Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Zusammenfassung

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.

Zusammenfassung

Primäre Neuronenkultur ist eine wesentliche Technik auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Um tiefere mechanistische Einblicke in das Gehirn zu gewinnen, ist es wichtig, ein robustes In-vitro-Modell zu haben, das für verschiedene neurobiologische Studien genutzt werden kann. Obwohl primäre Neuronenkulturen (d.h. langfristige Hippocampuskulturen) Wissenschaftlern Modelle geliefert haben, stellt sie die Komplexität des Gehirnnetzwerks noch nicht vollständig dar. Im Gefolge dieser Einschränkungen ist ein neues Modell entstanden, das Neurosphären verwendet, die eine engere Ähnlichkeit mit dem Gehirngewebe aufweisen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Beschichtung von hohen und niedrigen Dichten gemischter kortikaler und hippocampaler Neuronen, die aus dem Embryo des embryonalen Tages 14-16 Sprague Dawley Ratten isoliert wurden. Dies ermöglicht die Erzeugung von Neurosphären und langfristige primäre Neuronenkultur als zwei unabhängige Plattformen, um weitere Studien durchzuführen. Dieser Prozess ist extrem einfach und kostengünstig, da er mehrere Schritte und Reagenzien minimiert, die bisher als wesentlich für die Neuronenkultur galten. Dies ist ein robustes Protokoll mit minimalen Anforderungen, das mit erreichbaren Ergebnissen durchgeführt und weiter für eine Vielzahl von Studien im Zusammenhang mit Neurowissenschaften verwendet werden kann.

Einleitung

Das Gehirn ist eine komplizierte Schaltung von neuronalen und nicht-neuronalen Zellen. Seit Jahren versuchen Wissenschaftler, Einblicke in diese komplexe Maschinerie zu gewinnen. Dazu griffen Neurowissenschaftler zunächst zu verschiedenen transformierten nervenbasierten Zelllinien für Untersuchungen. Jedoch, die Unfähigkeit dieser klonalen Zelllinien starke synaptische Verbindungen und richtige Axone oder Dendriten haben wissenschaftliches Interesse an primären Neuronenkulturen verschoben^1,2. Der aufregendste Aspekt der primären Neuronenkultur ist, dass es eine Gelegenheit schafft, lebende Neuronen zu beobachten und zu manipulieren³. Darüber hinaus ist es weniger komplex im Vergleich zu Neuronengewebe, was es zu einem idealen Kandidaten für die Untersuchung der Funktion und des Transports von verschiedenen neuronalen Proteinen macht. In jüngster Zeit haben mehrere Entwicklungen in den Bereichen Mikroskopie, Genomik und Proteomik neue Möglichkeiten für Neurowissenschaftler geschaffen, Neuronenkulturen auszunutzen⁴.

Primäre Kulturen haben es Neurowissenschaftlern ermöglicht, die molekularen Mechanismen hinter der neuronalen Entwicklung zu erforschen, verschiedene neuronale Signalwege zu analysieren und ein kohärenteres Verständnis der Synapse zu entwickeln. Obwohl eine Reihe von Methoden Kulturen aus primären Neuronen berichtet haben (meist aus dem hippocampalen Ursprung^5,6,7), ist ein einheitliches Protokoll mit einem chemisch definierten Medium, das eine langfristige Kultur von Neuronen ermöglicht, noch benötigt werden. Jedoch, Neuronen mit geringer Dichte plattiert werden am häufigsten beobachtet, die nicht langfristig überleben, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an trophischen Unterstützung 8, die von den benachbarten Neuronen und Gliazellen zur Verfügung gestellt wird. Einige Methoden haben sogar vorgeschlagen, die primären Neuronen mit Gliazellen zu kultivieren, wobei die Gliazellen als Feederschicht⁹verwendet werden. Jedoch, Gliazellen stellen eine Menge Probleme aufgrund ihrer Überwucherung, die manchmal das neuronale Wachstum überschreiben¹⁰. Unter Berücksichtigung der oben genannten Probleme ist daher ein einfacheres und kostengünstigeres primäres neuronales Kulturprotokoll erforderlich, das sowohl von Neurobiologen als auch von Neurochemikern für Untersuchungen verwendet werden kann.

