JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол для спонтанного поколения нейросфер, обогащенных в нервных клетках-прародителях из нейронов высокой плотности. Во время того же эксперимента, когда нейроны покрываются при более низкой плотности, протокол также приводит к длительным первичных культур нейронов крыс.

Аннотация

Первичная культура нейронов является важным методом в области неврологии. Чтобы получить более глубокие механистические идеи в мозг, важно иметь надежную модель in vitro, которая может быть использована для различных исследований нейробиологии. Хотя первичные культуры нейронов (т.е. долгосрочные гиппокампа культур) предоставили ученым модели, он еще не представляет сложность сети мозга полностью. В результате этих ограничений, новая модель возникла с использованием нейросфер, которые имеют более близкое сходство с тканью мозга. Настоящий протокол описывает покрытие высокой и низкой плотности смешанных корковых и гиппокампальных нейронов, изолированных от эмбриона эмбрионального дня 14-16 Sprague Dawley крыс. Это позволяет для генерации нейросфер и долгосрочной первичной культуры нейронов в качестве двух независимых платформ для проведения дальнейших исследований. Этот процесс чрезвычайно прост и рентабельен, так как сводит к минимуму несколько шагов и реагентов, которые ранее считались необходимыми для культуры нейронов. Это надежный протокол с минимальными требованиями, которые могут быть выполнены с достижимыми результатами и далее использоваться для разнообразия исследований, связанных с неврологией.

Введение

Мозг представляет собой сложную схему нейрональных и ненейрональных клеток. В течение многих лет ученые пытались получить представление об этом сложном механизме. Для этого нейробиологи первоначально прибегали к различным преобразованиям нервных клеточных линий для исследований. Тем не менее, неспособность этих клональных клеточных линий, чтобы сформировать сильные синаптические связи и надлежащие аксоны или дендриты сместили научный интерес к первичным культурам нейронов1,2. Наиболее захватывающим аспектом первичной культуры нейронов является то, что она создает возможность наблюдать и манипулировать живыми нейронами3. Кроме того, он менее сложен по сравнению с нервной тканью, что делает его идеальным кандидатом для изучения функции и транспортировки различных нейрональных белков. В последнее время несколько разработок в области микроскопии, геномики и протеомики создали новые возможности для нейробиологов, чтобы использовать нейронных культур4.

Первичные культуры позволили нейробиологам исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе нейронного развития, анализировать различные нервные сигнальные пути и развивать более последовательное понимание синапсиса. Хотя ряд методов сообщили культур из первичных нейронов (в основном из гиппокампа происхождения5,6,7), единый протокол с химически определенной среде, которая позволяет долгосрочной культуры нейронов по-прежнему необходимо. Тем не менее, нейроны покрытием при низкой плотности чаще всего наблюдаются, которые не выживают в долгосрочной перспективе, вероятно, из-за отсутствия трофической поддержки 8, которая обеспечивается соседних нейронов и глиальных клеток. Некоторые методы даже предложили совместного культивирования первичных нейронов с глиальными клетками,в которых глиальные клетки используются в качестве фидерного слоя 9. Тем не менее, глиальные клетки создают много проблем из-за их разрастания, которые иногда переопределить роста нейронов10. Таким образом, учитывая проблемы выше, более простой и экономичный протокол первичной нейронной культуры не требуется, который может быть использован как нейробиологов и нейрохимиков для исследований.

Первичная культура нейронов по существу является формой 2D-культуры и не представляет пластичность, пространственную целостность или неоднородность мозга. Это привело к необходимости более правдоподобной 3D-модели под названием нейросферы11,12. Нейросферы представляют новую платформу для нейробиологов, с более близким сходством с реальным, in vivo мозга13. Нейросферы являются неадекторными 3D-кластерами клеток, богатых нервными стволовыми клетками (НСК), нервными клетками-прародителями (НпК), нейронами и астроцитами. Они являются отличным источником для изоляции нервных стволовых клеток и нервных клеток-прародителей, которые могут быть использованы для изучения дифференциации в различные нейронные и ненейронные линии. Опять же, изменчивость в нейросферных культурах, производимых с использованием ранее сообщенных протоколов, представляет собой барьер для разработки единого протокола культуры нейросферы14.

Данная рукопись представляет собой протокол, в котором можно генерировать как 2D, так и 3D платформы путем чередования плотности клеточного покрытия от смешанной корковой и гиппокампальной культуры. Отмечается, что в течение 7 дней свободно плавающие нейросферы получаются из высокой плотности покрытых нейронов, изолированных от E14-E16 Sprague Dawley крысы эмбриона, которые на дальнейшее культуры, образуют мосты и взаимосвязи через радиальные глиально-подобные расширения. Аналогичным образом, в низкой плотности покрывало нейронов, первичной культуры нейронов, которые могут быть сохранены до 30 дней, получается путем изменения среднего обслуживания два раза в неделю.

