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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Zweck dieser Methode ist es, herzfeldspezifische Herzvorläuferzellen in vitro zu erzeugen, um die Vorläuferzellspezifikation und funktionelle Eigenschaften zu untersuchen und kammerspezifische Herzzellen für die Herzkrankheitsmodellierung zu generieren.

Zusammenfassung

Pluripotente Stammzellen bieten ein großes Potenzial für das Verständnis von Herzentwicklung und -erkrankungen sowie für die regenerative Medizin. Während die jüngsten Fortschritte in der Entwicklungskardiologie zur Erzeugung von Herzzellen aus pluripotenten Stammzellen geführt haben, ist unklar, ob die beiden Herzfelder - das erste und das zweite Herzfeld (FHF und SHF) - in pluripotenten Stammzellensystemen induziert werden. Um diesem Problem zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur In-vitro-Spezifikation und Isolierung herzfeldspezifischer Herzvorläuferzellen erstellt. Wir verwendeten embryonale Stammzellenlinien, die Hcn4-GFP und Tbx1-Cre trugen; Rosa-RFP-Reporter der FHF bzw. der SHF und Live-Zell-Immunostainierung des Zellmembranproteins Cxcr4, einem SHF-Marker. Mit diesem Ansatz erzeugten wir Vorläuferzellen, die die funktionellen Eigenschaften und Transkriptome ihrer In-vivo-Gegenstücke rekapitulieren. Unser Protokoll kann genutzt werden, um die frühe Spezifikation und Segregation der beiden Herzfelder zu untersuchen und kammerspezifische Herzzellen für die Herzkrankheitsmodellierung zu generieren. Da es sich um ein In-vitro-Organoidsystem handelt, liefert es möglicherweise keine genauen anatomischen Informationen. Dieses System überwindet jedoch die schlechte Zugänglichkeit von Embryon im Gastrulationsstadium und kann für Bildschirme mit hohem Durchsatz hochskaliert werden.

Einleitung

Die Verwendung von pluripotenten Stammzellen (PSCs) hat den Bereich der Herzregeneration und personalisiertemedizin mit patientenspezifischen Myozyten für die Krankheitsmodellierung und Medikamentierungen1,2,3 , 4. In jüngerer Zeit wurden In-vitro-Protokolle zur Erzeugung von Atrial vs ventrikulären sowie herzschrittmacherartigen PSC-abgeleiteten Kardiomyozyten entwickelt5,6. Ob die Kardiogenese jedoch in vitro neu angelegt werden kann, um die Herzentwicklung zu untersuchen und anschließend ventrikuläre kammerspezifische Herzzellen zu erzeugen, ist noch unklar.

Während der frühen embryonalen Entwicklung bilden mesodermale Zellen unter dem Einfluss von sezernierten Morphogenen wie BMP4, Wnts und Activin A den Primitivstreifen7. Herzmesodermale Zellen, die durch die Expression von Mesp1 gekennzeichnet sind, wandern anterior und später zum Herzhalbmond und dann zum primitiven Herzrohr7,8. Diese Migrationsgruppe umfasst zwei sehr unterschiedliche Populationen von Kardialvorläuferzellen (CPCs), nämlich das erste und das zweite Herzfeld (FHF und SHF)9,10. Zellen aus der SHF sind hoch proliferativ und wandernd und sind in erster Linie für die Dehnung und Schleife des Herzschlauchs verantwortlich. Darüber hinaus unterscheiden sich SHF-Zellen zu Kardiomyozyten, Fibroblasten, glatten Muskel- und Endothelzellen, wenn sie in das Herzrohr eindringen, um den rechten Ventrikel, den rechten ventrikulären Abflusstrakt und einen großen Teil der beiden Atria7,10zu bilden. Im Gegensatz dazu sind FHF-Zellen weniger proliferativ und wandernd und unterscheiden sich hauptsächlich von Kardiomyozyten, da sie den linken Ventrikel und einen kleineren Teil der Vorhöfe11hervorrufen. Darüber hinaus sind SHF-Vorläufer durch die Expression von Tbx1, FGF8, FGF10 und Six2 gekennzeichnet, während FHF-Zellen Hcn4 und Tbx511,12,13,14,15ausdrücken.

