E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Özet

Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.

Özet

Birincil nöron kültürü nörobilim alanında önemli bir tekniktir. Beyne daha derin mekanik anlayışlar elde etmek için, çeşitli nörobiyoloji çalışmaları için istismar edilebilir sağlam bir in vitro modeli olması esastır. Birincil nöron kültürleri (yani, uzun vadeli hipokampal kültürler) modelleri ile bilim adamları sağlamıştır rağmen, henüz tamamen beyin ağının karmaşıklığını temsil etmez. Bu sınırlamaların ardından, beyin dokusuna daha yakın bir benzerlik taşıyan nörosferler kullanılarak yeni bir model ortaya çıkmıştır. Bu protokol, embriyonik gün 14-16 Sprague Dawley sıçanlarının embriyosundan izole edilmiş karışık kortikal ve hipokampal nöronların yüksek ve düşük yoğunluklarının kaplamasını tanımlar. Bu nörosferler ve uzun vadeli birincil nöron kültürünün üretimi için iki bağımsız platformlar olarak daha fazla çalışma yürütmek için izin verir. Bu süreç son derece basit ve uygun maliyetli, birkaç adım ve reaktifler daha önce nöron kültürü için gerekli kabul en aza indirir gibi. Bu, ulaşılabilen sonuçlarla yapIlebilen ve nöroloji ile ilgili çeşitli çalışmalarda daha fazla kullanılabilen en az gereksinime sahip sağlam bir protokoldür.

Giriş

Beyin nöronal ve non-nöronal hücrelerin karmaşık bir devre olduğunu. Yıllardır, bilim adamları bu karmaşık makine hakkında bilgi edinmeye çalışıyorlar. Bunu yapmak için, nörologlar başlangıçta çeşitli dönüştürülmüş sinir tabanlı hücre hatları soruşturmalar için başvurdu. Ancak, güçlü sinaptik bağlantılar ve uygun akson veya dendritler oluşturmak için bu klonal hücre hatlarıyetersizlik birincil nöron kültürleri¹bilimsel ilgi kaymıştır^{1 ,2}. Birincil nöron kültürünün en heyecan verici yönü gözlemlemek ve yaşayan nöronları işlemek için bir fırsat oluşturur^{olmasıdır 3}. Ayrıca, nöral doku ile karşılaştırıldığında daha az karmaşıktır, hangi fonksiyon ve çeşitli nöronal proteinlerin taşınması için ideal bir aday yapar. Son zamanlarda, mikroskopik, genomik ve proteomik alanlarında çeşitli gelişmeler nöron kültürleri yararlanmak için nörologlar için yeni fırsatlar yarattık⁴.

Birincil kültürler nörologların nöral gelişimin arkasındaki moleküler mekanizmaları keşfetmelerine, çeşitli sinirsel sinyal yollarını analiz etmelerine ve sinaps hakkında daha tutarlı bir anlayış geliştirmelerine olanak sağlamıştır. Yöntemlerin bir dizi birincil nöronlar kültürleri rapor olmasına rağmen (çoğunlukla hipokampal kökenli^5,6,7), nöronların uzun vadeli kültür sağlayan kimyasal olarak tanımlanmış bir orta ile birleşik bir protokol hala gerekli. Ancak, düşük yoğunluklu kaplama nöronlar en sık gözlenir, hangi uzun vadeli hayatta değil, muhtemelen komşu nöronlar ve glial hücreler tarafından sağlanan trofik destek eksikliği nedeniyle^8. Bazı yöntemler bile glial hücreleri ile birincil nöronların co-kültüre önerdi, glial hücreler bir besleyici tabaka olarak kullanılan nerede⁹. Ancak, glial hücreler bazen nöronal büyüme geçersiz kılınan aşırı büyüme nedeniyle bir çok sorun teşkil¹⁰. Bu nedenle, yukarıdaki sorunlar göz önüne alındığında, daha basit ve daha uygun maliyetli birincil nöral kültür protokolü gereklidir, hangi araştırmalar için hem nörobiyologlar ve nörokimyacılar tarafından kullanılabilir.

Birincil nöron kültürü aslında 2D kültür biçimidir ve plastisite temsil etmez, mekansal bütünlük, ya da beynin heterojenlik. Bu nörosferler denilen daha inandırıcı bir 3D modeli için ihtiyaç doğurdu^11,12. Nörosferler nörologlar için yeni bir platform mevcut, gerçek daha yakın bir benzerlik ile, in vivo beyin¹³. Nörosferler nöral kök hücreler (NSCs), nöral progenitor hücreleri (NPCs), nöronlar ve astrositler açısından zengin olan non-adherent 3D hücre kümeleridir. Onlar nöral kök hücreleri ve nöral progenitor hücrelerinizolasyon için mükemmel bir kaynak, çeşitli nöronal ve non-nöronal soylara farklılaşma çalışma için kullanılabilir. Yine, daha önce bildirilen protokoller kullanılarak üretilen nörosfer kültürleri içinde değişkenlik birleşik bir nörosfer kültür protokolü formülasyonu için bir engel sunuyor¹⁴.