протокол

Все экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).

1. Подготовка реагентов и средств массовой информации

  1. Поли-D-лизина (PDL) раствор: подготовить PDL растворы в концентрации 0,1 мг/мл в деионизированной воде и хранить в 4 градусов по Цельсию до использования.
  2. Среда диссоциации: до 1 л стерильной, фильтрованной деионизированной воды, сочетайте следующие компоненты в соответствующих концентрациях: хлорид натрия (8 мг/мл), хлорид калия (0,4 мг/мл), монобасичный калий фосфат (0,06 мг/мл), D-глюкоза-глюкоза (1 мг/мл), фосфат натрия дибасический (0,479 мг/мл) и 1 M HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанетанесульфоновая кислота; 10 м/м/ 10 м/м. Vortex все компоненты, чтобы помочь надлежащего смешивания и хранить в 4 кК до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среду диссоциации в ледяной форме во время диссоциации, но при комнатной температуре (RT) для стирки и других целей.
  3. Среда покрытия: среда покрытия состоит из следующих: минимальная необходимая среда (MEM) Eagle's с сбалансированным соляным раствором Earle (BSS; 88,4%), D-глюкозой (0,6%), сывороткой лошади (10%) и пенициллином/стрептомицином (1%). Объедините компоненты в соответствующих соотношениях и выполняйте процедуру внутри капота в стерильных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленный средство покрытия, чтобы избежать деградации любого компонента.
  4. Средняя среда обслуживания: подготовить среду обслуживания, объединив следующие в соответствующих соотношениях: нейробазальная среда (97%), 0,5 мМ коммерчески полученный пробы глутамина, безсыворотка B27 добавка (2%), и пенициллин/стрептомицин (1%). Объедините компоненты в соответствующих соотношениях и выполняйте процедуру внутри капота в стерильных условиях. Убедитесь, что все компоненты недавно подготовлены.

2. Подготовка обложек

  1. Возьмите 12 мм диаметром круглый стеклянный покрывало и замочите его в 1 M соляной кислоты (HCl) в течение 4 ч.
  2. Передача coverslips в дистиллированной воде с помощью пары щипц и закружить его осторожно, чтобы избавиться от кислоты полностью.
  3. Перенесите промытые крышки для дополнительного раунда очистки в стакане, содержащем 100% этанол.
  4. Перед использованием крышки, высушить их хорошо в ламинар ный капот, держа их на бумаге.

3. Подготовка поли-D-лизин покрытием пластин для культуры нейронов

  1. Возьмите две 24 пластины хорошо: один для высокой плотности покрытия, а другой для низкой плотности покрытия. Откройте стерильные пакеты только внутри ламинарного капюшона.
  2. Перенесите 12 мм стерильных стеклянных крышкв в 24 колодца.
  3. Налейте 300 л раствора PDL (0,1 мг/мл в деионизированной воде) в каждую скважину, чтобы она полностью покрывала поверхность крышки.
  4. Оберните пластины с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить сушки и держать его в ИНкубаторCO2 на ночь.
  5. На следующий день (перед покрытием) аспирировать раствор PDL и правильно промыть 300 л стерильной деионированной воды два-три раза.
  6. Добавьте 200 л свежеприготовленного покрытия среды и верните пластины в инкубатор до покрытия.

4. Удаление и обезглавливание плода

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать все хирургические инструменты упакованы в алюминиевую фольгу в автоклаве на 121 кв (15 psi) в течение 30 мин. Это включает в себя пару тупых ножниц, щипцы, тонкие щипцы, два тонких ножницы, и одна артерия щипцы для всей процедуры.

  1. Для генерации нейронов и нейросфер, используйте приурочен беременных Sprague Dawley крысы и отметить день с вагинальным обнаружением плагина, как E0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культура должна быть выполнена между E14-E16.
  2. В день культуры поместите стерильный стеклянный петри плиту на лед и заполните ее холодным сбалансированным соляным раствором Хэнка (HBSS).
  3. Анестезия E14-E16 беременной крысы с интраперитонеальной (т.п.) инъекции 90 мг кетамина / кг массы тела и 10 мг ксилазин / кг, а затем жертвовать, выполняя вывих шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы также могут быть усыплены передозировкой пентобарбитала или передозировки кетамина с ксилазином или диазепамом.
  4. Стерилизовать брюшной полости плотины путем распыления 70% этанола и сделать V-образный разрез в брюшной области с помощью стерильных щипцы и пары тупых ножниц.
  5. Тщательно возьмите эмбриональные мешки на пластину Петри с холодным раствором HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте те же щипцы и ножницы, которые только что были использованы для кожи, так как это будет загрязнять внутренние органы. Используйте другой набор ножниц / щипцы для внутренних органов.
  6. Возьмите эмбрионы из эмбриональных мешков в свежем, холодном HBSS.
  7. Обезглавить голову стерильными ножницами.

