In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro Generation of Mouse Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells In Vitro

Résumé

Le but de cette méthode est de générer des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque in vitro afin d'étudier la spécification des cellules progénitrices et les propriétés fonctionnelles, et de générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes offrent un grand potentiel pour comprendre le développement cardiaque et la maladie et pour la médecine régénérative. Bien que les progrès récents de la cardiologie développementale aient conduit à la production de cellules cardiaques à partir de cellules souches pluripotentes, on ne sait pas si les deux champs cardiaques - les premier et deuxième champs cardiaques (FHF et SHF) - sont induits dans les systèmes de cellules souches pluripotentes. Pour remédier à cette situation, nous avons généré un protocole de spécification in vitro et d'isolement des cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque. Nous avons utilisé des lignées de cellules souches embryonnaires transportant Hcn4-GFP et Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters de la FHF et le SHF, respectivement, et immunostaining cellulaire séminueux vivant de la protéine de membrane cellulaire Cxcr4, un marqueur SHF. Avec cette approche, nous avons généré des cellules progénitrices qui récapitulent les propriétés fonctionnelles et le transcriptome de leurs homologues in vivo. Notre protocole peut être utilisé pour étudier la spécification précoce et la ségrégation des deux champs cardiaques et pour générer des cellules cardiaques spécifiques à la chambre pour la modélisation des maladies cardiaques. Puisqu'il s'agit d'un système organoïde in vitro, il peut ne pas fournir d'informations anatomiques précises. Cependant, ce système surmonte la faible accessibilité des embryons au stade de la gaztrulation et peut être mis à niveau pour les écrans à haut débit.

Introduction

L'utilisation de cellules souches pluripotentes (CSP) a révolutionné le domaine de la régénération cardiaque et de la médecine personnalisée avec des myocytes spécifiques aux patients pour la modélisation des maladies et les pharmacothérapies^{1,2,3, 4}. Plus récemment, des protocoles in vitro pour la génération de cardiomyocytes auriculaires vs ventriculaires ainsi que des stimulateurs cardiaques dérivés de PSC ont été développés^5,6. Cependant, si la cardiogenèse peut être recréée in vitro pour étudier le développement cardiaque et par la suite produire des cellules cardiaques ventriculaires spécifiques à la chambre est encore peu claire.

Au début du développement embryonnaire, les cellules mésodermales sous l'influence de morphogènes sécrétés tels que BMP4, Wnts et Activin A forment la strie primitive⁷. Les cellules mésodermales cardiaques marquées par l'expression de Mesp1, migrent antérieurement et dernièrement pour former le croissant cardiaque, puis le tube cardiaque primitif^7,8. Ce groupe migratoire de cellules comprend deux populations très distinctes de cellules progénitrices cardiaques (CPC), à savoir le premier et le deuxième champ cardiaque (FHF et SHF)^9,10. Les cellules de la SHF sont hautement proliférantes et migratrices et sont principalement responsables de l'allongement et de la boucle du tube cardiaque. En outre, les cellules SHF se différencient en cardiomyocytes, fibroblastes, muscles lisses et cellules endothéliales comme ils entrent dans le tube cardiaque pour former le ventricule droit, le tractus ventriculaire droit et une grande partie des deux^{oreillettes 7,10}. En revanche, les cellules FHF sont moins proliférantes et migratrices et se différencient principalement aux cardiomyocytes car elles donnent lieu au ventricule gauche et à une plus petite partie des oreillettes^11. En outre, les progéniteurs SHF sont marqués par l'expression de Tbx1, FGF8, FGF10 et Six2 tandis que les cellules FHF expriment Hcn4 et Tbx5^{11,12,13,14,15}.

Les CSP peuvent se différencier des trois couches germinales et, par la suite, de n'importe quel type de cellule dans le corps^4,16. Par conséquent, ils offrent un potentiel énorme pour comprendre le développement cardiaque et pour modéliser des défauts développementaux spécifiques ayant pour résultat la maladie cardiaque congénitale, la cause la plus fréquente des défauts de naissance¹⁷. Un grand sous-groupe de maladie cardiaque congénitale inclut des anomalies cardiaques de chambre-spécifiques^18,19. Cependant, il ne sait toujours pas si ceux-ci proviennent du développement anormal du champ cardiaque. En outre, étant donné l'incapacité des cardiomyocytes à proliférer après la naissance, il ya eu des efforts considérables pour créer des tissus cardiaques pour la régénération cardiaque^1,7,20. Compte tenu des différences physiologiques et morphologiques entre les chambres cardiaques, la génération de tissu cardiaque spécifique à la chambre à l'aide de CSP est d'une importance significative. Bien que les progrès récents en cardiologie développementale aient mené à la génération robuste de cellules cardiaques des PSC, il est toujours peu clair si les deux champs de coeur peuvent être induits dans des systèmes de PSC.

Pour récapituler la cardiogenèse in vitro et étudier les spécifications et les propriétés des CPC, nous avons déjà utilisé un système basé sur la différenciation des sphéroïdes cardiaques dérivés de la CFP^21,22,23,24. Récemment, nous avons produit des cellules souches embryonnaires de souris (MESC) avec des reporters de GFP et de DP sous le contrôle du gène Hcn4 de FHF et du gène Tbx1 de SHF, respectivement (mESCtbtb1-Cre^{; Rosa-RFP; HCN4-GFP}) ²⁵. Les MESC différenciés in vitro ont formé des sphéroïdes cardiaques dans lesquels les cellules GFPet et RFPsont apparues de deux zones distinctes de cellules mésodermales et modelées d'une manière complémentaire. Les cellules GFPMD et RFPMD qui en ont résulté présentaient respectivement des caractéristiques FHF et SHF, déterminées par des analyses de séquençage de l'ARN et de clonal. Fait important, en utilisant des MESC transportant le journaliste Isl1-RFP (mESC^Isl1-RFP), nous avons découvert que les cellules SHF étaient fidèlement marquées par la protéine de surface cellulaire CXCR4, ce qui peut permettre l'isolement des cellules spécifiques au champ cardiaque sans transgènes. Le protocole actuel décrira la génération et l'isolement des CPC spécifiques au champ cardiaque à partir des CSE, qui peuvent servir d'outil précieux pour l'étude des maladies cardiaques propres à la chambre.

Protocole

REMARQUE: Génération in vitro de cellules progénitrices cardiaques spécifiques au champ cardiaque (Figure 1).

1. Entretien des ESC de souris

1. Cultivez des MESC (mESCtbtb-Cre; ^{Rosa-RFP; HCN4-GFP}, mESC^Isl1-RFP)²⁵ sur 0,1% (w/v) flasque t25 enrobée de 2i medium (870 mL de milieu essentiel minimum de glascow (GMEM), 100 mL de sérum bovin fœtal (FBS), 10 mL de GlutaMAX, 10 mL d'acides aminés non essentiels, 10 mL de sodium pyruvate, 3 l de bêta-mercaptoéthanol, 20 oL de Lif (200 U/mL), 0,3 M CHIR99021 et 0,1 M PD0325901).
2. Lorsque les cellules atteignent la confluence de 70-80%, rincez les cellules une fois avec une solution tampon de phosphate (PBS) et puis dissocier en cellules simples en ajoutant 1 ml de trypsine et en couvant à 37 oC pendant 3 min.
3. Neutraliser la trypsine en ajoutant 4 ml de 10 % de FBS dans le médium d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Comptez les cellules à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé.
4. Centrifugeuse 3 x 10⁵ cellules pendant 3 min à 270 x g et température ambiante.
5. Aspirer le supernatant, resuspendre les cellules en 5 ml de milieu 2i et replaquer sur 0,1% (w/v) flasque enduite T25 pour l'entretien.

2. Génération de cellules progénitrices cardiaques utilisant des sphéroïdes cardiaques

1. Centrifugeuse 2,5 x 10⁶ cellules à partir de l'étape 1,3 pour 3 min à 270 x g et température ambiante.
2. Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules dans 25 mL de milieu SFD (10⁵ cellules/mL). Selon l'ampleur de l'expérience, le nombre de mESC peut être ajusté en conséquence.
   REMARQUE: Le milieu SFD contient 715 ml de Moyen dulbecco modifié d'Iscove (IMDM), 250 mL de F12 de Ham, 5 mL de N2-supplément, 10 mL de B27 moins la vitamine A, 5 mL de 10% (w/v) BSA (en PBS), 7,5 mL de GlutaMAX et 7,5 mL de pénicilline-streptomycine. Ajouter de l'acide ascorbique (50 mg/mL) et 3,9 x 10^-3% (v/v) de monothioglycérol avant d'utiliser.
3. Déposer la suspension cellulaire dans une plaque stérile de 150 mm x 25 mm et couver à 37 oC dans l'incubateur co2 de 5 % pendant 48 h. Les sphéroïdes cardiaques doivent être formés dans un délai de 24 h.
4. Recueillir tous les sphéroïdes cardiaques formés et centrifugeuse pendant 3 min à 145 x g et la température ambiante pour isoler sélectivement les sphéroïdes et éviter les cellules simples.
5. Aspirer le supernatant et resuspendre les sphéroïdes dans 25 mL de milieu SFD avec 1 ng/mL d'Activin A et 1,5 ng/mL de BMP4 pour l'induction de différenciation. Déposer les sphéroïdes dans la même plaque stérile de 150 mm x 25 mm et les incuber à 37 oC dans l'incubateur co2 de 5 % pendant 40 h.
   REMARQUE: Différentes concentrations d'Activin A (0-3 ng/mL) et de BMP4 (0,5-2 ng/mL) peuvent être utilisées pour l'optimisation de la différenciation en fonction de la ligne mESC.
6. Recueillir tous les sphéroïdes cardiaques et centrifugeuses pendant 3 min à 145 x g et la température ambiante.
7. Aspirer le supernatant et resuspendre les sphéroïdes en 25 ml de milieu SFD. Transférer les EB suspendants dans un joint ultra-faible de 75 cm² flacon et les incuber à 37 oC dans l'incubateur co2 de 5 % pendant 48 h.

3. Isolement des cellules cardiaques spécifiques de l'ancêtre de champ de coeur utilisant des journalistes fluorescents

1. Centrifugeuses sphéroïdes cardiaques à 145 x g et température ambiante pour 3min et aspirer le supernatant. Ajouter 1 ml de trypsine et incuber à 37 oC pendant 3 min. Bien mélanger en pipetting pour dissocier les cellules.
2. Ajouter 4 mL de 10% FBS dans DMEM pour inactiver la trypsine et bien mélanger par pipetting. Pour enlever les EB non dissociés, filtrer le mélange à l'aide d'une passoire de 70 mm et centrifuger les cellules filtées pendant 3 min à 270 x g et la température ambiante.
3. Trier les CPC transportant des reporters fluorescents (CPC dérivés des CSM^{Tbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP}), aspirer le supernatant et ajouter 500 L de solution de tri FACS (1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES et 10 mM d'EDTA en PBS) pour le suspendre.
4. Pour enlever tous les amas cellulaires avant le tri, filtrez à nouveau les cellules à l'aide d'un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml avec une passoire cellulaire de 40 m. Garder les cellules sur la glace jusqu'au tri.
5. Trier les cellules pour isoler Tbx1-Cre; CPC positifs Rosa-RFP et HCN4-GFP à l'aide d'un trieur de cellules activés fluorescentes (FACS). Recueillir les cellules triées dans 1 ml de FBS. Maintenir l'échantillon cellulaire et les cellules triées à 4 oC.

4. Isolement des cellules cardiaques spécifiques de l'ancêtre du champ cardiaque utilisant Cxcr4 comme marqueur de protéine de surface cellulaire

1. Pour isoler les CPC du premier ou du deuxième champ cardiaque en fonction de l'expression du récepteur de protéines de surface Cxcr4, utilisez la ligne^ISl1-RFPdu MESC. Aspirez le supernatant de l'étape 3.3 et suspendez les CPC simples dans 300 L de 10% FBS en PBS contenant 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 anticorps anti-Cxcr4 conjugués.
2. Incuber à température ambiante pendant 5min et laver en ajoutant 1-2 ml de PBS froid. Centrifuger les CPC simples pendant 3 min à 270 x g et la température ambiante et laver deux fois de plus suivie d'une centrifugation.
3. Aspirez le supernatant et ajoutez 500 L de solution de tri FACS pour resuspendre les CPC et filtrer comme à l'étape 3.4.
4. Isolez les cellules Cxcr4MD et Cxcr4 à l'aide de FACS. Recueillir les cellules triées dans 1 ml de FBS. Maintenir l'échantillon cellulaire et les cellules triées à 4 oC.

5. Analyse des cellules spécifiques de progéniteur cardiaque de champ de coeur d'isolement

1. Centrifugeales triaient les CPC pendant 3 min à 270 x g et la température ambiante. Les cellules triées peuvent être utilisées pour des analyses d'expression génique et protéique ou elles peuvent être recultivées pour des analyses ultérieures.
2. Pour re-culture rétayer les CPC isolés, aspirez le supernatant, resuspend les cellules dans le milieu de SFD et replate zèle 3 x 10⁴ cellules par puits d'une plaque de 384 puits recouverte de 0,1 % (w/v) de gélatine.  Si l'on note une augmentation de la mortalité cellulaire après le tri, ajouter 10 millions de Y-27632 (inhibiteur du ROCK) à l'échantillon. Deux jours après la reculture, le passage à tabac spontané doit être noté.
3. Pour analyser la capacité des CCP plaqués à se différencier des cardiomyocytes, recueillir les cellules au jour 12 de la différenciation. Utilisez la trypsine telle qu'elle est décrite dans les étapes 1.2-1.5 pour isoler les CM simples. Resuspendre les cellules dans 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) et incuber pendant 30 min à température ambiante pour fixer les cellules.
4. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 895 x g, et la température ambiante. Aspirez le supernatant et suspendez les cellules dans PBS pour laver le PFA. Répétez cette étape une fois de plus.
5. Aspirez le supernatant et resuspend les cellules dans 10% FBS dans PBS. Incuber la moitié de l'échantillon cellulaire avec un anticorps anti-Troponine T souris (1:500) et utiliser le reste de l'échantillon comme un contrôle négatif. Incuber 30 min à température ambiante.
6. Laver les cellules deux fois comme décrit à l'étape 5.4 à l'aide de PBS. Aspirez le supernatant et resuspendez les deux échantillons de cellules dans 10% FBS dans PBS avec 1:500 âne anti-souris IgG (H-L) anticorps secondaires, Alexa Fluor 647 conjugué. Incuber 30 min à température ambiante.
7. Laver deux fois avec PBS comme à l'étape 5.6. Aspirez le supernatant et resuspendez les cellules dans 200 L de PBS. Utilisez un cytomètre de débit pour analyser les cellules.

Résultats

Après environ 132 h de différenciation, les CCP Tbx1-RFP et Hcn4-GFP peuvent être détectés à l'aide d'un microscope fluorescent (figure2). En général, les cellules GFP et DFP apparaissent à peu près à la même époque. Les deux populations de CPC continuent de croître à proximité et généralement dans un schéma complémentaire. L'ajustement des concentrations d'Activin A et de BMP4 modifiera les pourcentages de CPC FHF vs SHF (figure 3). La spéc...

Discussion

Dans notre protocole, nous décrivons une méthodologie pour produire des sphéroïdes cardiaques et des CPC isolés spécifiques au champ cardiaque. Ceux-ci peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes de spécification scPC et leurs propriétés, ainsi que pour la modélisation des maladies spécifiques à la chambre cardiaque. Un travail précédemment édité a employé une ligne de MESC avec deux journalistes fluorescents (Mef2c/Nkx2.5) pour étudier la cardiogenèse in vitro, cependant, ces deux marqueurs ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
0.1% (w/v) Gelatin	EMD Millipore	ES-006-B
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360
100x Pen/Strep	Gibco	15070-063
1x PBS w/o Calcium and Magnesium	Thermo Fisher Scientific	21-040-CV
20% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	50-980-493
5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer	BD Falcon	35223
Activin A	R & D Systems	338-AC-010
Ascorbic Acid	Sigma	A-4544
B27 minus vitamin A (50x)	Thermo Fisher Scientific	12587010
BMP4	R & D Systems	314-BP
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Cell sorter	Sony	SH800	Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μm	Thermo Fisher Scientific	08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XT	Thermo Fisher Scientific	75004508
CHIR99021	Selleck chemicals	S2924
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flask	Corning	07-200-875
Countless II FL automated cell counter	Thermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)	Gibco	11965-092
EDTA	Sigma	E6758
ESGRO (LIF)	Millipore	ESG1106
EVOS FL microscope	Thermo Fisher Scientific	AMF4300
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	SH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM)	Gibco	11710035
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Ham’s F12	Gibco	10-080-CV
HEPES	Sigma	H3375
IMDM	Gibco	12440053
Monothioglycero (MTG)	Sigma	M-6145
Mouse anti-Troponin T antibody	Thermo Fisher Scientific	MS-295-P1
N2-SUPPLEMENT	Gibco	17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAA	Invitrogen	11140-050
PD0325901	Selleckchem	S1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody	Thermo Fisher Scientific	46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25 mm	Corning	430597
T25 flasks	Corning	353109
TrypLE (Trypsin)	Gibco	12604
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Stem cell technologies	72304