Bu el yazması, karışık kortikal ve hipokampal kültürden hücre kaplama yoğunluklarını değiştirerek hem 2D hem de 3Boyutlu platformlar oluşturmanın mümkün olduğu bir protokol sunar. 7 gün içinde serbest yüzen nörosferlerin E14-E16 Sprague Dawley sıçan embriyosundan izole edilen yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan elde edildiği ve daha fazla kültür üzerine radyal glial benzeri uzantılar aracılığıyla köprüler ve ara bağlantılar oluşturduğu gözlenmiştir. Benzer şekilde, düşük yoğunluklu kaplama nöronlarda, haftada iki kez bakım ortamı değiştirilerek 30 güne kadar muhafaza edilebilen birincil nöron kültürü elde edilir.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm deneysel prosedürler CSIR-Indian Institute of Chemical Biology Kurumsal Hayvan Etik Komitesi (IICB/AEC/Meeting/Npr/2018/1) tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktif ve ortam hazırlama

1. Poli-D-lizin (PDL) çözeltisi: PDL solüsyonları deiyonize suda 0,1 mg/mL konsantrasyonlarda hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
2. Ayrıştırma ortamı: 1 L steril, filtrelenmiş deiyonize su, ilgili konsantrasyonlarda aşağıdaki bileşenleri birleştirmek: sodyum klorür (8 mg /mL), potasyum klorür (0.4 mg/mL), potasyum fosfat monobasic (0.06 mg/mL), D-glukoz (1 mg/mL), sodyum fosfat dibazisi (0.479 mg/mL) ve 1 M HEPES [4-(2-hidroksitil)-1-piperazineeetanesülik asit; 10 mM]. Girdap uygun karıştırma yardımcı olmak için tüm bileşenleri ve kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
   NOT: Dissociation ortamını, dissosilasyon sırasında buz gibi şeklinde, ancak oda sıcaklığında (RT) yıkama ve diğer amaçlar için kullanın.
3. Kaplama ortamı: kaplama ortamı aşağıdakilerden oluşur: minimum esansiyel orta (MEM) Earle's Balanced Salt Solution (BSS; %88.4), D-glukoz (%0.6), at serumu (%10) ve penisilin/streptomisin (%1) ile Eagle's. Bileşenleri ilgili oranlarda birleştirin ve steril koşullar altında bir başlık içinde işlemi gerçekleştirin.
   NOT: Herhangi bir bileşenin bozulmasını önlemek için her zaman taze hazırlanmış kaplama ortamını kullanın.
4. Bakım ortamı: aşağıdaki oranları niçin birleştirerek bakım ortamı hazırlamak: nörobazal orta (%97), 0.5 mM ticari glutamin örneği elde, B27 serumsuz takviyesi (%2), ve penisilin / streptomisin (%1). Bileşenleri ilgili oranlarda birleştirin ve steril koşullar altında bir başlık içinde işlemi gerçekleştirin. Tüm bileşenlerin yeni hazırlandığından emin olun.

2. Kapak ların hazırlanması

1. 12 mm çapında yuvarlak cam kapak lı slip alın ve 1 M hidroklorik asit (HCl) ile 4 saat bekletin.
2. Bir çift forceps kullanarak distile suda kapakları aktarın ve asittamamen kurtulmak için yavaşça girdap.
3. Yıkanmış kapakları %100 etanol içeren bir kabın içinde ek bir temizlik turu için aktarın.
4. Kapakları kullanmadan önce, kağıt mendil üzerinde tutarak laminar başlık ta iyice kurulayın.

3. Nöron kültürü için poli-D-lizin kaplı plakaların hazırlanması

1. İki 24 kuyu plakası alın: biri yüksek yoğunluklu kaplama için, diğeri de düşük yoğunluklu kaplama için. Steril paketleri yalnızca laminar kaputun içinde açın.
2. 12 mm'lik steril cam kapakları 24 kuyu plakasında aktarın.
3. Her kuyuya 300 μL PDL çözeltisi (deiyonize suda 0,1 mg/mL) dökün, böylece kapak kapaklarının yüzeyini tamamen kaplayın.
4. Kurutmayı önlemek için plakaları alüminyum folyo ile sarın ve bir gecede CO₂ kuluçka makinesinde saklayın.
5. Ertesi gün (kaplamadan önce), PDL çözeltisini aspire edin ve 300 μL steril deiyonize su ile 2-3 kez iyice yıkayın.
6. 200 μL taze hazırlanmış kaplama ortamı ekleyin ve tabakları kaplamaya kadar kuvöze geri döndürün.

