Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.

Abstract

La cultura primaria dei neuroni è una tecnica essenziale nel campo delle neuroscienze. Per ottenere approfondimenti meccanicistici nel cervello, è essenziale avere un robusto modello in vitro che può essere sfruttato per vari studi di neurobiologia. Anche se le colture neuronali primarie (cioè le colture ippocampali a lungo termine) hanno fornito agli scienziati modelli, non rappresentano ancora completamente la complessità della rete cerebrale. Sulla scia di queste limitazioni, è emerso un nuovo modello usando le neurosfere, che assomiglia più in sé al tessuto cerebrale. Il presente protocollo descrive la placcatura di densità alte e basse di neuroni corticali e ippocampali misti isolati dall'embrione dei ratti Sprague Dawley del giorno embrionale 14-16. Questo permette per la generazione di neurosfere e la cultura dei neuroni primari a lungo termine come due piattaforme indipendenti per condurre ulteriori studi. Questo processo è estremamente semplice e conveniente, in quanto riduce al minimo diversi passaggi e reagenti precedentemente ritenuti essenziali per la coltura dei neuroni. Questo è un protocollo robusto con requisiti minimi che possono essere eseguiti con risultati raggiungibili e ulteriormente utilizzati per una varietà di studi relativi alle neuroscienze.

Introduzione

Il cervello è un intricato circuito delle cellule neuronali e non neuronali. Per anni, gli scienziati hanno cercato di ottenere informazioni su questo complesso meccanismo. Per farlo, i neuroscienziati inizialmente hanno fatto ricorso a varie linee cellulari basate sui nervi trasformate per le indagini. Tuttavia, l'incapacità di queste linee cellulari clonali di formare forti connessioni sinaptiche e assoni o dendriti adeguati ha spostato l'interesse scientifico alle colture neuronali primarie^1,2. L'aspetto più eccitante della cultura neuronale primaria è che crea l'opportunità di osservare e manipolare i neuroni viventi³. Inoltre, è meno complesso rispetto al tessuto neurale, che lo rende un candidato ideale per studiare la funzione e il trasporto di varie proteine neuronali. Recentemente, diversi sviluppi nei campi della microscopia, genomica e proteomica hanno generato nuove opportunità per i neuroscienziati di sfruttare le colture neuronali⁴.

Le culture primarie hanno permesso ai neuroscienziati di esplorare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo neurale, analizzare vari percorsi di segnalazione neurale e sviluppare una comprensione più coerente della sinapsi. Anche se un certo numero di metodi hanno segnalato colture da neuroni primari (per lo più dall'origine ippocampale^5,6,7), un protocollo unificato con un mezzo definito chimicamente che consente la coltura a lungo termine dei neuroni è ancora necessario. Tuttavia, neuroni placcati a bassa densità sono più spesso osservati, che non sopravvivono a lungo termine, probabilmente a causa della mancanza di supporto trofico⁸ che è fornito dai neuroni adiacenti e cellule gliali. Alcuni metodi hanno anche suggerito la cocoltura dei neuroni primari con cellule gliali, in cui le cellule gliali vengono utilizzate come strato di alimentazione⁹. Tuttavia, le cellule gliali pongono un sacco di problemi a causa della loro crescita eccessiva, che a volte sostituiscono la crescita neuronale¹⁰. Quindi, considerando i problemi di cui sopra, è necessario un protocollo di coltura neurale primaria più semplice e più conveniente, che può essere utilizzato sia dai neurobiologi che dai neurochimici per le indagini.

Una cultura neuronale primaria è essenzialmente una forma di cultura 2D e non rappresenta la plasticità, l'integrità spaziale o l'eterogeneità del cervello. Questo ha dato origine alla necessità di un modello 3D più credibile chiamato neurosfere^11,12. Le neurosfere presentano una nuova piattaforma per i neuroscienziati, con una somiglianza più stretta con il vero cervello in vivo¹³. Le neurosfere sono cluster 3D non aderenti di cellule ricche di cellule staminali neurali (NSC), cellule progenitrici neurali (NPC), neuroni e astrociti. Sono un'ottima fonte per l'isolamento delle cellule staminali neurali e delle cellule progenitrici neurali, che possono essere utilizzate per studiare la differenziazione in varie linee neuronali e non neuronali. Ancora una volta, la variabilità all'interno delle culture della neurosfera prodotte utilizzando i protocolli precedentemente riportati presenta una barriera alla formulazione di un protocollo di coltura della neurosfera unificata¹⁴.