Eine primäre Neuronenkultur ist im Wesentlichen eine Form der 2D-Kultur und stellt nicht die Plastizität, räumliche Integrität oder Heterogenität des Gehirns dar. Dies hat dazu geführt, dass ein glaubwürdigeres 3D-Modell namens Neurosphären^11,12benötigt wird. Neurosphären stellen Neurowissenschaftlern eine neue Plattform dar, mit einer engeren Ähnlichkeit mit dem realen, in vivo Gehirn¹³. Neurosphären sind nicht anhaftende 3D-Cluster von Zellen, die reich an neuronalen Stammzellen (NSCs), neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), Neuronen und Astrozyten sind. Sie sind eine ausgezeichnete Quelle für die Isolierung von neuronalen Stammzellen und neuronalen Vorläuferzellen, die verwendet werden können, um Die Differenzierung in verschiedene neuronale und nicht-neuronale Linien zu untersuchen. Auch hier stellt die Variabilität innerhalb der Neurosphärenkulturen, die mit den zuvor gemeldeten Protokollen erzeugt werden, ein Hindernis für die Formulierung eines einheitlichen Neurosphärenkulturprotokolls¹⁴dar.

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll dar, in dem es möglich ist, sowohl 2D- als auch 3D-Plattformen zu erzeugen, indem Zellverdichtungen aus einer gemischten kortikalen und hippocampalen Kultur abwechselnd werden. Es wird beobachtet, dass innerhalb von 7 Tagen frei schwebende Neurosphären aus hochdichten, plattierten Neuronen gewonnen werden, die aus dem E14-E16 Sprague Dawley Ratte Embryo isoliert sind, die nach weiterer Kultur Brücken und Verbindungen durch radiale glialartige Erweiterungen bilden. In ähnlicher Weise wird in den niedrigdichten, plattierten Neuronen eine primäre Neuronenkultur erhalten, die bis zu 30 Tage lang aufrechterhalten werden kann, indem das Pflegemedium zweimal pro Woche gewechselt wird.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden von der Institutional Animal Ethics Committee of CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1) genehmigt.

1. Reagenz- und Medienzubereitung

1. Poly-D-Lysin(PDL)-Lösung: Bereiten Sie PDL-Lösungen in Konzentrationen von 0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor und lagern Sie sie in 4 °C bis zur Anwendung.
2. Dissoziationsmedium: Bis 1 L steriles, gefiltertes entionisiertes Wasser, kombinieren Sie die folgenden Komponenten in den jeweiligen Konzentrationen: Natriumchlorid (8 mg/ml), Kaliumchlorid (0,4 mg/ml), Kaliumphosphat monobasic (0,06 mg/ml), D-Glucose (1 mg/ml), Natriumphosphatdibasis (0,479 mg/ml) und 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure; 10 mM]. Vortex alle Komponenten, um das richtige Mischen zu unterstützen und lagern in 4 °C bis zum Gebrauch.
   HINWEIS: Verwenden Sie das Dissoziationsmedium in eiskalter Form während der Dissoziation, aber bei Raumtemperatur (RT) zum Waschen und anderen Zwecken.
3. Beschichtungsmedium: Beschichtungsmedium besteht aus folgenden: Minimal-Essential Medium (MEM) Eagle es mit Earle es Balanced Salt Solution (BSS; 88.4%), D-Glucose (0.6%), Horse Serum (10%) und Penicillin/Streptomycin (1%). Kombinieren Sie die Komponenten in den jeweiligen Verhältnissen und führen Sie den Eingriff innerhalb einer Haube unter sterilen Bedingungen durch.
   HINWEIS: Verwenden Sie immer frisch zubereitetes Beschichtungsmedium, um den Abbau einer Komponente zu vermeiden.
4. Erhaltungsmedium: Bereiten Sie das Pflegemedium vor, indem Sie die folgenden Indizien in den jeweiligen Verhältnissen kombinieren: neurobasales Medium (97%), 0,5 mM kommerziell erhaltene Glutaminprobe, B27 serumfreier Zusatz (2%) und Penicillin/Streptomycin (1%). Kombinieren Sie die Komponenten in den jeweiligen Verhältnissen und führen Sie den Eingriff innerhalb einer Haube unter sterilen Bedingungen durch. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten frisch zubereitet sind.

2. Herstellung von Deckellipsen

1. Nehmen Sie einen runden Glasdeckel von 12 mm und tränken Sie ihn in 1 M Salzsäure (HCl) für 4 h.
2. Übertragen Sie die Abdeckungen in destilliertem Wasser mit einem Paar Zangen und wirbeln Sie es sanft, um die Säure vollständig loszuwerden.
3. Die gewaschenen Deckel für eine zusätzliche Reinigungsrunde in ein Becherglas mit 100% Ethanol geben.
4. Vor der Verwendung der Abdeckungen, trocknen Sie sie gut in der laminaren Haube, indem Sie sie auf Tissue-Papier zu halten.

3. Herstellung von Poly-D-Lysin beschichteten Platten für die Neuronenkultur

1. Nehmen Sie zwei 24 Well-Platten: eine für hochdichte Beschichtung und eine andere für die Beschichtung mit geringer Dichte. Öffnen Sie die sterilen Päckchen nur in der laminaren Haube.
2. Übertragen Sie die 12 mm sterilen Glasabdeckungen in die 24 Brunnenplatten.
3. Gießen Sie 300 l PDL-Lösung (0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser) in jeden Brunnen, so dass er die Oberfläche der Abdeckungen vollständig abdeckt.
4. Wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie, um eine Trocknung zu verhindern, und bewahren Sie sie über Nacht im CO2-Inkubator auf.
5. Am nächsten Tag (vor der Beschichtung) die PDL-Lösung ansaugen und zwei- bis dreimal mit 300 l sterilem entionisiertem Wasser richtig waschen.
6. Fügen Sie 200 l frisch zubereitetes Beschichtungsmedium hinzu und geben Sie die Platten bis zur Beschichtung in den Inkubator zurück.

4. Entfernung und Enthauptung des Fötus

HINWEIS: Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, die in Aluminiumfolie in einem Autoklaven verpackt sind, bei 121 °C (15 psi) für 30 min. Dazu gehören eine stumpfe Endschere, Zange, feine Zange, zwei feine Schere und eine Arteriezange für den gesamten Eingriff.

1. Zur Erzeugung von Neuronen und Neurosphären, verwenden Sie eine zeitschwangere Sprague Dawley Ratte und markieren Sie den Tag mit vaginalen Stecker-Erkennung als E0.
   HINWEIS: Die Kultur muss zwischen E14-E16 durchgeführt werden.
2. Legen Sie am Tag der Kultur eine sterile Glas-Petriplatte auf Eis und füllen Sie sie mit kalter Hank es Balanced Salt Solution (HBSS).
3. Anästhetisieren Sie eine E14-E16 schwangere Ratte mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion von 90 mg Ketamin/kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin/kg, dann Opfern durch Durchführung zervikaler Dislokation.
   HINWEIS: Ratten können auch durch eine Überdosierung von Pentobarbital oder eine Überdosierung von Ketamin mit Xylazin oder Diazepam eingeschläfert werden.
4. Sterilisieren Sie den Bauch des Damms, indem Sie 70% Ethanol sprühen und einen V-förmigen Schnitt im Bauchbereich mit sterilen Zangen und einer stumpfen Schere machen.
5. Nehmen Sie die embryonalen Säcke vorsichtig auf der Petriplatte mit kalter HBSS-Lösung.
   HINWEIS: Verwenden Sie nicht die gleichen Zangen und Scheren, die nur für die Haut verwendet wurden, da dies die inneren Organe kontaminieren wird. Verwenden Sie einen anderen Satz Schere/ Zangen für die inneren Organe.
6. Nehmen Sie die Embryonen aus den embryonalen Säcken in frischen, kalten HBSS.
7. Enthaupten Sie den Kopf mit einer sterilen Schere.

5. Entfernung des Gehirns und Zerlegung des Kortex mit Hippocampus

1. Vor dem Start 90 mm sterile Petrischalen mit kalten, sterilen HBSS füllen.
2. Übertragen Sie die Köpfe in den sterilen Gerichten mit sterilen, stumpfen Verbandszangen.
3. Halten Sie unter dem Stereomikroskop den Kopf aus dem Schnauchbereich mit sterilen, gezackten Zangen und entfernen Sie das Gehirn, indem Sie die Haut und den Schädel öffnen.
4. Sammeln Sie alle Embryo-Gehirne auf die gleiche Weise in der HBSS-Lösung.
5. Entfernen Sie alle Meningen aus den Hemisphären und Mittelhirn durch Halten des Hirnstamms.
6. Entfernen Sie vorsichtig die intakten Hemisphären, die Pilzkappen ähneln, die den Hippocampus und den Kortex enthalten.
7. Sammeln Sie die Hemisphären, die Kortex und intakten Hippocampus enthalten, in einem 15 ml konischen Röhrchen, das 10 ml Dissoziationsmedium enthält.

6. Dissoziation von kortikalem und hippocampalem Gewebe in einzelne Neuronen

1. Lassen Sie die gesammelten Gewebe sich absetzen und saugen Sie das Dissoziationsmedium an, so dass 5%-10% des Mediums darin bleiben.
2. Fügen Sie dem Gewebe 10 ml frisches Dissoziationsmedium hinzu und wiederholen Sie Schritt 6.1 zweimal.
3. 4,5 ml Dissoziationsmedium und 0,5 ml 0,25 % (1x) Trypsin EDTA (Ethylendiamintetraacetat) hinzufügen.
4. Halten Sie das Gewebe im Inkubator bei 37 °C für 20 min für die Verdauung fort.
5. Das Medium ansaugen und 10 ml Dissoziation und Beschichtungsmedium nacheinander in das verdauliche Gewebe geben.
6. Lassen Sie das verdaute Gewebe sich absetzen und das Dissoziationsmedium ansaugen. 2,5 ml Beschichtungsmedium hinzufügen und in die Basis einer 90 mm sterilen Schale gießen.
7. Trituieren Sie das verdaute Gewebe in der Eckbasis der Schale mit einer 1.000 l Pipette Spitze, um das minimale Volumen zu besetzen.
8. Passieren Sie die erhaltene Zellsuspension durch das 70-m-Zellsieb, ausgenommen Gewebestücke.
9. Bestimmen Sie die Dichte lebensfähiger Zellen mithilfe der Trypan-Blue-Farbstoff-Ausschlussmethode und zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem automatisierten Zellzähler.
   1. Bei der Trypan-Blue-Farbstoff-Ausschlussmethode 10 l der Zellsuspension und 10 l 0,4% Trypan-Blaufleck nehmen, gründlich mischen und 10 l der Mischung in eine der beiden geschlossenen Kammern der Einwegkammerschlitten geben.
   2. Setzen Sie die Folie, die die Mischung enthält, in den Zellzähler ein und erhalten Sie den Messwert.
      ANMERKUNG: Die Trypan-Blue-Farbstoff-Ausschlussmethode basiert auf dem Prinzip, dass lebende Zellen (aufgrund ihrer intakten Membranen) Trypan-Blaufarbstoff ausschließen und somit ein klares Zytoplasma aufweisen, verglichen mit einer nicht lebensfähigen Zelle, die leicht Trypanblau aufnehmen und blau in Farbe¹⁵.
10. Verdünnen Sie die Anzahl der Zellen, die bis zur Platte 1,5 x 10⁵ Zellen/ml für hohe Dichte und 20.000 Zellen/ml für niedrige Dichte in zwei separaten Rohren mit je 30 ml des Beschichtungsmediums erhalten wurden.
11. Aspirieren Sie das zuvor hinzugefügte Beschichtungsmedium aus jedem Brunnen und Platte 500 l der Zellen in Beschichtungsmedium in jedem Brunnen dispergiert.
12. Danach die Platten bei 37 °C und 5%_CO2 für 4 h in den Inkubator zurück.
13. Untersuchen Sie die Zellen auf Haftung unter dem Mikroskop 4 h nach der Beschichtung.
14. Wenn die Zellen in beiden Platten ordnungsgemäß haften, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 500 l frisches Pflegemedium und inkubieren Sie bei 37 °C.
15. Kultur diese Neuronen wuchs bei geringer Dichte für 30 Tage durch Änderung der Wartung Medium 2x pro Woche.
16. Kultur die Neurosphären aus den hochdichten plattierten Neuronen im gleichen Erhaltungsmedium erhalten, indem sie auf die ultra-niedrigen Befestigungsplatten übertragen.
17. Charakterisieren Sie die Neuronen und die Neurosphären, indem Sie sie mit wichtigen Markern immunstainieren. Für die Immunzytochemie fixieren Sie zunächst die Zellen/Neurosphären mit 4% Formaldehyd für 30 min auf der Platte selbst, dann permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% nichtionischem Reinigungsmittel für 10 min.
18. Fügen Sie primäre Antikörper für beide Neuronen (Anti-Tuj1, GFAP, O4, Tau) und Neurosphären (Anti-Nestin, GFAP, Tuj1) in phosphatgepufferter Salin (PBS) bei 1:300 Konzentrationen hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C¹⁶.
    HINWEIS: Die Tuj1 (Klasse III -Tubulin) und Tau sind positive Marker für die primären Neuronen, während GFAP (glial fibrillary acidic protein) und O4 (Oligodendrozytenmarker) negative Marker für die primären Neuronen^{sind 17,18}. Bei Neurosphären dienen Tuj1, GFAP und Nestin als positive Marker^19,20.
19. Am nächsten Tag die Zellen ein- oder zweimal mit PBS waschen und bei 1:600 Konzentrationen bei RT für 2 h geeignete sekundäre Antikörper in PBS hinzufügen.
    HINWEIS: Die Sekundärantikörper gegen Die Maus oder Anti-Rabbit werden je nach der Wirtsart des hinzugefügten primären Antikörpers ausgewählt. Es ist zu beachten, dass die sekundären Antikörper mit Fluoreszenzderivaten konjugiert werden müssen, die für Fluoreszenzmikroskopiezwecke geeignet sind.
20. Waschen Sie die Zellen ein- oder zweimal erneut mit PBS.
    1. Führen Sie die kerntechnische Färbung der Zellen mit Hoechst 33258 (1 mg/ml-Stammlösung in entionisiertem Wasser) durch. 0,1% Hoechst-Lösung in PBS aus der Stammlösung vorbereiten und den Zellen hinzufügen.
    2. Die Zellen mit 0,1% Hoechst-Lösung 30 min bebrüten, dann wieder mit PBS waschen.
21. Fügen Sie 20 L PBS (oder Montagemedium) auf dem Dia hinzu und montieren Sie langsam den Deckelschlupf mit den gebeizten Zellen über dem Bereich des Dias, der PBS enthält. Versiegeln Sie die Ränder des Deckslips mit Dibutylphthalatpolystyrolxylol (DPX).
22. Bildgebung der festen Zellen unter dem Mikroskop mit 10- und 40-facher Vergrößerung.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde eine einfache Strategie erläutert, bei der variable Zellbeschichtungsdichten von zwei verschiedenen neuronalen Screening-Plattformen erhalten werden. Abbildung 1A,B zeigt die Adhärenz von Zellen nach 4 h Der Beschichtung der Neuronen in hoch- bzw. niedrigdichten plattierten Zellen. Bei Der Beobachtung der korrekten Einhaltung der Neuronen gemäß Abbildung 1wurde das Beschichtungsmediu...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, dass durch die Änderung der Zellbeschichtungdichten von primären Neuronen zwei variable neuronale Plattformen erhalten werden. Obwohl dies eine einfache Methode ist, muss jeder Schritt sorgfältig ausgeführt werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Andere frühere Methoden haben entweder langfristige primäre Neuronenkulturen oder Neurosphärenkulturen berichtet. Die meisten primären NeuronenkulturProtokolle haben die Kultivierung von Hippocampus-Neuronen für 3-5 Wochen beteil...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-GFAP	Abcam	AB7260
Anti- Nestin	Abcam	AB92391
Anti-O4	Millipore	MAB345
Anti-Tau	Abcam	AB76128
Anti-Tuj1	Millipore	MAB1637
B27 Serum Free Supplement	Gibco	17504-044
Cell Counter	Life technologies	Countess II FL
CO2 Incubator	Eppendorf	Galaxy 170 R
D-glucose	SDFCL	38450-K05
Ethanol	Merck Millipore	100983
Fluorescence Microscope	Olympus	IX83 Model
Formaldehyde	Sigma Aldrich	47608
GlutaMax-I Supplement	Gibco	35050-061
GtXMs IgG Fluor	Millipore	AP1814
GtXMs IgG (H+L)	Millipore	AP124C
HEPES	SRL	16826
Hoechst 33258	Calbiochem	382061
Horse Serum	HiMedia	RM10674
Hydrochloric Acid	Rankem	H0100
Laminar Hood	BioBase	BBS-V1800
MEM Eagle’s with Earle’s BSS	Sigma Aldrich	M-2279
Microscope	Dewinter	Victory Model
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates)	BD Falcon	353047, 352350 and 3471
90 mm Petridishes	Himedia	PW001
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Poly-D-Lysine	Millipore	A.003.E
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Monobasic	Merck	MI6M562401
Sodium Chloride	Qualigem	15918
Sodium Phosphate Dibasic	Merck	MI6M562328
Stereomicrosope	Dewinter	Zoomstar Model
Triton-X 100	SRL	2020130
Trypan Blue Solution	Gibco	15250-061
0.25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072