בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

Summary

מטרת שיטה זו היא לייצר תאים ספציפיים לשדה הלב בחלל החוץ בתוך מבחנה כדי ללמוד את המפרט תא מחולל ותכונות פונקציונלי, וליצור תאי לב מסוימים בחדר לדגמי מחלות לב.

Abstract

תאי גזע פלאוריטי מציעים פוטנציאל רב להבנת התפתחות לב ומחלות ולרפואה רגנרטיבית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לייצר תאים לב מתאי גזע פלאוריטי, זה לא ברור אם שני שדות הלב-הראשון והשני שדות הלב (FHF ו SHF)-הם המושרה במערכות מערכות גזע רב עוצמה pluripotent ובידוד של תאים. ספציפיים לשדה-הלב השתמשנו בתאי גזע עובריים הנושאים Hcn4-GFP ו Tbx1-היצורים; רוזה-RFP כתבים של FHF ואת SHF, בהתאמה, ואת החיסוני לחיות התאים של הקרום התא חלבון Cxcr4, סימן SHF. עם גישה זו, יצרנו תאים מחולל קדמון אשר לכידה של המאפיינים הפונקציונליים ואת ההמרה של שלהם vivo עמיתיהם. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מנוצל כדי ללמוד מוקדם מפרט והפרדה של שני שדות הלב וליצור תאי לב ספציפיים לחדר לדגמי מחלות לב. מאחר שזוהי מערכת ארגונית מחוץ למערכת, ייתכן שהיא אינה מספקת מידע אנטומי מדויק. עם זאת, מערכת זו גוברת על הנגישות הירודה של עוברי הבמה והוא יכול להיות מוקטן עבור מסכי תפוקה גבוהה.

Introduction

השימוש בתאי גזע פלאוריטי (PSCs) יש מהפכה בתחום התחדשות הלב ורפואה אישית עם מיציטים ספציפיים לחולה עבור מידול מחלות וטיפולים בסמים^{1,2,3, 4}. לאחרונה, בפרוטוקולי חוץ גופית עבור דור של פרפור לעומת המוח, כמו גם קוצב לב PSC-הקרדיוציטים הנגזר פותחו^5,6. עם זאת, אם cardiogenesis ניתן ליצור מחדש בתחום החוץ כדי ללמוד את התפתחות הלב ולאחר מכן ליצור החדרית תאי הלב ספציפיים לחדר עדיין לא ברור.

במהלך ההתפתחות העובריים המוקדמת, התאים המזושים תחת השפעת מורגנים מופרשים כגון BMP4, Wnts ופעילות בצורה פרימיטיבית⁷. תאים מזופנים לב מסומנים על-ידי הביטוי של Mesp1, להעביר למטה ולמטה ליצור את הסהר הקרדיולוגית ולאחר מכן את צינור הלב הפרימיטיבי^7,8. זו קבוצת הנדידה של תאים כולל שתי אוכלוסיות נפרדות מאוד של תאים מחולל לב (cpcs), כלומר הראשון ואת שדה הלב השני (fhf ו shf)^9,10. תאים מן SHF הם מתרבים מאוד נדידה והם אחראים בעיקר התארכות ולולאה של צינור הלב. בנוסף, תאים shf להבדיל הקרדיוציטים, פיברותקיעות, שריר החלקה ותאים אנדותל כפי שהם נכנסים לצינור הלב כדי ליצור את החדר הימני, מערכת הכניסה הבין-חדרית הימנית ואת החלק הגדול של שתי האטריה^7,10. לעומת זאת, תאים fhf הם מתרבים פחות הנדידה ולהבדיל בעיקר הקרדיוציטים כפי שהם מעניקים לחדר שמאל וחלק קטן יותר של אטריה¹¹. יתר על כן, shf ושלתי מסומנים על ידי הביטוי של Tbx1, FGF8, FGF10 וSix2 בעוד fhf תאים express Hcn4 ו Tbx5^{11,12,13,14,15}.

PSCs יכול להבדיל לכל שלוש שכבות הנבט ולאחר מכן כל סוג תא בגוף^4,16. לכן, הם מציעים פוטנציאל עצום להבנת התפתחות הלב ולמידול פגמים התפתחותיים ספציפיים כתוצאה ממחלת לב מולדים, הגורם השכיח ביותר למומים מולדים¹⁷. תת קבוצה גדולה של מחלת לב מולדים כולל ליקויים בתאי הלב הספציפיים^18,19. עם זאת, עדיין לא ברור אם אלה מקורם בפיתוח שדה לב חריג. בנוסף, בהינתן חוסר היכולת של הקרדיוציטים להתרבות לאחר הלידה, היו מאמצים נרחבים ליצור רקמת לב להתחדשות הלב^1,7,20. בהתחשב ההבדלים הפיסיולוגיים ומורפולוגיים בין תאי לב, הדור של רקמת הלב ספציפי לחדר באמצעות PSCs הוא בעל חשיבות משמעותית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לדור חזק של תאי לב מ PSCs, זה עדיין ברור אם שני שדות הלב יכול להיות המושרה במערכות PSC.