4. Fetüsün çıkarılması ve kesilmesi

NOT: Alüminyum folyo içinde paketlenmiş tüm cerrahi aletleri 121 °C 'de (15 psi) 30 dakika sterilize edin. Bu künt uçlu makas bir çift içerir, forseps, ince forseps, iki ince makas, ve tüm prosedür için bir arter forseps.

1. Nöronlar ve nörosferler üretmek için, zamanlanmış hamile Sprague Dawley sıçan kullanın ve E0 olarak vajinal fiş algılama ile gün işareti.
   NOT: Kültür E14-E16 arasında yapılmalıdır.
2. Kültür gününde, buz üzerine steril bir cam Petri plaka yerleştirin ve soğuk Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ile doldurun.
3. 90 mg ketamin/kg vücut ağırlığı ve 10 mg ksilazin/kg intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile bir E14-E16 hamile sıçan anestezi, sonra servikal çıkığı gerçekleştirerek kurban.
   NOT: Sıçanlar da xylazine veya diazepam ile ketamin aşırı dozda pentobarbital veya aşırı doz da ötenazi olabilir.
4. % 70 etanol püskürterek baraj karnını sterilize ve steril forceps ve künt uçlu makas bir çift kullanarak karın bölgesinde V şeklinde kesim yapmak.
5. Soğuk HBSS çözeltisi ile Petri plaka üzerinde dikkatle embriyonik keseleri alın.
   NOT: Sadece deri için kullanılan aynı forseps ve makas kullanmayın, bu iç organları kontamine olacak gibi. İç organlar için farklı bir makas/forseps seti kullanın.
6. Embriyoları embriyonik keselerden taze ve soğuk HBSS'ye alın.
7. Kafanın kafasını steril makasla ayırın.

5. Hipokampus ile beyin ve korteksdi çıkarılması

1. Başlamadan önce 90 mm steril Petri kaplarını soğuk ve steril HBSS ile doldurun.
2. Steril tabaklarda kafaları steril, künt uçlu pansuman terlikleri kullanarak aktarın.
3. Stereomikroskop altında, steril, tırtıklı forceps ile prout bölgeden baş tutun ve deri ve kafatası açık keserek beyin kaldırın.
4. HBSS çözeltisinde tüm embriyo beyinlerini aynı şekilde toplayın.
5. Beyin sapı tutarak hemisfer ve orta beyin tüm menenjler çıkarın.
6. Dikkatle hipokampus ve korteks içeren mantar kapakları benzeyen bozulmamış hemisfer kaldırın.
7. 10 mL dissosyasyon ortamı içeren 15 mL konik tüpiçinde korteks ve bozulmamış hipokampus içeren hemisferleri toplayın.

