technischer Schwierigkeiten nicht mit der Kamera aufgezeichnet. Es wurden keine technischen Schwieri...

Diskussion

FVA ist eine vielversprechende und unkomplizierte Methode zur Untersuchung von Gefäßen bei Nagetieren und kann mit kommerziellen Geräten und Standardgeräten durchgeführt werden. FVA kann bei jeder Operation durchgeführt werden, bei der eine intraoperative Bewertung der Gefäßintegrität erforderlich ist, da die Gefäße zuerst eine ordnungsgemäße Zerlegung benötigen.

Die Autoren bevorzugten venöse Injektion zur arteriellen Injektion aufgrund des geringeren Risikos von unbeabsichtigt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
For rabbits
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter	Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera	Sony NEX-5R
Catheter	22G Vasofix Safety
Disinfictant
Fluorescein sodium	Fluorescein Faure 10%
Glas plate
Green filter	Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Infusion pump	Perfusor Secura
Ketamine hydrochloride			any generic products
Needle	25G
Oxygen
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments			micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml, 50ml
Tape
Three-way-stopcock
Torch light
Xylazin			any generic products
For rats
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter	Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera	Sony NEX-5R
Disinfictant
Fluorescein sodium	Fluorescein Faure 10%
Green filter	Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Isoflurane
Ketamine hydrochloride			any generic products
Medetomidine hydrochloride			any generic products
Needle	25G
Oxygen
Plate
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments			micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml
Tape
Torch light