5. Удаление головного мозга и вскрытие коры головного мозга гиппокампом

  1. Перед началом заполните 90 мм стерильных блюд Петри холодным, стерильным HBSS.
  2. Перенесите головки в стерильные посуды с помощью стерильных, тупых перевязочных щипц.
  3. Под стереомикроскопом удерживайте голову от области мснаряда стерильными, зубчатыми щипками и удаляйте мозг, разрезая кожу и череп.
  4. Соберите все эмбриональные мозги одинаково в растворе HBSS.
  5. Удалите все олени из полушарий и среднего мозга, удерживая ствол мозга.
  6. Тщательно удалите нетронутые полушария, напоминающие грибные шапки, которые содержат гиппокамп и кору головного мозга.
  7. Соберите полушария, содержащие кору и нетронутый гиппокамп в конической трубке 15 мл, содержащей 10 мл диссоциационистской среды.

6. Диссоциация корковой и гиппокампальной ткани на одиночные нейроны

  1. Разрешить собранные ткани, чтобы успокоиться и аспирировать диссоциации среды, оставляя 5%-10% среды в нем.
  2. Добавьте 10 мл свежей среды диссоциации к ткани и повторите шаг 6.1 дважды.
  3. Добавьте 4,5 мл раствора диссоциации и 0,5 мл 0,25% (1x) трипсина EDTA (этилен диамин тетраацетат) раствор.
  4. Держите ткани в инкубаторе при 37 градусах По Цельсию в течение 20 минут для пищеварения, чтобы продолжить.
  5. Усиливайте среду и добавляйте 10 мл диссоциации и покрытие среднего последовательно к переваренных тканей.
  6. Разрешить переваренных тканей, чтобы успокоиться и аспирировать диссоциации среды. Добавьте 2,5 мл покрытия среднего и вылейте в основание стерильной тарелки 90 мм.
  7. Triturate переваренных тканей в угловой базе блюда с помощью 1000 л пипетки отзыв, чтобы занять минимальный объем.
  8. Пройдите полученную суспензию клеток через 70 мкм-ситечко, исключая любые куски ткани.
  9. Определите плотность жизнеспособных клеток с помощью метода исключения трипан синего красителя и подсчитайте количество клеток в автоматизированном клеточном счетчике.
    1. Для trypan синий метод исключения красителя, принять 10 зл и 10 зл и 10 зл 0,4% trypan голубое пятно, тщательно перемешать, и добавить 10 зл/ смеси в одном из двух закрытых камер одноразовых слайдов камеры.
    2. Вставьте слайд, содержащий смесь в счетчик ячейки и получить показания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод исключения трипан синий краситель основан на принципе, что живые клетки (из-за их нетронутыми мембраны) исключит трипан синий краситель и, следовательно, показать четкую цитоплазму, по сравнению с нежизнеспособной клетки, которые легко занимают trypan синий и появляются синий в цвет15.
  10. Разбавить количество клеток, полученных в пластине 1,5 х 105 клеток/мл для высокой плотности и 20000 клеток/мл для низкой плотности в двух отдельных трубах, содержащих 30 мл каждая из среды покрытия.
  11. Аспирированный ранее добавленный средство покрытия от каждого колодца и пластины 500 зл и клеток, рассеянных в среде покрытия в каждой скважине.
  12. После этого вернуть пластины в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2 на 4 ч.
  13. Изучите клетки на соответствие под микроскопом 4 ч после покрытия.
  14. При правильном присоединении клеток в обеих пластинах замените среду в каждой скважине 500 л свежей среды обслуживания и инкубация при 37 градусах Цельсия.
  15. Культура этих нейронов выросли при низкой плотности в течение 30 дней, изменив обслуживание среднего 2x в неделю.
  16. Культура нейросфер, полученных из высокой плотности покрывало нейронов в той же среде обслуживания путем передачи их на ультра-низкие пластины крепления.
  17. Характеризуй нейроны и нейросферы, иммуноспотихих их с важными маркерами. Для иммуноцитохимии сначала зафиксировать клетки/нейросферы, используя 4% формальдегида в течение 30 мин на самой пластине, затем пронизать клетки с помощью 0,1% неионных моющих средств в течение 10 мин.
  18. Добавить первичные антитела для обоих нейронов (анти-Tuj1, GFAP, O4, тау) и нейросфер (анти-Нестин, GFAP, Tuj1) в фосфат-буферных солей (PBS) в 1:300 концентрации и инкубировать ночь на 4 C16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Tuj1 (класс III -тубулин) и тау являются положительными маркерами для первичных нейронов, в то время как GFAP (глиальный фибриллокислый кислый белок) и O4 (маркер олигодендроцита) являются отрицательными маркерами для первичных нейронов17,18. В случае нейросфер, Tuj1, GFAP, и Nestin все служат в качестве положительных маркеров19,20.
  19. На следующий день, мыть клетки с PBS один или два раза и добавить соответствующие вторичные антитела в PBS на 1:600 концентрации на RT для 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-мышь или анти-Кролик вторичные антитела выбираются в зависимости от вида хозяина первичного антитела добавил. Следует иметь в виду, что вторичные антитела должны быть спряжены к производным флуоресценции, пригодным для флуоресценции микроскопических целей.
  20. Вымойте клетки снова с PBS один или два раза.
    1. Выполните ядерное окрашивание клеток с помощью Hoechst 33258 (1 мг/мл бульонного раствора в деионизированной воде). Приготовьте 0,1% раствор Hoechst в PBS из биржевого раствора и добавьте его в клетки.
    2. Инкубировать клетки с 0,1% Hoechst раствор в течение 30 минут, затем снова мыть с PBS.
  21. Добавьте 20 Л ПБС (или монтажной среды) на слайде и медленно смонтируйте крышку, содержащую окрашенные клетки, над областью слайда, содержащей PBS. Печать края крышки с дибутилфталат полистирол ксилена (DPX).
  22. Выполните визуализацию фиксированных клеток под микроскопом при 10x и 40x увеличении.

