Generación de neuroesferas a partir de neuronas de hipocampo primario mixto y cortical esinas aisladas del e14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la generación espontánea de neuroesferas enriquecidas en células progenitoras neuronales a partir de neuronas chapadas de alta densidad. Durante el mismo experimento, cuando las neuronas se platean a una densidad más baja, el protocolo también resulta en cultivos prolongados de neuronas de rata primaria.

Resumen

El cultivo de neuronas primarias es una técnica esencial en el campo de la neurociencia. Para obtener una visión mecanicista más profunda en el cerebro, es esencial tener un modelo in vitro robusto que pueda ser explotado para varios estudios de neurobiología. Aunque los cultivos de neuronas primarias (es decir, cultivos hipocampales a largo plazo) han proporcionado a los científicos modelos, todavía no representa la complejidad de la red cerebral por completo. A raíz de estas limitaciones, un nuevo modelo ha surgido utilizando las neuroesferas, que tiene un parecido más cercano al tejido cerebral. El presente protocolo describe el revestimiento de altas y bajas densidades de neuronas corticales e hipocampales mixtas aisladas del embrión de ratas embrionarias del día 14-16 de Sprague Dawley. Esto permite la generación de neuroesferas y cultivo de neuronas primarias a largo plazo como dos plataformas independientes para llevar a cabo más estudios. Este proceso es extremadamente simple y rentable, ya que minimiza varios pasos y reactivos que anteriormente se consideraban esenciales para el cultivo de neuronas. Este es un protocolo robusto con requisitos mínimos que se pueden realizar con resultados alcanzables y más utilizado para una diversidad de estudios relacionados con la neurociencia.

Introducción

El cerebro es un circuito intrincado de células neuronales y no neuronales. Durante años, los científicos han estado tratando de obtener información sobre esta compleja maquinaria. Para ello, los neurocientíficos recurrieron inicialmente a varias líneas celulares transformadas basadas en los nervios para las investigaciones. Sin embargo, la incapacidad de estas líneas celulares clonales para formar fuertes conexiones sinápticasy axones o dendritas adecuadas han desplazado el interés científico a los cultivos de neuronas primarias 1,². El aspecto más emocionante de la cultura de neuronas primarias es que crea una oportunidad para observar y manipular las neuronas vivas³. Además, es menos complejo en comparación con el tejido neural, lo que lo convierte en un candidato ideal para estudiar la función y el transporte de varias proteínas neuronales. Recientemente, varios desarrollos en los campos de la microscopía, la genómica y la proteómica han generado nuevas oportunidades para que los neurocientíficos exploten las culturas de las neuronas^4.

Las culturas primarias han permitido a los neurocientíficos explorar los mecanismos moleculares detrás del desarrollo neuronal, analizar varias vías de señalización neuronal y desarrollar una comprensión más coherente de la sinapsis. Aunque una serie de métodos han reportado cultivos de neuronas primarias (principalmente del origen del hipocampo^5,6,7), un protocolo unificado con un medio definido químicamente que permite el cultivo a largo plazo de las neuronas es todavía es necesario. Sin embargo, las neuronas plateadas a una baja densidad se observan con mayor frecuencia, que no sobreviven a largo plazo, probablemente debido a la falta de soporte trófico⁸ que es proporcionado por las neuronas adyacentes y células gliales. Algunos métodos incluso han sugerido la co-cultura de las neuronas primarias con célulasgliales, donde las células gliales se utilizan como una capa de alimentación 9. Sin embargo, las células gliales plantean muchos problemas debido a su crecimiento excesivo, que a veces anulan el crecimiento neuronal¹⁰. Por lo tanto, teniendo en cuenta los problemas anteriores, se requiere un protocolo de cultivo neural primario más simple y rentable, que puede ser utilizado por neurobiólogos y neuroquímicos para investigaciones.

Un cultivo de neurona primaria es esencialmente una forma de cultivo 2D y no representa la plasticidad, integridad espacial o heterogeneidad del cerebro. Esto ha dado lugar a la necesidad de un modelo 3D más creíble llamado neuroesferas^11,12. Las neuroesferas presentan una plataforma novedosa para los neurocientíficos, con un parecido más cercano al cerebro real, in vivo^13. Las neuroesferas son grupos 3D no adherentes de células que son ricas en células madre neurales (NSC), células progenitoras neuronales (NPC), neuronas y astrocitos. Son una excelente fuente para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras neuronales, que se pueden utilizar para estudiar la diferenciación en varios linajes neuronales y no neuronales. Una vez más, la variabilidad dentro de los cultivos de la neuroesfera producidos utilizando los protocolos reportados anteriormente presenta una barrera a la formulación de un protocolo unificado de cultivo de la neuroesfera^14.

