Angiografia por fluorescência para avaliação da perfusão de aneurisma e patência da artéria parental em modelos de aneurisma de ratos e coelhos

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para avaliar eficientemente a perfusão do aneurysm e a permeabilidade da embarcação do aneurysm do Sidewall nos ratos e nos coelhos, usando a angiografia Video Fluorescein-baseada da fluorescência (FVA). Com um valor preditivo positivo de 92,6%, é um método simples, mas muito eficaz e econômico, sem necessidade de equipamentos especiais.

Resumo

O tratamento do aneurisma cerebral concentra-se em alcançar a oclusão completa, bem como preservar o fluxo sanguíneo na artéria mãe. O sódio da fluoresceína e o verde do do indocyanine são usados para permitir a observação do estado da circulação sanguínea e da perfusão da embarcação, respectivamente. O objetivo deste estudo é aplicar a FVA para verificar o fluxo sanguíneo em tempo real, o estado de perfusão dos vasos e a oclusão de aneurismas após a indução de aneurismas laterais em coelhos e ratos, bem como validar o procedimento nessas espécies.

Vinte aneurismas do Sidewall foram criados em 10 coelhos suturando uma bolsa arterial descelularizados da embarcação na artéria carotídea de um coelho fornecedor. Além disso, 48 aneurismas de parede lateral microcirúrgica foram criados em 48 ratos. Durante o seguimento em um mês após a criação, o complexo de artéria/aneurisma dos pais foi dissecado e a FVA foi realizada por meio de uma injeção intravenosa de fluoresceina (10%, 1 mL) por meio de cateterismo da veia orelha em coelhos e uma catherização da veia femoral em ratos. Os aneurismas foram então colhidos, e a patência foi avaliada macroscopicamente.

Macroscopicamente, 14 dos 16 aneurismas em coelhos não indicaram perfusão residual da artéria parental com luminae totalmente oclusada, porém 11 (79%) foram detectados pelo FVA. Quatro aneurismas foram excluídos devido a problemas técnicos. Em ratos, a perfusão de aneurisma residual foi observada macroscopicamente em 25 dos 48 casos. Dos 23 sem evidência macroscópica de perfusão, a FVA confirmou a incidência de 22 aneurismas (96%). Não houve eventos adversos associados à FVA. A fluoresceina é facilmente aplicável e nenhum equipamento especial é necessário. É um método seguro e extremamente efetivo para avaliar a integridade da artéria parental e a permeabilidade do aneurisma/perfusão residual em um ambiente experimental com coelhos e ratos. FVA usando fluoresceina como um agente de contraste parece ser eficaz no controle da permeabilidade dos aneurismas e do vaso subjacente e pode até mesmo ser adaptado para a cirurgia de bypass.

Introdução

A evidência do obliteração completo do aneurysm e da integridade da artéria do pai é da importância máxima na cirurgia do aneurysm. Existem várias opções para confirmar a permeabilidade da artéria parental e a oclusão do aneurisma, como a ultrassonografia Doppler, a angiografia cerebral convencional (DSA), a angiografia por tomografia computadorizada (CTA) ou a angiografia por ressonância magnética (ARM)^{1, 2}. no entanto, estes são métodos caros e demorados, que muitas vezes não estão disponíveis em um ambiente de laboratório. Além disso, podem ter efeitos secundários relevantes, tais como a exposição à radiação ou a necessidade de sedação adicional de animais experimentais para evitar artefactos de movimento.

Com um número crescente de novos dispositivos endovasculares emergentes, há uma necessidade consecutiva de testes pré-clínicos de tais dispositivos. No entanto, esses estudos muitas vezes dependem de análise post-mortem (por exemplo, macro patologia e histologia) e falta de informações sobre a perfusão dinâmica. Além disso, para o pesquisador pode ser crucial obter informações imediatas e confiáveis durante um procedimento cirúrgico experimental. A angiografia por fluorescência é um custo-eficaz e fácil de executar a técnica de visualização^1,3,4.