PSCs können sich auf alle drei Keimschichten undanschließend auf jeden Zelltyp im Körper 4,16differenzieren. Daher bieten sie ein enormes Potenzial für das Verständnis der Herzentwicklung und für die Modellierung spezifischer Entwicklungsdefekte, die zu angeborenen Herzerkrankungen führen, die häufigste Ursache von Geburtsfehlern17. Eine große Untergruppe der angeborenen Herzerkrankungen umfasst kammerspezifische Herzanomalien18,19. Es ist jedoch noch unklar, ob diese aus der anomalen Herzfeldentwicklung stammen. Darüber hinaus gab es angesichts der Unfähigkeit von Kardiomyozyten, sich nach der Geburt zu vermehren, umfangreiche Bemühungen, Herzgewebe für die Herzregeneration1,7,20zu schaffen. Unter Berücksichtigung der physiologischen und morphologischen Unterschiede zwischen Herzkammern ist die Erzeugung von kammerspezifischem Herzgewebe mit PSCs von erheblicher Bedeutung. Während die jüngsten Fortschritte in der Entwicklungskardiologie zu einer robusten Generierung von Herzzellen aus PSCs geführt haben, ist es immer noch unklar, ob die beiden Herzfelder in PSC-Systemen induziert werden können.

Um die Kardiogenese in vitro zu rekapitulieren und die Spezifikation und die Eigenschaften von CPCs zu untersuchen, haben wir zuvor ein System verwendet, das auf der Differenzierung von PSC-abgeleiteten Herzsphäroiden21,22,23,24basiert. Kürzlich haben wir embryonale Mausstammzellen (mESCs) mit GFP- und RFP-Reportern unter der Kontrolle des FHF-Gens Hcn4 bzw. des SHF-Gens Tbx1 (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro differenzierte mESCs bildeten Herzsphäroide, in denen GFP+- und RFP+-Zellen aus zwei unterschiedlichen Bereichen mesodermaler Zellen auftraten und komplementär gemustert wurden. Die resultierenden GFP+- und RFP+-Zellen wiesen FHF- bzw. SHF-Eigenschaften auf, die durch RNA-Sequenzierung und klonale Analysen bestimmt wurden. Wichtig ist, dass wir mit hilfe von mESCs, die den Isl1-RFP-Reporter (mESCIsl1-RFP)tragen, entdeckt enden, dass SHF-Zellen durch das Zelloberflächenprotein CXCR4 originalgetreu gekennzeichnet sind, was die Isolierung von herzfeldspezifischen Zellen ohne Transgene ermöglichen kann. Das vorliegende Protokoll wird die Erzeugung und Isolierung herzfeldspezifischer CPCs von mESCs beschreiben, die als wertvolles Instrument zur Untersuchung kammerspezifischer Herzkrankheiten dienen können.

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Protokoll

HINWEIS: In-vitro-Generierung herzfeldspezifischer Herzvorläuferzellen (Abbildung 1).

1. Wartung von Maus-ESCs

  1. Grow mESCs (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 auf 0,1% (w/v) gelatinebeschichtete T25-Kolben in 2i mittel (870 ml Glaskuh Minimum Essential Medium (GMEM), 100 ml fetales Rinderserum (FBS), 10 ml GlutaMAX, 10 ml nicht essentielle Aminosäuren, 10 ml Natrium Pyruvat, 3 l Beta-Mercaptoethanol, 20 l Lif (200 U/ml), 0,3 M CHIR99021 und 0,1 M PD0325901).
  2. Wenn die Zellen 70-80% Konfluss erreichen, spülen Sie die Zellen einmal mit Phosphatpufferlösung (PBS) ab und dissoziieren Sie sich dann in einzelne Zellen, indem Sie 1 ml Trypsin hinzufügen und 3 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 4 ml 10% FBS in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) hinzufügen. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellenzählers.
  4. Zentrifuge 3 x 105 Zellen für 3 min bei 270 x g und Raumtemperatur.
  5. Aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 5 ml 2i Medium wieder auf und replate auf 0,1% (w/v) Gelatine beschichteten T25-Flaschen zur Wartung.