כדי לcardiogenesis את המפרט והמאפיינים של cpcs, השתמשנו בעבר מערכת מבוססת על ההבחנה PSC-נגזרות לב הנגזרים^21,22,23,24. לאחרונה, שיצרנו תאים גזע מעובריים של העכבר (mESCs) עם כתבים GFP ו-RFP תחת שליטה של FHF gene Hcn4 ואת הגן SHF Tbx1, בהתאמה (mESCs^{Tbx1-יצור; . רוזה-ראFP HCN4-GFP}) ²⁵. ב מתורבת הבדיל mESCs יצר spheroids לב שבו GFP + ו RFP התאים הופיעו משני אזורים ברורים של תאים מזועורי ומתבנית באופן משלים. התאים המתקבלים GFP + ו RFP + הציגו FHF ו SHF מאפיינים, בהתאמה, נקבע על-ידי רצפי RNA וניתוחים שבטיים. חשוב מכך, באמצעות mESCs נושאים את הכתב Isl1-RFP (mESC^Isl1-RFP), גילינו כי תאים shf היו מסומנים בנאמנות על ידי חלבון פני השטח התאים CXCR4, וזה יכול לאפשר בידוד של תאים ספציפיים לשדה הלב ללא טרנסגנים. הפרוטוקול הנוכחי יתאר את הדור והבידוד של CPCs לשדה הלב ספציפיים מ mESCs, אשר עשוי לשמש כלי רב ערך ללימוד מחלת לב מסוימת לחדר.

Protocol

הערה: בדור מחוץ לתחום של לב שדות העכבר הספציפיים לשדה הלב (איור 1).

1. תחזוקה של ESCs העכבר

1. לגדול mESCs (mESCs^{Tbx1-יצור; . רוזה-ראFP HCN4-GFP}, mesc^ISL1-rfp)²⁵ על 0.1% (w/v) ג'לטין מצופה T25 מבחנות ב 2i בינונית (870 ml של מדיום חיוני מינימלי של הפרה (gfp) 100 ml של סרום העוברי (Fbs), 10 מ ל של גלוטמקס, 10 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, 10 מ ל נתרן פירובט, 3 μL של בטא-mercaptoethanol, 20 μL של חיי (200 U/mL), 0.3 μM CHIR99021 ו 0.1 μM PD0325901).
2. כאשר התאים מגיעים 70-80% המפגש, לשטוף את התאים פעם אחת עם פתרון מאגר פוספט (PBS) ולאחר מכן לנתק לתוך תאים בודדים על ידי הוספת 1 מ ל טריפסין ו דגירה ב 37 ° c עבור 3 דקות.
3. נטרל את טריפסין על ידי הוספת 4 מ ל של 10% FBS בינונית הנשר המתוקנת של דולבקה (DMEM). ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
4. צנטריפוגה ~ 3 x 10⁵ תאים עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר.
5. מריף את supernatant, להשעות מחדש את התאים 5 מ ל של 2i בינונית ו resuspend על 0.1% (w/v) הג מצופה T25 מבחנות עבור תחזוקה.

