JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O objetivo deste método é gerar células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco in vitro para estudar a especificação de células progenitoras e propriedades funcionais, e para gerar células cardíacas específicas de câmara para modelagem de doenças cardíacas.

Resumo

Células-tronco pluripotentes oferecem grande potencial para a compreensão do desenvolvimento do coração e da doença e para a medicina regenerativa. Embora os recentes avanços na Cardiologia do desenvolvimento tenham levado a gerar células cardíacas a partir de células-tronco pluripotentes, não é claro se os dois campos cardíacos-o primeiro e o segundo campos cardíacos (FHF e SHF) – são induzidos em sistemas de células-tronco pluripotentes. Para abordar este, nós geramos um protocolo para in vitro a especificação e a isolação de pilhas cardíacas campo-específicas do progenitor do coração. Foram utilizadas linhagens de células-tronco embrionárias portadoras de Hcn4-GFP e Tbx1-CRE; Os repórteres de rosa-RFP do FHF e do SHF, respectivamente, e a imunomarcação da pilha viva da proteína Cxcr4 da membrana de pilha, um marcador de SHF. Com esta aproximação, nós geramos as pilhas do progenitor que recapitular as propriedades funcionais e o transcriptoma de seus homólogos in vivo. Nosso protocolo pode ser utilizado para estudar a especificação adiantada e a segregação dos dois campos do coração e para gerar pilhas cardíacas câmara-específicas para a modelagem da doença cardíaca. Uma vez que este é um sistema organoide in vitro, não pode fornecer informações anatômicas precisas. No entanto, este sistema supera a má acessibilidade dos embriões de estágio de gastrulação e pode ser aumentado para telas de alta taxa de transferência.

Introdução

O uso de células-tronco pluripotentes (PSCs) revolucionou o campo de regeneração cardíaca e medicina personalizada com miócitos específicos do paciente para modelagem de doenças e terapias medicamentosas1,2,3, 4. mais recentemente, os protocolos in vitro para a geração de cardiomiócitos atrial vs ventricular, bem como de marca-passo-tipo PSC-derivados têm sido desenvolvidos5,6. No entanto, se a cardiogênese pode ser recriada in vitro para estudar o desenvolvimento cardíaco e, posteriormente, gerar células cardíacas específicas da câmara ventricular ainda não está clara.

Durante o desenvolvimento embrionário adiantado, as pilhas Mesodermal a influência de espécies secretado tais como BMP4, wnts e activin a formam a raia primitiva7. Células mesodérmicas cardíacas marcadas pela expressão de Mesp1, migram anterioramente e ultimamente para formar o crescente cardíaco e, em seguida, o tubo do coração primitivo7,8. Este grupo migratório de células inclui duas populações muito distintas de células progenitoras cardíacas (CPCS), ou seja, o primeiro e o segundo campo cardíaco (FHF e SHF)9,10. As células do SHF são altamente proliferativas e migratórias e são principalmente responsáveis pelo alongamento e looping do tubo cardíaco. Adicionalmente, as células de SHF diferenciam-se aos cardiomiócitos, fibroblastos, músculo liso e células endoteliais à medida que entram no tubo cardíaco para formar o ventrículo direito, o trato de saída do ventrículo direito e grande parte de ambos os átrios7,10. Em contrapartida, as células FHF são menos proliferativas e migratórias e diferenciam-se principalmente dos cardiomiócitos, pois dão origem ao ventrículo esquerdo e menor parte dos átrios11. Além disso, os progenitores de SHF são marcados pelaexpressão de Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 enquanto as células FHF expressam Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.

PSCs pode diferenciar-se a todas as três camadas do germe e subseqüentemente a todo o tipo da pilha no corpo4,16. Conseqüentemente, oferecem o potencial tremendo para compreender o desenvolvimento do coração e para modelar defeitos desenvolventes específicos tendo por resultado a doença cardíaca congenital, a causa a mais freqüente de defeitos de nascimento17. Um grande subgrupo de cardiopatia congênita inclui anormalidades cardíacas específicas da câmara,18,19. Entretanto, ainda incerto se estes originam do desenvolvimento anômalo do campo do coração. Além disso, dada a incapacidade de os cardiomiócitos proliferar após o nascimento, tem havido esforços extensivos para criar tecido cardíaco para a regeneração cardíaca1,7,20. Considerando as diferenças fisiológicas e morfológicas entre as câmaras cardíacas, a geração de tecido cardíaco específico da câmara utilizando PSCs é de importância significativa. Quando os avanços recentes na Cardiologia desenvolvente conduziram à geração robusta de pilhas cardíacas de PSCs, é ainda obscuro se os dois campos do coração podem ser induzidos em sistemas do PSC.

Para recapitular a cardiogênese in vitro e estudar a especificação e as propriedades de CPCS, utilizou-se previamente um sistema baseado na diferenciação de esferóides cardíacos derivados do PSC21,22,23,24. Recentemente, geramos células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) com repórteres GFP e RFP o controle do gene FHF Hcn4 e do gene SHF Tbx1, respectivamente (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Os mESCs diferenciados in vitro formaram esferóides cardíacos nos quais as células GFP + e RFP + apareceram de duas áreas distintas de células mesodérmicas e padronizadas de forma complementar. As células GFP + e RFP + resultantes exibiram características de FHF e SHF, respectivamente, determinadas por sequenciamento de RNA e análises clonais. Importante, usando mESCs carregando o Isl1-RFP Reporter (mESCIsl1-RFP), descobrimos que as células de SHF foram fielmente marcadas pela proteína de superfície celular CXCR4, e isso pode permitir o isolamento de células específicas do campo cardíaco sem transgenes. O protocolo atual descreverá a geração e o isolamento de CPCs de campo específico do coração de mESCs, que pode servir como uma ferramenta valiosa para estudar a doença cardíaca câmara-específica.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Nota: Geração in vitro de células progenitoras cardíacas do rato específicas do campo cardíaco (Figura 1).