Este manuscrito presenta un protocolo en el que es posible generar plataformas 2D y 3D alternando densidades de chapado celular a partir de un cultivo cortical e hipocampal mixto. Se observa que en un plazo de 7 días, las neuroesferas flotantes se obtienen de neuronas chapadas de alta densidad aisladas del embrión de rata Sprague Dawley E14-E16, que tras un cultivo posterior, forman puentes e interconexiones a través de extensiones radiales de tipo glial. Del mismo modo, en las neuronas chapadas de baja densidad, se obtiene un cultivo de neuronas primarias que se pueden mantener hasta 30 días cambiando el medio de mantenimiento dos veces por semana.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales relacionados con el animal fueron aprobados por el Comité Institucional de etica animal del CSIR-Instituto Indio de Biología Química (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).

1. Preparación de reactivos y medios

1. Solución de poli-d-lisina (PDL): preparar soluciones PDL a concentraciones de 0,1 mg/ml en agua desionizada y almacenar en 4oC hasta su uso.
2. Medio de disociación: A 1 L de agua estéril desionizada filtrada, combinar los siguientes componentes en las concentraciones respectivas: cloruro de sodio (8 mg/ml), cloruro de potasio (0,4 mg/ml), fosfato potásico monobásico (0,06 mg/ml), D-glucosa (1 mg/ml), fosfato sódico dibásico (0,479 mg/ml), y 1 M HEPES [4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid; 10 mM]. Vortex todos los componentes para facilitar la mezcla adecuada y almacenar en 4 oC hasta su uso.
   NOTA: Utilice el medio de disociación en forma helada durante la disociación pero a temperatura ambiente (RT) para el lavado y otros fines.
3. Medio de chapado: el medio de chapado consta de lo siguiente: medio esencial mínimo (MEM) Eagle's con solución de sal equilibrada de Earle (BSS; 88,4%), D-glucosa (0,6%), suero de caballo (10%) y penicilina/estreptomicina (1%). Combine los componentes en las relaciones respectivas y realice el procedimiento dentro de una campana en condiciones estériles.
   NOTA: Utilice siempre un medio de chapado recién preparado para evitar la degradación de cualquier componente.
4. Medio de mantenimiento: preparar el medio de mantenimiento combinando lo siguiente en las proporciones respectivas: medio neurobasal (97%), 0,5 mM de muestra de glutamina obtenida comercialmente, suplemento libre de suero B27 (2%), y penicilina/estreptomicina (1%). Combine los componentes en las relaciones respectivas y realice el procedimiento dentro de una campana en condiciones estériles. Asegúrese de que todos los componentes estén recién preparados.

2. Preparación de los cubreobjetos

1. Tome un cubreobjetos de vidrio redondo de 12 mm de diámetro y remoje en ácido clorhídrico de 1 M (HCl) durante 4 h.
2. Transfiera los labios de las cubiertas en agua destilada usando un par de fórceps y gire suavemente para deshacerse del ácido por completo.
3. Transfiera los cubreobjetos lavados para una ronda adicional de limpieza en un vaso de precipitados que contenga 100% etanol.
4. Antes de usar los labios de las cubiertas, séquelos bien en la capucha laminar manteniéndolos en papel tisú.

3. Preparación de placas recubiertas de poli-D-lisina para el cultivo de neuronas

1. Tome dos placas de 24 pozos: una para chapado de alta densidad y otra para chapado de baja densidad. Abra los paquetes estériles sólo dentro de la campana laminar.
2. Transfiera los 12 mm de tapas de vidrio estérilen en las 24 placas de pozo.
3. Vierta 300 l de solución PDL (0,1 mg/ml en agua desionizada) en cada pocil para que cubra completamente la superficie de los labios de las cubiertas.
4. Envuelva las placas con papel de aluminio para evitar el secado y mantenerlas en la incubadora de CO₂ durante la noche.
5. Al día siguiente (antes del enchapado), aspirar la solución PDL y lavar correctamente con 300 ml de agua desionizada estéril de dos a tres veces.
6. Añadir 200 s de medio de chapado recién preparado y devolver las placas a la incubadora hasta que estén enchapados.