2. הדור של בתאי מחולל לב באמצעות מספרי כדוריות הלב

1. צנטריפוגה 2.5 x 10⁶ תאים משלב 1.3 עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר.
2. משף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את התאים בגודל 25 מ ל של בינונית-SFD (10⁵ תאים/mL). בהתאם לקנה המידה של הניסוי, ניתן לכוונן מספר mESC בהתאם.
   הערה: המדיום SFD מכיל 715 מ ל של Iscove של מדיום שונה של המדיום (IMDM), 250 מ ל של בשר חזיר, 5 מ ל של N2-תוספת, 10 מ ל של B27 מינוס ויטמין A, 5 מ ל 10% (w/v) BSA (ב PBS), 7.5 מ ל של גלוטמקס ו 7.5 mL של פניצילין הוסף חומצה אסקורבית (50 mg/mL) ו 3.9 x 10^-3% (v/v) של מוניוגליצרול לפני השימוש.
3. צלחת התא ההשעיה לתוך 1 150 mm x 25 מ"מ צלחת סטרילית ו מודקת ב 37 ° צ' ב 5% CO₂ חממה עבור 48 h. יש ליצור בתוך 24 h הרואידים לב.
4. לאסוף את כל שנוצרו spheroids לב וצנטריפוגה עבור 3 דקות ב 145 x g וטמפרטורת החדר כדי לבודד באופן סלקטיבי spheroids ולהימנע תאים בודדים.
5. מורידים את הסופרנטאנט ומשגרות את הספרואידים ב -25 מ ל של מדיום בינוני עם 1 ng/mL של פעילות A ו 1.5 ng/mL של BMP4 עבור אינדוקציה בידול. צלחת spheroids באותו 150 mm x 25mm הצלחת סטרילי ו מודקת אותם ב 37 ° צ' ב 5% CO₂ חממה עבור 40 h.
   הערה: ריכוזים שונים של פעילות (0-3 ng/mL) ו BMP4 (0.5-2 ng/mL) ניתן להשתמש עבור מיטוב בידול בהתאם לקו mESC.
6. לאסוף את כל spheroids לב צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 145 x g וטמפרטורת החדר.
7. מורידים את הסופרנטאנט ומשגרות את הספרואידים ב -25 מ ל של המדיום. העבר את בס מחדש מצורף אולטרה נמוך 75 ס מ² בקבוקון ו-דגירה אותם ב 37 ° צ' בחממה 5% CO₂ עבור 48 h.

3. בידוד של שדה הלב בתאי לב ספציפיים באמצעות כתבים פלורסנט

1. ב145 x g ובטמפרטורת החדר במשך שלושה מינימום ומורידים את הסופרנטאנט. הוסיפו 1 מ ג לטריפסין ולדגירה ב 37 ° c למשך 3 דקות. ערבב היטב על ידי ליטוף כדי לנתק את התאים.
2. הוסיפו 4 מ ל של 10% FBS ב-DMEM כדי להשבית את טריפסין ולערבב היטב על ידי ליטוף. כדי להסיר את בס שאינו מנתק, לסנן את התמהיל באמצעות מסננת 70 מ"מ ו צנטריפוגה את התאים filtrated עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר.
3. כדי למיין מחשבי CPCs הנושאים כתבים פלורסצנט (CPCs הנגזרים מ^{-MESCs Tbx1. . רוזה-ראFP HCN4-GFP}), משלחים את סופרנטאנט ומוסיפים 500 μL של פתרון מיון FACS (1% (v/v) FBS, 200 MM HEPES ו 10 מ"מ של EDTA ב PBS) כדי להשעות מחדש.
4. כדי להסיר את כל אשכולות התא לפני מיון, לסנן את התאים שוב באמצעות 5 מ"ל קלקר עגול-בתחתית עם מסננת תא 40 יקרומטר. לשמור על התאים בקרח עד מיון.
5. מיין את התאים כדי לבודד Tbx1. רוסה-RFP ו-HCN4-GFP חיוביים מחשבים באמצעות מסדר פלורסנט המופעל התא (FACS). לאסוף את התאים ממוין 1 mL של FBS. שמור את דגימת התא והתאים הממוינים ב-4 ° c.

4. בידוד של שדה הלב מסוים בתאים מחולל לב באמצעות Cxcr4 כסמן חלבון משטח התא

1. כדי לבודד הראשון לעומת שדה לב השני CPCs מבוסס על הביטוי של קולטן חלבון פני השטח Cxcr4, השתמש בשורה mESC^Isl1-RFP. משלחים את supernatant משלב 3.3 ולהשעות מחדש את CPCs בודד 300 μL של 10% FBS ב-PBS המכיל 1:200 (vol/vol) PerCP-efor 710 Cxcr4 מצועם נגד הנוגדן.
2. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5min ולשטוף על ידי הוספת 1-2 mL של הקרים PBS. צנטריפוגה את CPCs יחיד עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר ולשטוף פעמיים יותר פעמים ואחריו צנטריפוגה.
3. לייבש את supernatant ולהוסיף 500 μL של פתרון מיון FACS להשעות מחדש את CPCs היחיד ולסנן כמו בשלב 3.4.
4. בידוד Cxcr4 + ו-Cxcr4-תאים באמצעות FACS. לאסוף את התאים ממוין 1 mL של FBS. שמור את דגימת התא והתאים הממוינים ב-4 ° c.