2. Erzeugung von Herzvorläuferzellen mit Herzsphäriden

  1. Zentrifuge 2,5 x 106 Zellen ab Schritt 1,3 für 3 min bei 270 x g und Raumtemperatur.
  2. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 25 ml SFD-Medium (105 Zellen/ml) wieder aus. Je nach Umfang des Experiments kann die mESC-Nummer entsprechend angepasst werden.
    HINWEIS: SFD Medium enthält 715 ml von Iscove es Modified Dulbecco es Medium (IMDM), 250 ml von Ham es F12, 5 ml N2-Ergänzung, 10 ml B27 minus Vitamin A, 5 ml 10% (w/v) BSA (in PBS), 7,5 ml GlutaMAX und 7,5 ml Penicillin-Streptomycin. Ascorbinsäure (50 mg/ml) und 3,9 x 10-3% (v/v) Monothioglycerol vor der Verwendung hinzufügen.
  3. Die Zellsuspension in eine 150 mm x 25 mm sterile Platte geben und bei 37 °C im 5% CO2-Inkubator für 48 h brüten. Herzsphäroide sollten innerhalb von 24 h gebildet werden.
  4. Sammeln Sie alle gebildeten Herzsphäroide und Zentrifuge für 3 min bei 145 x g und Raumtemperatur selektiv zu isolieren Sphäroide und vermeiden Sie einzelne Zellen.
  5. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Sphäroide in 25 ml SFD-Medium mit 1 ng/ml Activin A und 1,5 ng/ml BMP4 zur Differenzierungsinduktion wieder aus. Die Sphäroide in der gleichen 150 mm x 25mm sterilen Platte verbuchen und bei 37 °C im 5% CO2-Inkubator für 40 h inkubieren.
    HINWEIS: Für die Differenzierungsoptimierung je nach mESC-Linie können unterschiedliche Konzentrationen von Activin A (0-3 ng/mL) und BMP4 (0,5-2 ng/ml) verwendet werden.
  6. Sammeln Sie alle Herzsphäroide und Zentrifuge für 3 min bei 145 x g und Raumtemperatur.
  7. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Sphäroide in 25 ml SFD-Medium wieder auf. Die resuspendierten EBs in einem ultraniedrigen Aufsatz 75 cm2 Kolben übertragen und bei 37 °C im 5% CO2-Inkubator für 48 h inkubieren.

3. Isolierung von Herzfeld spezifischen Herzvorläuferzellen mit fluoreszierenden Reportern

  1. Zentrifuge Herzsphäroide bei 145 x g und Raumtemperatur für 3min und aspirieren den Überstand. Fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 3 min. Mischen Sie gut durch Pipettieren, um die Zellen zu dissoziieren.
  2. Fügen Sie 4 ml 10% FBS in DMEM hinzu, um Trypsin zu inaktivieren und durch Pipettieren gut zu mischen. Um die nicht dissoziierten EBs zu entfernen, filtern Sie die Mischung mit einem 70 mm Sieb und zentrieren Sie die filtrierten Zellen für 3 min bei 270 x g und Raumtemperatur.
  3. So sortieren Sie CPCs mit fluoreszierenden Reportern (CPCs, abgeleitet von mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP), den Überstand ansaugen und 500 L FACS-Sortierlösung (1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES und 10 mM EDTA in PBS) hinzufügen, um sie wieder aufzulösen.
  4. Um alle Zellcluster vor der Sortierung zu entfernen, filtern Sie die Zellen erneut mit einem 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr mit einem 40-m-Zellsieb. Halten Sie die Zellen auf Eis bis zum Sortieren.
  5. Sortieren Sie die Zellen, um Tbx1-Cre zu isolieren; Rosa-RFP und HCN4-GFP-positive CPCs mit einem fluoreszierenden aktivierten Zellsortierer (FACS). Sammeln Sie die sortierten Zellen in 1 ml FBS. Bewahren Sie die Zellprobe und die sortierten Zellen bei 4 °C auf.

4. Isolierung von Herzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen mit Cxcr4 als Zelloberflächenproteinmarker

  1. Um DIE CPCs des ersten vs. zweiten Herzfeldes basierend auf der Expression des Oberflächenproteinrezeptors Cxcr4 zu isolieren, verwenden Sie die mESCIsl1-RFP-Linie. Aspirieren Sie den Überstand aus Schritt 3.3 und setzen Sie die einzelnen CPCs in 300 l von 10% FBS in PBS mit 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 konjugierten Anti-Cxcr4-Antikörper wieder aus.
  2. Bei Raumtemperatur für 5min inkubieren und waschen, indem 1-2 ml kalte PBS hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie die einzelnen CPCs für 3 min bei 270 x g und Raumtemperatur und waschen Sie zwei weitere Male, gefolgt von Zentrifugation.
  3. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 500 L FACS-Sortierlösung hinzu, um die einzelnen CPCs wieder auszusetzen und wie in Schritt 3.4 zu filtern.
  4. Isolieren Sie Cxcr4+- und Cxcr4-Zellen mit FACS. Sammeln Sie die sortierten Zellen in 1 ml FBS. Bewahren Sie die Zellprobe und die sortierten Zellen bei 4 °C auf.

5. Analyse von isolierten Herzfeld spezifischen Herzvorläuferzellen

  1. Zentrifugen sortierte CPCs für 3 min bei 270 x g und Raumtemperatur. Sortierte Zellen können für Gen- und Proteinexpressionsanalysen verwendet oder zu späteren Zeitpunkten für Analysen rekultiviert werden.
  2. Um isolierte CPCs neu zu kultiieren, aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen im SFD-Medium wieder auf und schichten Sie 3 x 104 Zellen pro Bohrung einer 384-Well-Platte auf, die mit 0,1% (w/v) Gelatine beschichtet ist.  Wenn nach der Sortierung ein erhöhter Zelltod festgestellt wird, fügen Sie der Probe 10 M Y-27632 (ROCK-Hemmer) hinzu. Zwei Tage nach der Rekultur sollte spontanes Schlagen beachtet werden.
  3. Um die Fähigkeit von plattierten CPCs zu analysieren, um zu Kardiomyozyten zu unterscheiden, sammeln Sie die Zellen an Tag 12 der Differenzierung. Verwenden Sie Trypsin wie in den Schritten 1.2-1.5 beschrieben, um einzelne CMs zu isolieren. Setzen Sie die Zellen in 4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) aus und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 895 x gund Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in PBS, um die PFA zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  5. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 10% FBS in PBS wieder aus. Inkubieren Sie die Hälfte der Zellprobe mit Demononin-T-Antikörper der Maus (1:500) und verwenden Sie den Rest der Probe als Negativkontrolle. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Waschen Sie die Zellen doppelt, wie in Schritt 5.4 beschrieben, mit PBS. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie beide Zellproben in 10% FBS in PBS mit 1:500 Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647 Konjugat. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Zweimal mit PBS waschen wie in Schritt 5.6. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 200 l PBS. Verwenden Sie ein Durchflusszytometer, um die Zellen zu analysieren.

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Ergebnisse

Nach ca. 132 h Differenzierung können Tbx1-RFP und Hcn4-GFP CPCs mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden (Abbildung 2). Im Allgemeinen erscheinen GFP- und RFP-Zellen ungefähr zur gleichen Zeit. Die beiden Populationen der CPCs dehnen sich weiterhin in unmittelbarer Nähe und häufig in einem komplementären Muster aus. Die Anpassung der Konzentrationen von Activin A und BMP4 wird die Prozentsätze von FHF vs SHF-CPCs ändern (Abbildung 3). Die CPC-S...

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Diskussion

In unserem Protokoll beschreiben wir eine Methodik zur Erzeugung von Herzsphäroiden und isolierten herzfeldspezifischen CPCs. Diese können verwendet werden, um Mechanismen der CPC-Spezifikation und ihre Eigenschaften zu untersuchen, sowie für die herzkammerspezifische Krankheitsmodellierung. Eine zuvor veröffentlichte Arbeit verwendete eine mESC-Linie mit zwei fluoreszierenden Reportern (Mef2c/Nkx2.5), um die Kardiogenese in vitro zu untersuchen, jedoch werden beide Marker am embryonalen Tag 9.5-10 exprimiert, wenn K...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts für Enthüllungen.

Danksagungen

E. T. wurde von The Magic That Matters und AHA unterstützt. C. K. wurde durch Zuschüsse von NICHD/NIH (R01HD086026), AHA und MSCRF unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
β-mercaptoethanolSigmaM6250
0.1% (w/v) GelatinEMD MilliporeES-006-B
100 mM Sodium PyruvateGibco11360
100x Pen/StrepGibco15070-063
1x PBS w/o Calcium and MagnesiumThermo Fisher Scientific21-040-CV
20% ParaformaldehydeThermo Fisher Scientific50-980-493
5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainerBD Falcon35223
Activin AR & D Systems338-AC-010
Ascorbic AcidSigmaA-4544
B27 minus vitamin A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
BMP4R & D Systems314-BP
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
Cell sorterSonySH800Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μmThermo Fisher Scientific08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XTThermo Fisher Scientific75004508
CHIR99021Selleck chemicalsS2924
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flaskCorning07-200-875
Countless II FL automated cell counterThermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo Fisher ScientificA-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)Gibco11965-092
EDTASigmaE6758
ESGRO (LIF)MilliporeESG1106
EVOS FL microscopeThermo Fisher ScientificAMF4300
Fetal Bovine SerumInvitrogenSH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM)Gibco11710035
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
Ham’s F12Gibco10-080-CV
HEPESSigmaH3375
IMDMGibco12440053
Monothioglycero (MTG)SigmaM-6145
Mouse anti-Troponin T antibodyThermo Fisher ScientificMS-295-P1
N2-SUPPLEMENTGibco17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAAInvitrogen11140-050
PD0325901SelleckchemS1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibodyThermo Fisher Scientific46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25 mmCorning430597
T25 flasksCorning353109
TrypLE (Trypsin)Gibco12604
Y-27632 (ROCK inhibitor)Stem cell technologies72304

Referenzen

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