Questo manoscritto presenta un protocollo in cui è possibile generare piattaforme 2D e 3D alternando densità di placcatura cellulare da una coltura misa corticale e ippocampale. Si osserva che entro 7 giorni le neurosfere fluttuanti sono ottenute da neuroni placcati ad alta densità isolati dall'embrione di ratto E14-E16 Sprague Dawley, che su ulteriore cultura, formano ponti e interconnessioni attraverso estensioni radiali simili agli gliali. Allo stesso modo, nei neuroni placcati a bassa densità, una coltura neuronale primaria che può essere mantenuta fino a 30 giorni si ottiene cambiando il mezzo di manutenzione due volte alla settimana.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono animali sono state approvate dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali del CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).

1. Preparazione del reagente e dei supporti

1. Soluzione polid-lysina (PDL): preparare soluzioni PDL a concentrazioni di 0,1 mg/mL in acqua deionizzata e conservare in 4 gradi centigradi fino all'uso.
2. Mezzo di dissociazione: A 1 L di acqua sterile, filtrata deionizzata, combinare i seguenti componenti nelle rispettive concentrazioni: cloruro di sodio (8 mg/mL), cloruro di potassio (0,4 mg/mL), fosfato di potassio monobasico (0,06 mg/mL), D-glucosio (1 mg/mL), fosfato dibase dibasic (0,479 mg/mL) e 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanethanfonic acid; 10 mM]. Vortex tutti i componenti per aiutare la corretta miscelazione e conservare in 4 gradi centigradi fino all'uso.
   NOTA: Utilizzare il mezzo di dissociazione in forma gelida durante la dissociazione ma a temperatura ambiente (RT) per il lavaggio e altri scopi.
3. Il mezzo di placcatura: mezzo di placcatura è costituito dai seguenti: mezzo essenziale minimo (MEM) Eagle's con Earle's Balanced Salt Solution (BSS; 88,4%), D-glucose (0,6%), siero di cavallo (10%), penicillina/streptomicina (1%). Combinare i componenti nei rispettivi rapporti ed eseguire la procedura all'interno di un cappuccio in condizioni sterili.
   NOTA: Utilizzare sempre il mezzo di placcatura appena preparato per evitare la degradazione di qualsiasi componente.
4. Mezzo di manutenzione: preparare il mezzo di manutenzione combinando quanto segue nei rispettivi rapporti: mezzo neurobasale (97%), 0,5 mM di glutammina ottenuta commercialmente, integratore B27 senza siero (2%) e penicillina/streptomimina (1%). Combinare i componenti nei rispettivi rapporti ed eseguire la procedura all'interno di un cappuccio in condizioni sterili. Assicurarsi che tutti i componenti siano appena preparati.

2. Preparazione di copricoperture

1. Prendi una vetrina di vetro rotonda di 12 mm di diametro e immergilo in acido cloridrico da 1 M (HCl) per 4 h.
2. Trasferire i coperchi in acqua distillata utilizzando un paio di pinze e ruotarlo delicatamente per sbarazzarsi completamente dell'acido.
3. Trasferire i copriletti lavati per un ulteriore giro di pulizia in un becher contenente 100% etanolo.
4. Prima di utilizzare i copricopro, asciugarli bene nel cofano laminare tenendoli su carta velina.

3. Preparazione di piastre rivestite poli-D-lisina per la coltura dei neuroni

1. Prendere due 24 piatti ben: uno per placcatura ad alta densità e un altro per placcatura a bassa densità. Aprire i pacchetti sterili solo all'interno del cofano laminare.
2. Trasferire i 12 mm di vetro sterile coverslips nelle 24 piastre bene.
3. Versare 300 l di soluzione PDL (0,1 mg/mL in acqua deionizzata) in ogni pozzo in modo che copra completamente la superficie dei coprilabbra.
4. Avvolgere le piastre con un foglio di alluminio per evitare l'essiccazione e tenerlo nell'incubatrice di CO₂ durante la notte.
5. Il giorno successivo (prima della placcatura), aspirare la soluzione PDL e lavare correttamente con 300 l di acqua sterile ionizzata due o tre volte.
6. Aggiungere 200 l di mezzo di placcatura appena preparato e riportare le piastre all'incubatrice fino alla placcatura.