5. ניתוח של שדות לב מבודדים בשדה הלב תאים

1. צנטריפוגה מיון CPCs עבור 3 דקות ב 270 x g וטמפרטורת החדר. ניתן להשתמש בתאים ממוינים עבור ניתוחים של גנים וביטויים בחלבון או שהם יכולים להיות מתורבתים לניתוח בנקודות זמן מאוחרות יותר.
2. כדי מחדש תרבות מבודדת CPCs, מרוב את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב-SFD בינונית ו resuspend ~ 3 x 10⁴ תאים לכל טוב של 384-באר צלחת מצופה עם 0.1% (w/v) ג'לטין.  אם מוות התאים מוגבר הוא ציין לאחר מיון, להוסיף 10 μM של Y-27632 (סלע מעכב) למדגם. יומיים לאחר התרבות החוזרת יש לציין הכאה ספונטנית.
3. כדי לנתח את היכולת של CPCs מצופה להבדיל לקרדיוציטים, לאסוף את התאים ביום 12 של בידול. השתמש בטריפסין כמתואר בצעדים 1.2-1.5 כדי לבודד CMs יחיד. השהה את התאים ב-4% (w/v) פאראפורמלדהיד (בחצי הט) ו דגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים.
4. צנטריפוגה את התאים עבור 3 דקות ב 895 x g, וטמפרטורת החדר. ומשהה את התאים ב-PBS. כדי לשטוף את הליגת העל חזור על שלב זה פעם נוספת.
5. ולהשעות את התאים. ב -10% בערוץ הPBS החלק השני של מדגם התא עם נוגדנים אנטי Troponin T העכבר (1:500) ולהשתמש בשאר המדגם כפקד שלילי. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שטוף את התאים פעמיים כפי שמתואר בשלב 5.4 באמצעות PBS. משלחים את supernatant ולהשעות את שתי דגימות התא ב 10% FBS ב PBS עם 1:500 חמור נגד העכבר IgG (H + L) נוגדן משני, אלקסה Fluor 647 המשלים. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
7. לרחוץ פעמיים עם PBS כמו בשלב 5.6. ולהשעות את התאים. ב200 μL של הערוץ החדש השתמש cytometer זרימה כדי לנתח את התאים.

תוצאות

לאחר כ 132 h של בידול, Tbx1-RFP ו-Hcn4-GFP מחשבים ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט (איור 2). באופן כללי, תאים GFP ו-RFP מופיעים בערך באותו זמן. שתי האוכלוסיות של CPCs ממשיכות להתרחב בסמיכות ובדרך כלל בתבנית משלימה. התאמת ריכוזי הפעילות הBMP4 תשנה את האחוזים של FHF לעומת SHF CPCs (איו...

Discussion

בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים מתודולוגיה ליצירת מידרואידים קרדיולוגית ומבודדים בשדה הלב הייחודיים של ה-CPCs. ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מנגנונים של מפרט CPC ותכונותיהם, כמו גם לדגמי מחלות ספציפיות לתאי לב. אחת העבודות שפורסמו בעבר השתמשו בשורה mESC עם שני כתבים פלורסנט (Mef2c/Nkx 2.5) כדי ללמוד cardiogenesis בת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
0.1% (w/v) Gelatin	EMD Millipore	ES-006-B
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360
100x Pen/Strep	Gibco	15070-063
1x PBS w/o Calcium and Magnesium	Thermo Fisher Scientific	21-040-CV
20% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	50-980-493
5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer	BD Falcon	35223
Activin A	R & D Systems	338-AC-010
Ascorbic Acid	Sigma	A-4544
B27 minus vitamin A (50x)	Thermo Fisher Scientific	12587010
BMP4	R & D Systems	314-BP
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Cell sorter	Sony	SH800	Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μm	Thermo Fisher Scientific	08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XT	Thermo Fisher Scientific	75004508
CHIR99021	Selleck chemicals	S2924
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flask	Corning	07-200-875
Countless II FL automated cell counter	Thermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)	Gibco	11965-092
EDTA	Sigma	E6758
ESGRO (LIF)	Millipore	ESG1106
EVOS FL microscope	Thermo Fisher Scientific	AMF4300
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	SH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM)	Gibco	11710035
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Ham’s F12	Gibco	10-080-CV
HEPES	Sigma	H3375
IMDM	Gibco	12440053
Monothioglycero (MTG)	Sigma	M-6145
Mouse anti-Troponin T antibody	Thermo Fisher Scientific	MS-295-P1
N2-SUPPLEMENT	Gibco	17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAA	Invitrogen	11140-050
PD0325901	Selleckchem	S1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody	Thermo Fisher Scientific	46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25 mm	Corning	430597
T25 flasks	Corning	353109
TrypLE (Trypsin)	Gibco	12604
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Stem cell technologies	72304