Результаты

В этом протоколе была выяснена простая стратегия, в которой получается плотность с переменным покрытием клеток с двух различных платформ скрининга нейронов. Рисунок 1A,B иллюстрирует соблюдение клеток после 4 ч покрытия нейронов в высокой и ни?...

Обсуждение

Этот протокол описывает, что, изменяя плотность клеточного покрытия первичных нейронов, получаются две переменные нейронные платформы. Хотя это простой метод, каждый шаг должен быть тщательно выполнен для достижения желаемых результатов. Другие предыдущие методы либо сообщили долгос...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Мы благодарим животноводческий объект CSIR-IICB. Г.Д. благодарит ICMR, J. K. и V. G. thank DST Inspire, и D. M. благодарит DBT, Индия за их стипендии. S. G. любезно признает SERB (EMR/2015/002230) Индия для оказания финансовой поддержки.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFAPAbcamAB7260
Anti- NestinAbcamAB92391
Anti-O4MilliporeMAB345
Anti-TauAbcamAB76128
Anti-Tuj1MilliporeMAB1637
B27 Serum Free Supplement Gibco17504-044
Cell CounterLife technologiesCountess II FL
CO2 IncubatorEppendorfGalaxy 170 R
D-glucose SDFCL38450-K05
EthanolMerck Millipore100983
Fluorescence MicroscopeOlympusIX83 Model
FormaldehydeSigma Aldrich47608
GlutaMax-I SupplementGibco35050-061
GtXMs IgG FluorMilliporeAP1814
GtXMs IgG (H+L)MilliporeAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
Horse Serum HiMediaRM10674
Hydrochloric AcidRankemH0100
Laminar HoodBioBaseBBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS Sigma AldrichM-2279
MicroscopeDewinterVictory Model
Neurobasal Medium Gibco21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)BD Falcon353047, 352350 and 3471
90 mm PetridishesHimediaPW001
Penicillin/Streptomycin Gibco15140-122
Poly-D-LysineMilliporeA.003.E
Potassium Chloride Fisher ScientificBP366-500
Potassium Phosphate Monobasic MerckMI6M562401
Sodium Chloride Qualigem15918
Sodium Phosphate Dibasic MerckMI6M562328
StereomicrosopeDewinterZoomstar Model
Triton-X 100SRL2020130
Trypan Blue SolutionGibco15250-061
0.25 % Trypsin-EDTAGibco25200-072

Ссылки

  1. Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
  2. Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
  3. Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
  4. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
  5. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
  6. Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
  7. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
  8. Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
  9. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  10. Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
  11. Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
  12. Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
  13. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  16. Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
  17. Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
  18. Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  19. Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
  20. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
  21. Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
  22. Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
  23. Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
  24. Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
  25. Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
  26. Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150Sprague DawleyNPCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены