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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El propósito de este método es generar células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco in vitro con el fin de estudiar la especificación de la célula progenitora y las propiedades funcionales, y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades del corazón.

Resumen

Las células madre pluripotentes ofrecen un gran potencial para entender el desarrollo del corazón y las enfermedades y para la medicina regenerativa. Si bien los recientes avances en la cardiología del desarrollo han llevado a generar células cardíacas a partir de células madre pluripotentes, no está claro si los dos campos cardíacos -el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)- se inducen en sistemas de células madre pluripotentes. Para abordar esto, generamos un protocolo para la especificación in vitro y el aislamiento de células progenitoras cardíacas específicas del campo cardíaco. Utilizamos líneas de células madre embrionarias que llevan Hcn4-GFP y Tbx1-Cre; Los reporteros de Rosa-RFP de la FHF y la SHF, respectivamente, y la inmunomancha de células vivas de la proteína de membrana celular Cxcr4, un marcador de SHF. Con este enfoque, generamos células progenitoras que recapitulan las propiedades funcionales y el transcriptoma de sus contrapartes in vivo. Nuestro protocolo se puede utilizar para estudiar la especificación temprana y la segregación de los dos campos cardíacos y para generar células cardíacas específicas de la cámara para el modelado de enfermedades cardíacas. Dado que se trata de un sistema organoide in vitro, es posible que no proporcione información anatómica precisa. Sin embargo, este sistema supera la escasa accesibilidad de los embriones en etapa de gastrulación y se puede ampliar para pantallas de alto rendimiento.

Introducción

El uso de células madre pluripotentes (PSC) ha revolucionado el campo de la regeneración cardíaca y la medicina personalizada con miocitos específicos del paciente para el modelado de enfermedades y terapias farmacológicas1,2,3, 4. Más recientemente, se han desarrollado protocolos in vitro para la generación de cardiomiocitos derivados de la PSC auricular es adictivo y similares a marcapasos, 5,6. Sin embargo, aún no está claro si la cardiogénesis puede recrearse in vitro para estudiar el desarrollo cardíaco y, posteriormente, generar células cardíacas específicas de la cámara ventricular.

Durante el desarrollo embrionario temprano, las células mesodérmicas bajo la influencia de morógenos secretados como BMP4, Wnts y Activin A forman la racha primitiva7. Células mesodermales cardíacas marcadas por la expresión de Mesp1, migran antes y más bien para formar la media luna cardiaca y luego el tubo cardíaco primitivo7,8. Este grupo migratorio de células incluye dos poblaciones muy distintas de células progenitoras cardíacas (CPC), a saber, el primer y segundo campo cardíaco (FHF y SHF)9,10. Las células del SHF son altamente proliferativas y migratorias y son las principales responsables del alargamiento y bucle del tubo cardíaco. Además, las células SHF se diferencian a cardiomiocitos, fibroblastos, músculo liso y células endoteliales a medida queentran en el tubo cardíaco para formar el ventrículo derecho, tracto de salida ventricular derecha y gran parte de ambas aurículas 7,10. Por el contrario, las células FHF son menos proliferativas y migratorias y se diferencian principalmente a los cardiomiocitos, ya que dan lugar al ventrículo izquierdo y a una parte más pequeña de la aurícula11. Además, los progenitores SHF están marcados por la expresión de Tbx1, FGF8, FGF10 y Six2, mientras que las células FHF expresan Hcn4 y Tbx511,12,13,14,15.

Los PSC pueden diferenciarse a las tres capas germinales y posteriormente a cualquier tipo de célula en el cuerpo4,16. Por lo tanto, ofrecen un enorme potencial para entender el desarrollo del corazón y para modelar defectos específicos del desarrollo que resultan en enfermedades cardíacas congénitas, la causa más frecuente de defectos congénitos17. Un gran subgrupo de cardiopatía congénita incluye anomalías cardíacas específicas de la cámara18,19. Sin embargo, todavía no está claro si estos se originan en el desarrollo anómalo del campo del corazón. Además, dada la incapacidad de los cardiomiocitos para proliferar después del nacimiento, se han realizado grandes esfuerzos para crear tejido cardíaco para la regeneración cardíaca1,7,20. Teniendo en cuenta las diferencias fisiológicas y morfológicas entre las cámaras cardíacas, la generación de tejido cardíaco específico de la cámara utilizando PsCs es de importancia significativa. Si bien los recientes avances en cardiología del desarrollo han llevado a una generación robusta de células cardíacas a partir de PSC, todavía no está claro si los dos campos cardíacos pueden ser inducidos en los sistemas PSC.

Para recapitular la cardiogénesis in vitro y estudiar las especificaciones y propiedades de los CPC, anteriormente utilizamos un sistema basado en la diferenciación de esferoides cardíacos derivados de PSC21,22,23,24. Recientemente, generamos células madre embrionarias de ratón (mESC) con reporteros de GFP y RFP bajo el control del gen DeFHcn4 y el gen SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Los mESC diferenciados in vitro formaron esferoides cardíacos en los que las células GFP+ y RFP+ aparecieron de dos áreas distintas de células mesodeérmicas y se modelaron de manera complementaria. Las células GFP+ y RFP+ resultantes mostraron características de FHF y SHF, respectivamente, determinadas por la secuenciación del ARN y los análisis clonales. Es importante destacar que, utilizando mESC que transporta el reportero Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP),descubrimos que las células SHF estaban marcadas fielmente por la proteína de superficie celular CXCR4, y esto puede permitir el aislamiento de células específicas del campo cardíaco sin transgenes. El presente protocolo describirá la generación y el aislamiento de cPC específicos en el campo cardíaco de los mESC, que pueden servir como una herramienta valiosa para estudiar las cardiopatías específicas de la cámara.

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Protocolo

NOTA: Generación in vitro de células progenitoras cardíacas de ratón específicas del campo cardíaco (Figura1).

1. Mantenimiento de esCs de ratón

  1. Cultivar mESCs (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 on 0.1% (w/v) frascos T25 recubiertos de gelatina en 2i medio (870 mL de medio esencial glascow (GMEM), 100 mL de suero bovino fetal (FBS), 10 mL de GlutaMAX, 10 mL de aminoácidos no esenciales, 10 mL de sodio piruvato, 3 l de beta-mercaptoetanol, 20 l de Lif (200 U/ml), 0,3 oM CHIR99021 y 0,1 m PD0325901).
  2. Cuando las células alcancen un 70-80% de confluencia, enjuague las células una vez con la solución tampón de fosfato (PBS) y luego disocie en células individuales agregando 1 ml de trippsina e incubando a 37 oC durante 3 minutos.
  3. Neutraliza la trippsina añadiendo 4 ml de 10% de FBS en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco. Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado.
  4. Centrifugar 3 x 105 células durante 3 min a 270 x g y temperatura ambiente.
  5. Aspirar el sobrenadante, resuspender las células en 5 ml de medio 2i y replacar en frascos T25 recubiertos con gelatina al 0,1% (p/v) para mantenimiento.

2. Generación de células progenitoras cardíacas con esferoides cardíacos

  1. Centrifugar 2,5 x 106 células del paso 1,3 durante 3 min a 270 x g y temperatura ambiente.
  2. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 25 ml de medio SFD (105 células/ml). Dependiendo de la escala del experimento, el número mESC se puede ajustar en consecuencia.
    NOTA: El medio SFD contiene 715 ml del medio modificado Dulbecco de Iscove (IMDM), 250 ml de F12 de Jamón, 5 mL de N2-suplemento, 10 mL de B27 menos Vitamina A, 5 mL de 10% (p/v) BSA (en PBS), 7,5 mL de GlutaMAX y 7,5 mL de Penicilina-Streptomicina. Añadir ácido ascórbico (50 mg/ml) y 3,9 x 10-3% (v/v) de monotioglicerol antes de usar.
  3. Placar la suspensión celular en una placa estéril de 150 mm x 25 mm e incubar a 37 oC en la incubadora de CO2 al 5% para 48 h. Los esferoides cardíacos deben formarse dentro de las 24 h.
  4. Recoger todos los esferoides cardíacos formados y centrifugar durante 3 minutos a 145 x g y la temperatura ambiente para aislar selectivamente los esferoides y evitar células individuales.
  5. Aspirar el sobrenadante y resuspender los esferoides en 25 ml de medio SFD con 1 ng/ml de Activin A y 1,5 ng/mL de BMP4 para la inducción de diferenciación. Placar los esferoides en la misma placa estéril de 150 mm x 25 mm e incubarlas a 37 oC en la incubadora de CO2 del 5% durante 40 h.
    NOTA: Se pueden utilizar diferentes concentraciones de Activin A (0-3 ng/mL) y BMP4 (0,5-2 ng/mL) para la optimización de la diferenciación dependiendo de la línea mESC.
  6. Recoger todos los esferoides cardíacos y centrífuga durante 3 min a 145 x g y temperatura ambiente.
  7. Aspirar el sobrenadante y resuspender los esferoides en 25 ml de medio SFD. Transfiera los EB resuspendidos en un matraz de fijación ultrabajo de 75 cm2 e incubarlos a 37oC en la incubadora de CO2 del 5% durante 48 h.

3. Aislamiento de células de progenitor cardíaco específicas del campo del corazón utilizando reporteros fluorescentes

  1. Centrífuga esferoides cardíacos a 145 x g y temperatura ambiente durante 3 minutos y aspirar al sobrenadante. Añadir 1 mL de trippsina e incubar a 37oC durante 3 min. Mezclar bien pipeteando para disociar las células.
  2. Añadir 4 mL de 10% FBS en DMEM para inactivar la trippsina y mezclar bien mediante pipeteo. Para eliminar los EB no disociados, filtre la mezcla con un colador de 70 mm y centrifugar las células filtradas durante 3 min a 270 x g y la temperatura ambiente.
  3. Ordenar los CPC que llevan reporteros fluorescentes (CPC derivados de mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de solución de clasificación FACS (1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES y 10 mM de EDTA en PBS) para resuspender.
  4. Para eliminar todos los racimos de celdas antes de ordenarlas, filtre las celdas de nuevo con un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml con un colador de celdas de 40 m. Mantenga las células en hielo hasta la clasificación.
  5. Ordenar las celdas para aislar Tbx1-Cre; CPC positivos Rosa-RFP y HCN4-GFP utilizando un clasificador de células activado sin fluorescentes (FACS). Recoja las células ordenadas en 1 mL de FBS. Mantenga la muestra de celda y las células ordenadas a 4 oC.

4. Aislamiento de células de progenitor cardíaco específicas de campo cardíaco del corazón utilizando Cxcr4 como marcador de proteína de superficie celular

  1. Para aislar los CPC de primer a segundo campo cardíaco en función de la expresión del receptor de proteína superficial Cxcr4, utilice la línea mESCIsl1-RFP. Aspirar el sobrenadante del paso 3.3 y resuspender los CPC individuales en 300 s de 10% FBS en PBS que contengan 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 anticuerpo anti-Cxcr4 conjugado.
  2. Incubar a temperatura ambiente durante 5min y lavar añadiendo 1-2 ml de PBS frío. Centrifugar los CPC individuales durante 3 min a 270 x g y la temperatura ambiente y lavar dos veces más seguidas de centrifugación.
  3. Aspirar el sobrenadante y añadir 500 l de solución de clasificación FACS para resuspender los CPC individuales y filtrar como en el paso 3.4.
  4. Aísle las celdas Cxcr4+ y Cxcr4 mediante FACS. Recoja las células ordenadas en 1 mL de FBS. Mantenga la muestra de celda y las células ordenadas a 4 oC.

5. Análisis de células progenitoras cardíacas específicas de campo cardíaco aislado

  1. CPC ordenados por centrífuga durante 3 min a 270 x g y temperatura ambiente. Las células clasificadas se pueden utilizar para análisis de expresión de genes y proteínas o pueden recultivarse para análisis en momentos posteriores.
  2. Para recultivar CPC aisladas, aspirar el sobrenadante, resuspender las células en medio SFD y replacar 3 x 104 células por pozo de una placa de 384 pocillos recubierta con 0.1% (p/v) gelatina.  Si se observa un aumento de la muerte celular después de la clasificación, agregue 10 m de Y-27632 (inhibidor de ROCK) a la muestra. Dos días después de la recultura, se deben observar golpes espontáneos.
  3. Para analizar la capacidad de los CPC chapados para diferenciarse a los cardiomiocitos, recoger las células en el día 12 de la diferenciación. Utilice la trippsina como se describe en los pasos 1.2-1.5 para aislar los PRIMEROS individuales.
  4. Centrifugar las células durante 3 min a 895 x g, y a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en PBS para lavar el PFA. Repita este paso una vez más.
  5. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10% FBS en PBS. Incubar la mitad de la muestra celular con el anticuerpo t anti-troponina de ratón (1:500) y utilizar el resto de la muestra como un control negativo. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  6. Lave las células dos veces como se describe en el paso 5.4 con PBS. Aspirar el sobrenadante y resuspender ambas muestras celulares en 10% FBS en PBS con 1:500 burro anti-ratón IgG (H+L) anticuerpo secundario, Alexa Fluor 647 conjugado. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  7. Lávese dos veces con PBS como en el paso 5.6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 200 s de PBS. Utilice un catómetro de flujo para analizar las celdas.

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Resultados

Después de aproximadamente 132 h de diferenciación, los CPC Tbx1-RFP y Hcn4-GFP se pueden detectar utilizando un microscopio fluorescente (Figura2). Generalmente, las células GFP y RFP aparecen aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente alrededor del mismo tiempo. Las dos poblaciones de CPC continúan expandiéndose en estrecha proximidad y comúnmente en un patrón complementario. El ajuste de las concentraciones de Activin A y BMP4 alterará los porc...

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Discusión

En nuestro protocolo, describimos una metodología para generar esferoides cardíacos y CPC específicos del campo cardíaco aislado. Estos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos de especificación de CPC y sus propiedades, así como para el modelado de enfermedades específicas de la cámara cardíaca. Un trabajo publicado anteriormente utilizó una línea mESC con dos reporteros fluorescentes (Mef2c/Nkx2.5) para estudiar cardiogénesis in vitro, sin embargo, ambos marcadores se expresan en el día embrionario ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada para las revelaciones.

Agradecimientos

E. T. fue apoyado por The Magic That Matters y AHA. C. K. fue apoyado por las concesiones de NICHD/NIH (R01HD086026), AHA y MSCRF.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
β-mercaptoethanolSigmaM6250
0.1% (w/v) GelatinEMD MilliporeES-006-B
100 mM Sodium PyruvateGibco11360
100x Pen/StrepGibco15070-063
1x PBS w/o Calcium and MagnesiumThermo Fisher Scientific21-040-CV
20% ParaformaldehydeThermo Fisher Scientific50-980-493
5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainerBD Falcon35223
Activin AR & D Systems338-AC-010
Ascorbic AcidSigmaA-4544
B27 minus vitamin A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
BMP4R & D Systems314-BP
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
Cell sorterSonySH800Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μmThermo Fisher Scientific08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XTThermo Fisher Scientific75004508
CHIR99021Selleck chemicalsS2924
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flaskCorning07-200-875
Countless II FL automated cell counterThermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo Fisher ScientificA-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)Gibco11965-092
EDTASigmaE6758
ESGRO (LIF)MilliporeESG1106
EVOS FL microscopeThermo Fisher ScientificAMF4300
Fetal Bovine SerumInvitrogenSH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM)Gibco11710035
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
Ham’s F12Gibco10-080-CV
HEPESSigmaH3375
IMDMGibco12440053
Monothioglycero (MTG)SigmaM-6145
Mouse anti-Troponin T antibodyThermo Fisher ScientificMS-295-P1
N2-SUPPLEMENTGibco17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAAInvitrogen11140-050
PD0325901SelleckchemS1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibodyThermo Fisher Scientific46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25 mmCorning430597
T25 flasksCorning353109
TrypLE (Trypsin)Gibco12604
Y-27632 (ROCK inhibitor)Stem cell technologies72304

Referencias

  1. Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  2. Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  3. Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  6. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  7. Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
  8. Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
  9. Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292(2013).
  10. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
  11. Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
  12. Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
  13. Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
  14. Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
  15. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  16. Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
  17. Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
  18. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
  19. Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
  20. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  21. Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413(2012).
  22. Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
  23. Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164(2014).
  24. Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
  25. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140(2018).
  26. Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).

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