4. Eliminación y decapitación del feto

NOTA: Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos embalados en papel de aluminio en un autoclave a 121 oC (15 psi) durante 30 min. Esto incluye un par de tijeras de extremo romo, fórceps, fórceps finos, dos tijeras finas y una arteria fórceps para todo el procedimiento.

1. Para generar neuronas y neuroesferas, utilice una rata Sprague Dawley embarazada y marque el día con la detección de tapones vaginales como E0.
   NOTA: La referencia cultural debe realizarse entre E14-E16.
2. El día del cultivo, coloque una placa de vidrio estéril Petri en hielo y llénela con la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS).
3. Anestesiar una rata embarazada E14-E16 con una inyección intraperitoneal (i.p.) de 90 mg de ketamina/kg de peso corporal y 10 mg de xilazina/kg, luego sacrificar mediante la realización de la luxación cervical.
   NOTA: Las ratas también pueden ser eutanasiadas por una sobredosis de pentobarbital o sobredosis de ketamina con xilazina o diazepam.
4. Esterilice el abdomen de la presa rociando 70% de etanol y haga un corte en forma de V en la zona abdominal usando fórceps estériles y un par de tijeras de extremo romo.
5. Tome los sacos embrionarios cuidadosamente en la placa Petri con solución fría de HBSS.
   NOTA: No utilice los mismos fórceps y tijeras que se acaban de utilizar para la piel, ya que esto contaminará los órganos internos. Utilice un conjunto diferente de tijeras/fórceps para los órganos internos.
6. Saque los embriones de los sacos embrionarios en HBSS fresco y frío.
7. Decapita la cabeza con tijeras estériles.

5. Extirpación del cerebro y disección de la corteza con hipocampo

1. Antes de empezar, llene los platos estériles de Petri de 90 mm con HBSS frío y estéril.
2. Transfiera las cabezas en los platos estériles usando fórceps de apósito estériles y contundentes.
3. Bajo el estereomicroscopio, sostenga la cabeza de la región del hocico con fórceps estériles y serrados y retire el cerebro cortando la piel y el cráneo abiertos.
4. Recoger todos los cerebros embrionarios de la misma manera en la solución HBSS.
5. Retire todas las meninges de los hemisferios y el cerebro medio sosteniendo el tronco encefálico.
6. Retire cuidadosamente los hemisferios intactos que se asemejan a las tapas de setas que contienen el hipocampo y la corteza.
7. Recoger los hemisferios que contienen corteza e hipocampo intacto en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de medio de disociación.

6. Disociación del tejido cortical y del hipocampo en neuronas individuales

1. Permitir que los tejidos recogidos se asienten y aspiren el medio de disociación, dejando un 5%-10% de medio en él.
2. Añadir 10 ml de medio de disociación fresco al tejido, y repetir el paso 6.1 dos veces.
3. Añadir 4,5 ml de medio de disociación y 0,5 ml de 0,25% (1x) solución de trippsina EDTA (tetraacetato de diamina de etileno).
4. Mantener el tejido en la incubadora a 37oC durante 20 min para que la digestión proceda.
5. Aspirar el medio y añadir 10 ml de disociación y enchapado de medio consecutivamente a los tejidos digeridos.
6. Permita que los tejidos digeridos se asienten y aspiren el medio de disociación. Añadir 2,5 ml de medio de chapado y verter en la base de un plato estéril de 90 mm.
7. Tritura los tejidos digeridos en la base de la esquina del plato usando una punta de pipeta de 1.000 ml para ocupar el volumen mínimo.
8. Pasar la suspensión celular obtenida a través del colador celular de 70 m, excluyendo cualquier trozo de tejido.
9. Determine la densidad de las células viables utilizando el método de exclusión de tinte azul trypan y cuente el número de células en un contador de células automatizado.
   1. Para el método de exclusión de tinte azul trypan, tomar 10 s de la suspensión celular y 10 l de tinción azul trypan 0,4%, mezclar bien y añadir 10 l de la mezcla en una de las dos cámaras cerradas de los portaobjetos de la cámara desechable.
   2. Inserte la diapositiva que contiene la mezcla en el contador de celdas y obtenga la lectura.
      NOTA: El método de exclusión de tinte azul trypan se basa en el principio de que las células vivas (debido a sus membranas intactas) excluirán el tinte azul trypan y por lo tanto mostrarán un citoplasma claro, en comparación con una célula no viable que fácilmente tomará trypan azul y aparecerá azul en color¹⁵.
10. Diluir el número de células obtenidas en la placa 1,5 x 10⁵ celdas/ml para alta densidad y 20.000 celdas/ml para baja densidad en dos tubos separados que contienen 30 ml cada uno del medio de chapado.
11. Aspirar el medio de chapado previamente añadido de cada pocal y la placa 500 l de células dispersas en medio de chapado en cada pocal.
12. Después de eso, vuelva naícargo las placas a la incubadora a 37oC y 5% CO2 durante 4 h.
13. Examine las células para la adherencia bajo el microscopio 4 h después del enchapado.
14. Si hay una adherencia adecuada de las células en ambas placas, sustituya el medio en cada pocal por un medio de mantenimiento fresco de 500 ml e incubar a 37 oC.
15. Cultivo de estas neuronas cultivadas a baja densidad durante 30 días mediante el cambio del medio de mantenimiento 2x por semana.
16. Cultivo de las neuroesferas obtenidas de las neuronas chapadas de alta densidad en el mismo medio de mantenimiento transfiriéndolas a las placas de unión ultrabajas.
17. Caracterizar las neuronas y las neuroesferas inmunostaindándolas con marcadores importantes. Para la inmunocitoquímica, primero fije las células/neuroesferas usando un 4% de formaldehído durante 30 minutos en la propia placa, luego permeabilizar las células con 0.1% detergente no iónico durante 10 min.
18. Añadir anticuerpos primarios tanto para neuronas (anti-Tuj1, GFAP, O4, tau) como para neuroesferas (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) en solución salina con fosfato (PBS) a concentraciones de 1:300 e incubar durante la noche a 4oC¹⁶.
    NOTA: El Tuj1 (clase III) y el tau son marcadores positivos para las neuronas primarias, mientras que gfAP (proteína ácida fibrilar glial) y O4 (marcador de oligodendrocitos) son marcadores negativos para las neuronas primarias^17,18. En el caso de las neuroesferas, Tuj1, GFAP y Nestin sirven como marcadores positivos^19,20.
19. Al día siguiente, lave las células con PBS una o dos veces y agregue los anticuerpos secundarios apropiados en PBS a concentraciones de 1:600 a RT durante 2 horas.
    NOTA: Los anticuerpos secundarios anti-ratón o anti-Conejo se seleccionan dependiendo de las especies anfitrionas del anticuerpo primario añadido. Debe tenerse en cuenta que los anticuerpos secundarios deben conjugarse con derivados de fluorescencia adecuados para fines de microscopía de fluorescencia.
20. Lave las células de nuevo con PBS una o dos veces.
    1. Realizar la tinción nuclear de las células con Hoechst 33258 (solución de stock de 1 mg/ml en agua desionizada). Prepare 0.1% solución Hoechst en PBS de la solución de stock y agréguela a las células.
    2. Incubar las células con 0.1% de solución Hoechst durante 30 min, luego lavar de nuevo con PBS.
21. Agregue 20 oPbS de 20 ml (o medio de montaje) en la corredera y monte lentamente el cubreobjetos que contiene las celdas manchadas sobre el área de la diapositiva que contiene PBS. Sellar los márgenes de la cubierta con xibutlphthalate poliestireno xileno (DPX).
22. Realizar imágenes de las células fijas bajo un microscopio con aumento de 10x y 40x.

Resultados

En este protocolo, se ha aclarado una estrategia simple en la que se obtienen densidades de chapado de células variables de dos plataformas de cribado neuronal diferentes. Figura 1A,B ilustra la adherencia de las células después de 4 h de chapado de las neuronas en células chapadas de alta y baja densidad, respectivamente. Al observar la correcta adherencia de las neuronas como se muestra en la Figura 1, el m...

Discusión

Este protocolo describe que cómo al alterar las densidades de revestimiento celular de las neuronas primarias, se obtienen dos plataformas neuronales variables. Aunque se trata de un método sencillo, cada paso debe realizarse meticulosamente para lograr los resultados deseados. Otros métodos anteriores han reportado cultivos de neuronas primarias a largo plazo o cultivos de neuroesfera. La mayoría de los protocolos de cultivo de neuronas primarias han implicado el cultivo de neuronas hipocampales durante 3-5 semanas,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072