6. Kortikal ve hipokampal dokunun tek nöronlara dissosiyasyonu

1. Toplanan dokuların yerleşmesine ve ayrışma ortamına aspire edilmesine izin verin, bu da ortamın %5-10'unu bırakarak.
2. Dokuya 10 mL taze dissociation medium ekleyin ve adım 6.1'i iki kez tekrarlayın.
3. 4,5 mL dissosyation medium ve 0,5 mL %0,25 (1x) tripsin EDTA (etilen diamin tetraasetat) çözeltisi ekleyin.
4. Sindirimin devam etmesi için dokuyu 37 °C'de 20 dk bekletin.
5. Orta aspire ve sindirilmiş dokulara ardışık ayrışma ve kaplama orta 10 mL ekleyin.
6. Sindirilmiş dokuların yerleşmesine ve dissosilasyon ortamını aspire etmesine izin verin. Kaplama orta 2,5 mL ekleyin ve 90 mm steril çanak tabanına dökün.
7. En az hacmi kapamak için 1.000 μL pipet ucu kullanarak yemeğin köşe tabanındaki sindirilmiş dokuları triturate.
8. Elde edilen hücre süspansiyonu, doku parçaları hariç, 70 μm hücresüzden geçirin.
9. Trypan mavi boya dışlama yöntemini kullanarak canlı hücrelerin yoğunluğunu belirleyin ve otomatik hücre sayacındaki hücre sayısını sayın.
   1. Trypan mavi boya dışlama yöntemi için, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini ve %0,4'lük trypan mavi lekesini alın, iyice karıştırın ve tek kullanımlık oda slaytlarının iki kapalı odasından birine karışımın 10 μL'sini ekleyin.
   2. Karışımı içeren slaytı hücre sayacına yerleştirin ve okumayı elde edin.
      NOT: Trippan mavi boya dışlama yöntemi, canlı hücrelerin (bozulmamış zarları nedeniyle) trypan mavi boyayı dışlayacakları ve bu nedenle trypan mavisini kolayca kaldırabilecek ve mavi görünecek canlı olmayan bir hücreye kıyasla açık bir sitoplazma göstereceği prensibine dayanır. renk¹⁵.
10. Yüksek yoğunlukiçin 1,5 x 10⁵ hücre/mL ve kaplama ortamının her biri 30 mL içeren iki ayrı tüpte düşük yoğunlukiçin 20.000 hücre/mL plakaelde edilen hücre sayısını seyreltin.
11. Her kuyudan daha önce eklenen kaplama ortamını aspire edin ve her kuyuda kaplama ortamına dağılmış 500°L'lik hücrelere alıbın.
12. Bundan sonra plakaları 37 °C'de kuvöze, %5 CO 2'ye 4 saat içinde iade edin.
13. Kaplamadan sonra 4 saat mikroskop altında yapışma için hücreleri inceleyin.
14. Her iki plakadaki hücrelerin uygun şekilde yapışması varsa, her kuyudaki ortamı 500°L taze bakım ortamı ile değiştirin ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
15. Kültür bu nöronlar haftada bakım ortamı 2x değiştirerek 30 gün boyunca düşük yoğunlukta büyüdü.
16. Kültür nörosferler ultra-düşük eki plakaları aktararak aynı bakım ortamda yüksek yoğunluklu kaplama nöronların elde.
17. Önemli belirteçleri ile onları immünboyama tarafından nöronlar ve nörosferler karakterize. İmmünositokimya için, önce 30 dakika boyunca %4 formaldehit kullanarak hücreleri/nörosferleri düzeltin, sonra hücreleri 10 dakika boyunca %0,1 iyonik olmayan deterjanla geçirin.
18. Her iki nöron (anti-Tuj1, GFAP, O4, tau) ve nörosferler (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) fosfat tamponlu salin (PBS) için birincil antikorlar ekleyin 1:300 konsantrasyonları ve tüp lüzum gece de 4 °C¹⁶.
    NOT: Tuj1 (sınıf III β-tubulin) ve tau primer nöronlar için pozitif belirteçler iken, GFAP (glial fibrillary asidik protein) ve O4 (oligodendrocyte marker) primer nöronlar için negatif belirteçlerdir^17,18. Nörosferler durumunda, Tuj1, GFAP, ve Nestin tüm olumlu belirteçleri olarak hizmet^19,20.
19. Ertesi gün hücreleri bir veya iki kez PBS ile yıkayın ve 2 saat boyunca RT'de 1:600 konsantrasyonlarda PBS'ye uygun ikincil antikorlar ekleyin.
    NOT: Anti-Mouse veya anti-Rabbit ikincil antikorları eklenen birincil antikor konak türüne bağlı olarak seçilir. İkincil antikorların floresan mikroskopi amaçlarına uygun floresan türevlerine konjuge edilmesi gerektiği unutulmamalıdır.
20. Hücreleri bir veya iki kez PBS ile tekrar yıkayın.
    1. Hoechst 33258 (deiyonize suda 1 mg/mL stok çözeltisi) ile hücrelerin nükleer boyamasını gerçekleştirin. PBS'deki %0,1 Hoechst çözeltisini stok çözeltisinden hazırlayın ve hücrelere ekleyin.
    2. Hücreleri 30 dk için %0.1 Hoechst çözeltisi ile inkübe edin, sonra PBS ile tekrar yıkayın.
21. Slayta 20 μL PBS (veya montaj ortamı) ekleyin ve pbs içeren slayt alanı nın üzerine lekeli hücreleri içeren kapak kaymasını yavaşça monte edin. Kapak kenarlarını dibutilftalat polistiren ksilen (DPX) ile kapatın.
22. 10x ve 40x büyütme bir mikroskop altında sabit hücrelerin görüntüleme gerçekleştirin.

Sonuçlar

Bu protokolde, iki farklı nöral tarama platformundan değişken hücre kaplama yoğunluklarının elde edildiği basit bir strateji ortaya çıkarılmıştır. Şekil 1A,B yüksek ve düşük yoğunluklu kaplamalı hücrelerde nöronların kaplama 4 saat sonra hücrelerin yapışmasını göstermektedir, sırasıyla. Şekil1'de gösterildiği gibi nöronların uygun yapışmasını gözlemleyerek, kaplama ortam...

Tartışmalar

Bu protokol, primer nöronların hücre kaplama yoğunluklarını değiştirerek iki değişken nöronal platformun nasıl elde edildiğini açıklar. Bu basit bir yöntem olmasına rağmen, istenilen sonuçları elde etmek için her adım titizlikle yapılmalıdır. Diğer önceki yöntemler ya uzun vadeli primer nöron kültürleri veya nörosfer kültürleri bildirilmiştir. En birincil nöron kültür protokolleri için hipokampal nöronların kültürdahil 3-5 hafta, ama çoğu başarısız oldu, nöronlar ölmek ve...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072