4. Rimozione e decapitazione del feto

NOTA: Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici confezionati in un foglio di alluminio in un'autoclave a 121 gradi centigradi (15 psi) per 30 min. Questo include un paio di forbici smussate, pinze, pinze sottili, due forbici sottili e una pinze arteriosa per l'intera procedura.

1. Per generare neuroni e neurosfere, utilizzare un ratto Sprague Dawley incinta a tempo e contrassegnare la giornata con il rilevamento della spina vaginale come E0.
   NOTA: le impostazioni cultura devono essere eseguite tra E14-E16.
2. Il giorno della cultura, mettere una piastra di Petri di vetro sterile sul ghiaccio e riempirla con la soluzione fredda di sale equilibrato di Hank (HBSS).
3. Anestesizzare un ratto in gravidanza E14-E16 con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 90 mg ketamina/kg di peso corporeo e 10 mg di xilosina/kg, quindi sacrificio eseguendo la lussazione cervicale.
   NOTA: I ratti possono anche essere eutanasia da un sovradosaggio di pentobarbital o sovradosaggio di ketamina con xillazina o diazepam.
4. Sterilizzare l'addome della diga spruzzando il 70% di etanolo e facendo un taglio a V nella zona addominale utilizzando pinze sterili e un paio di forbici smussate.
5. Prendere le sacche embrionali con attenzione sulla piastra Petri con soluzione HBSS fredda.
   NOTA: Non utilizzare le stesse pinze e forbici che sono state usate solo per la pelle, in quanto ciò contamina gli organi interni. Utilizzare un diverso set di forbici/pinze per gli organi interni.
6. Togliere gli embrioni dalle sacche embrionali in HBSS fresco e freddo.
7. Decapitare la testa con forbici sterili.

5. Rimozione del cervello e dissezione della corteccia con ippocampo

1. Prima di iniziare, riempire 90 mm sterile petri piatti con freddo, sterile HBSS.
2. Trasferire le teste nei piatti sterili utilizzando pinze di condimento sterili e contundenti.
3. Sotto lo stereoscopio, tieni la testa dalla regione del muso con pinze sterili e seghettate e rimuovi il cervello tagliando la pelle e il cranio aperti.
4. Raccogliere tutti i cervelli embrionali nello stesso modo nella soluzione HBSS.
5. Rimuovere tutte le meningi dagli emisferi e midbrain tenendo il tronco encefalico.
6. Rimuovere con attenzione gli emisferi intatti simili a tappi di funghi che contengono l'ippocampo e la corteccia.
7. Raccogliere gli emisferi contenenti corteccia e ippocampo intatto in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di mezzo di dissociazione.

6. Dissociazione del tessuto corticale e ippocampale in singoli neuroni

1. Permettere ai tessuti raccolti di stabilirsi e aspirare il mezzo di dissociazione, lasciando il 5%-10% del mezzo in esso.
2. Aggiungere 10 mL di mezzo di dissociazione fresco al tessuto e ripetere il passaggio 6.1 due volte.
3. Aggiungere 4,5 mL di mezzo di dissociazione e 0,5 mL di 0,25% (1x) trypsin EDTA (etilene diamine tetraacetate) soluzione.
4. Conservare il tessuto nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 20 min affinché la digestione proceda.
5. Aspirare il mezzo e aggiungere 10 mL di dissociazione e plating medio consecutivamente ai tessuti digeriti.
6. Lasciare che i tessuti digeriti si stabiliscano e aspirano il mezzo di dissociazione. Aggiungere 2,5 mL di plating medium e versare nella base di un piatto sterile da 90 mm.
7. Triturare i tessuti digeriti nella base angolare del piatto utilizzando una punta di pipetta da 1.000 lun per occupare il volume minimo.
8. Passare la sospensione cellulare ottenuta attraverso il colino cellulare di 70 m, esclusi eventuali pezzi di tessuto.
9. Determinare la densità delle cellule vitali utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu trypan e contare il numero di celle in un contatore cellulare automatizzato.
   1. Per il metodo di esclusione dei coloranti blu trypan, prendere 10 L della sospensione cellulare e 10 l una di 0,4% di colore blu trypan, mescolare accuratamente e aggiungere 10 l l della miscela in una delle due camere racchiuse dei vetrini della camera usa e getta.
   2. Inserire la diapositiva contenente la miscela nel contatore cellulare e ottenere la lettura.
      NOTA: Il metodo di esclusione del colorante blu trypan si basa sul principio che le cellule vive (a causa delle loro membrane intatte) escluderà il colorante blu trypan e mostrerà quindi un chiaro citoplasma, rispetto a una cellula non vitale che prenderà facilmente il blu trypan e apparirà blu in colore¹⁵.
10. Diluire il numero di cellule ottenute per placcare 1,5 x 10⁵ cellule/mL per un'alta densità e 20.000 cellule/mL per una bassa densità in due tubi separati contenenti 30 mL ciascuno del mezzo di placcatura.
11. Aspirare il mezzo di placcatura precedentemente aggiunto da ogni pozzo e piastra 500 L di cellule disperse nel mezzo di placcatura in ogni pozzo.
12. Dopo di che riportare le piastre all'incubatrice a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂ per 4 h.
13. Esaminare le cellule per l'aderenza al microscopio 4 h dopo la placcatura.
14. Se c'è una corretta aderenza delle cellule in entrambe le piastre, sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 l di mezzo di manutenzione fresca e incubare a 37 .
15. Cultura questi neuroni coltivati a bassa densità per 30 giorni modificando il mezzo di manutenzione 2x a settimana.
16. Cultura le neurosfere ottenute dai neuroni placcati ad alta densità nello stesso mezzo di manutenzione trasferendoli alle piastre di fissaggio ultra-basse.
17. Caratterizzare i neuroni e le neurosfere immunostaining con marcatori importanti. Per l'immunocitochimica, prima fissa le cellule/neurosfere usando il 4% di formaldeide per 30 min sulla piastra stessa, quindi permeabilizza le cellule con il detergente non ionico dello 0,1% per 10 min.
18. Aggiungere anticorpi primari per entrambi i neuroni (anti-Tuj1, GFAP, O4, tau) e le neurosfere (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) in salina con buffer fosfati (PBS) a 1:300 concentrazioni e incubare per la notte durante la notte a 4 gradi^centigradi.
    NOTA: Il Tuj1 (classe III z-tubulina) e il tau sono marcatori positivi per i neuroni primari, mentre GFAP (proteina acidica fibrillare gliale) e O4 (marcatore oligodendrocite) sono marcatori negativi per i neuroni primari^17,18. Nel caso delle neurosfere, Tuj1, GFAP e Nestin servono tutti come marcatori positivi^19,20.
19. Il giorno successivo, lavare le cellule con PBS una o due volte e aggiungere gli anticorpi secondari appropriati in PBS a 1:600 concentrazioni a RT per 2 h.
    NOTA: Gli anticorpi secondari anti-mouse o anti-coniglio vengono selezionati a seconda delle specie ospiti dell'anticorpo primario aggiunto. Va tenuto presente che gli anticorpi secondari devono essere coniugati a derivati a fluorescenza adatti a scopi di microscopia a fluorescenza.
20. Lavare nuovamente le cellule con PBS una o due volte.
    1. Eseguire la colorazione nucleare delle cellule con Hoechst 33258 (1 soluzione di stock mg/mL in acqua deionizzata). Preparare la soluzione Hoechst 0,1% in PBS dalla soluzione di stock e aggiungerla alle celle.
    2. Incubare le cellule con soluzione Hoechst 0.1% per 30 min, quindi lavare di nuovo con PBS.
21. Aggiungere 20 PBS (o supporto di montaggio) sul vetrino e montare lentamente lo scivolo contenente le celle macchiate sull'area del vetrino contenente PBS. Sigillare i margini della coverslip con xylene in polistirolo diabillico (DPX).
22. Eseguire l'imaging delle cellule fisse al microscopio a ingrandimento 10x e 40x.

Risultati

In questo protocollo, è stata chiarita una semplice strategia in cui si ottengono densità di placcatura a cellule variabili da due diverse piattaforme di screening neurale. La figura 1A,B illustra l'aderenza delle cellule dopo 4 h di placcatura dei neuroni in cellule placcate ad alta e bassa densità, rispettivamente. Osservando la corretta aderenza dei neuroni, come mostrato nella Figura1, il mezzo di placcatu...

Discussione

Questo protocollo descrive che come alterando la densità di placcatura cellulare dei neuroni primari, si ottengono due piattaforme neuronali variabili. Anche se questo è un metodo semplice, ogni passo deve essere eseguita meticolosamente per ottenere i risultati desiderati. Altri metodi precedenti hanno segnalato colture di neuroni primari a lungo termine o culture della neurosfera. La maggior parte dei protocolli di coltura neuronale primaria hanno coinvolto la coltura dei neuroni ippocampali per 3-5 settimane, ma la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072