Como tal, a angiografia video do verde do do indocyanine (ICG) é usada frequentemente em procedimentos Neurosurgical clínicos e extensivamente foi estudada^5,6. A angiografia video da Fluorescein (FVA) é uma técnica alternativa, com a vantagem adicional de criar um sinal da fluorescência que esteja dentro da escala do comprimento de onda da visão humana, e possa assim ser visto pelo olho despido sem uma câmera infravermelha prolongada do espectro ⁷. a angiografia video da Fluorescein é usada menos frequentemente na cirurgia cerebrovascular clínica e os relatórios em FVA em ajustes experimentais são escassos^1,4.

O objetivo deste relato é demonstrar a viabilidade e o escopo das aplicações de FVA na pesquisa cerebrovascular pré-clínica de ratos e coelhos.

Protocolo

Os roedores foram alojados em uma instalação do cuidado animal e os experimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê para o bem-estar animal na Universidade de Berna, Switzerland (seja 108/16) e (BE65/16). Todos os animais foram mantidos em uma dieta de laboratório padrão com acesso livre à comida e água. Todos os experimentos com animais foram conduzidos cuidadosa consideração dos 3Rs (reposição, redução e refinamento). Dez coelhos fêmeas da Nova Zelândia branca e 48 ratos Wistar machos foram incluídos. As directrizes da chegada foram seguidas estritamente⁸.

Nota: vinte aneurismas laterais foram criados em 10 coelhos, suturando uma bolsa de vasos arteriais decelularizada na artéria carótida de um coelho doador. Além disso, 48 aneurismas microcirúrgicos de parede lateral foram criados em 48 ratos, conforme descrito antes de^4,9. O procedimento de imagem e a análise macroscópica foram realizados 4 semanas após a criação do aneurisma.

1. preparação do material necessário para a angiografia video da fluoresceína

1. Modifique a lanterna gravando em um filtro de bandpass azul (veja a tabela de materiais), que funcionará como um filtro de excitação. A tocha deve então emitir somente a luz azul. Use fita preta para evitar qualquer vazamento de luz não filtrada.
2. Equipar a câmera (por exemplo, anexada ao microscópio) com um filtro de passe verde (veja a tabela de materiais), que funcionará como um filtro de luz de emissão. Apenas a luz verde deve agora ser capaz de passar.

2. preparação do local de trabalho e dos materiais

1. Desinfetante o espaço de trabalho com solução desinfetante.
2. Cubra a mesa com cortinas estéreis para evitar a contaminação.
3. Use instrumentos estéreis para a cirurgia.

3. preparação de animais para a cirurgia

1. Pese os animais.
2. Induzir anestesia e ajustar a dose de acordo com o peso.
   1. Para coelhos, iniciar a anestesia equilibrada. Proteja seus olhos com uma mão durante a injeção para reduzir sua reação do susto. Cubra a gaiola com uma folha para ajudar a sedar os animais.
   2. Anestesie ratos em uma câmara de gás com isoflurano 4% e 96% de oxigênio antes da injeção.
3. Monitore a profundidade da anestesia. Aperte entre os dedos dos pés para se certificar de que os animais estão dormindo.
   1. Reposicione os coelhos nas costas. Eles não devem reagir.
   2. Para ratos, aperte suas caudas e certifique-se de que nenhuma reação é observada.
4. Aplique pomada nos olhos dos roedores para evitar a secura. Retire as línguas dos ratos para evitar qualquer chance de engolir.
5. Comece com a preservação do anaesthesia.
   1. Para coelhos, cateterismo (cateter IV blindado de 22 G com porta de injecção, ver a tabela de materiais) a veia da orelha. Manter a anestesia equilibrada. Use um torneira de três vias para permitir múltiplas injeções simultâneas.
   2. Para ratos, injete 50 mg/kg de cloridrato de cetamina e 0,5 mg/kg de cloridrato de medetomidina intraperitonealmente. Monitore a anestesia com uma pitada nocivas do dedo do pé durante a cirurgia. No caso de reação, administrar anestesia adicional.
6. Tape os animais para a placa em uma posição supina e raspar de perto o local da incisão. Desinfete a área com Betasséptica.
   1. Para coelhos, desinfecte o pescoço, especialmente em torno do músculo esternocleidomastoide.
   2. Para ratos, desinfete a área da bexiga para transversos cólon.
7. Administrar o oxigênio através de uma máscara durante toda a cirurgia e manter a temperatura do corpo com uma almofada de aquecimento.

4. preparação da artéria

1. Para melhores resultados, dissecar completamente a embarcação escolhida do tecido circunvizinho^9,10.
   1. Para ratos, identificar a veia cauda (menos invasiva, preferencialmente usada para animais sobreviventes) ou dissecar uma veia femoral para a injeção de fluoresceina^4,11.
      Nota: para coelhos, não é necessária qualquer dissecção adicional de vasos para a injeção de fluoresceina, pois a veia da orelha já está sendo usada para anestesia.
2. Posicione uma almofada branca a embarcação escolhida para aumentar o contraste com o tecido circundante.
3. Concentre a câmera montada no microscópio da artéria dissecada.

5. Fluorescein angiografia vídeo

1. Cubra a seringa de 5 mL preenchida com fluoresceina sódica (100 mg/mL, ver a tabela de materiais) com folha de alumínio para proteger da exposição de luz. Desligue as luzes (tanto quanto possível) e injete sódio fluoresceína intravenosamente. Injete a escuridão para evitar o fotobranqueamento.
   1. Para coelhos, injete 0,3 ml/kg de fluoresceina sódica através da torneira de três vias na veia da orelha cateterizada.
   2. Para ratos, injete 0,4 ml/kg de fluoresceina sódica na veia femoral através de um cateter ou de uma agulha de 25 G.
2. Lave a agulha ou o cateter com 0,5 mL de solução salina para garantir que todos os corantes sejam injetados.
3. Ilumine o campo cirúrgico com a lanterna modificada.
4. Comece a filmar com a câmera modificada. O fluxo sanguíneo deve ser visível alguns segundos após a injeção (Figura 1).
   Nota: aqui, usamos a taxa de quadros = 50 frames/s, distância focal = 70 mm, e F 3.4.

6. análise macroscópica

1. Ressecar os aneurismas e o complexo arterial dos pais e avaliar a patência macroscópica abrindo a artéria mãe com Microtesoura e avaliar o lúmen da artéria mãe e o orifício do anerysm (ver Figura 1,2)⁹. Meça os tamanhos dos aneurismas. O aneurysm-pai-artéria-complexo pode então ser armazenado para uma análise mais adicional (por exemplo, histologia).

Resultados

A frequência cardíaca e a pressão arterial foram monitoradas durante a cirurgia. A frequência cardíaca média foi de 193/min em coelhos e 196/min em ratos. O peso corporal dos coelhos variou de 3,05 a 40, 5kg, e os ratos pesaram 335-690 g.

Pudemos realizar FVA em oito dos dez coelhos (Figura 1). Quatro examinações do aneurysm em dois coelhos não foram gravadas com a câmera devido às dificuldades técnicas. Não foram relatadas dificuldades técnicas envo...

Discussão

O FVA é um método promissor e não complicado para examinar vasos em roedores e pode ser realizado com dispositivos comerciais e equipamentos de prateleira. FVA pode ser executado durante toda a cirurgia onde a avaliação intraoperativa da integridade da embarcação é necessária enquanto os vasos precisam a dissecção apropriada primeiramente.

Os autores preferiram a injeção venosa à injeção arterial devido ao risco mais baixo de eventos inadvertidos tais como a infecção, a isque...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
For rabbits
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter	Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera	Sony NEX-5R
Catheter	22G Vasofix Safety
Disinfictant
Fluorescein sodium	Fluorescein Faure 10%
Glas plate
Green filter	Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Infusion pump	Perfusor Secura
Ketamine hydrochloride			any generic products
Needle	25G
Oxygen
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments			micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml, 50ml
Tape
Three-way-stopcock
Torch light
Xylazin			any generic products
For rats
Aluminium foil
Animal shaver
Black tape
Blue filter	Thorlabs MF475-35
Body warm plate
Camera	Sony NEX-5R
Disinfictant
Fluorescein sodium	Fluorescein Faure 10%
Green filter	Thorlabs MF539-43
Incontinence pad
Isoflurane
Ketamine hydrochloride			any generic products
Medetomidine hydrochloride			any generic products
Needle	25G
Oxygen
Plate
Ringer's Solution
Sterile sheets
Surgical instruments			micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor
Surgical microscope	OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Syringe 2ml, 5ml
Tape
Torch light