1. manutenção dos ESCs do rato

  1. Cresça mESCs (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mescISL1-RFP)25 em 0,1% (p/v) frascos de T25 revestidos com gelatina em meio 2i (870 ml de meio essencial de Glascow mínimo (Gmem), 100 ml de soro fetal bovino (FBS), 10 ml de glutamax, 10 ml de aminoácidos não essenciais, 10 ml de sódio piruvato, 3 μL de beta-Mercaptoetanol, 20 μL de LIF (200 U/mL), 0,3 μM CHIR99021 e 0,1 μM PD0325901).
  2. Quando as células atingem 70-80% de confluência, enxágüe as células uma vez com solução tampão fosfato (PBS) e, em seguida, dissociar em células individuais, adicionando 1 mL de tripsina e incubando a 37 ° c por 3 min.
  3. Neutralize a tripsina adicionando 4 mL de FBS 10% no meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM). Conte as células usando um contador de células automatizado.
  4. Centrífuga ~ 3 x 105 células por 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
  5. Aspirar o sobrenadante, ressuscitará as células em 5 ml de 2i médio e mas em 0,1% (w/v) gelatina revestido T25 frascos para manutenção.

2. geração de células progenitoras cardíacas usando esferóides cardíacos

  1. Centrifugador 2,5 x 106 células do passo 1,3 por 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
  2. Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 25 mL de meio SFD (105 células/ml). Dependendo da escala do experimento, o número do mESC pode ser ajustado de acordo.
    Nota: Meio SFD contém 715 mL de Iscove ' s modificado Dulbecco ' s Medium (IMDM), 250 mL de Ham ' s F12, 5 mL de N2-suplemento, 10 mL de B27 menos vitamina A, 5 mL de 10% (w/v) BSA (em PBS), 7,5 mL de GlutaMAX e 7,5 mL de penicilina-estreptomicina. Adicionar ácido ascórbico (50 mg/mL) e 3,9 x 10-3% (v/v) de monotioglicerol antes de usar.
  3. Placa de suspensão da célula em 1 150 mm x 25 mm placa estéril e incubar a 37 ° c na incubadora de 5% CO2 para 48 h. os esferóides cardíacos devem ser formados dentro de 24 h.
  4. Colete todos os esferóides cardíacos formados e centrifugue por 3 min a 145 x g e temperatura ambiente para isolar seletivamente os esferóides e evitar células individuais.
  5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os esferóides em 25 mL de meio SFD com 1 ng/mL de activin A e 1,5 ng/mL de BMP4 para indução de diferenciação. Placa de esferóides na mesma 150 mm x 25mm estéril placa e incubar-los em 37 ° c na 5% CO2 incubadora para 40 h.
    Nota: Diferentes concentrações de activin A (0-3 ng/mL) e BMP4 (0,5-2 ng/mL) podem ser usadas para otimização de diferenciação, dependendo da linha mESC.
  6. Colete todos os esferóides cardíacos e centrifugue por 3 min a 145 x g e temperatura ambiente.
  7. Aspirar o sobrenadante e ressuscigar os esferóides em 25 mL de meio de SFD. Transfira o EBs redobrado em um acessório Ultrabaixa 75 cm2 frasco e incubar-os em 37 ° c na incubadora de 5% co2 para 48 h.

3. isolamento das células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco usando repórteres fluorescentes

  1. Centrifugar esferóides cardíacos a 145 x g e temperatura ambiente por 3min e aspirar o sobrenadante. Adicionar 1 mL de tripsina e incubar a 37 ° c durante 3 min. Misture bem pipetando para dissociar as células.
  2. Adicionar 4 ml de FBS 10% em DMEM para inativar Trypsin e misture bem por pipetagem. Para remover o EBs não dissociado, filtre a mistura usando um filtro de 70 mm e Centrifugue as células filtradas por 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
  3. Para ordenar CPCs carregando repórteres fluorescentes (CPCs derivados de mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspirar o sobrenadante e acrescentar 500 μL de solução de triagem FACS (1% (v/v) FBS, 200 mm HEPES e 10 mm de EDTA em PBS) para ressuscição.
  4. Para remover todos os clusters de células antes da classificação, filtre as células novamente usando um tubo de 5 mL de poliestireno redondo de fundo com um filtro de célula de 40 μm. Mantenha as células no gelo até a triagem.
  5. Classifique as células para isolar Tbx1-CRE; CPCs positivos de rosa-RFP e HCN4-GFP usando um classificador de células ativados fluorescentes (FACS). Colete as células classificadas em 1 mL de FBS. Mantenha a amostra da célula e as células classificadas a 4 ° c.

4. isolação de pilhas cardíacas específicas do progenitor do campo do coração usando Cxcr4 como um marcador da proteína de superfície da pilha

  1. Para isolar os CPCs do primeiro campo do segundo coração com base na expressão do receptor de proteína de superfície Cxcr4, use a linha mESCIsl1-RFP. Aspirar o sobrenadante da etapa 3,3 e ressuspender os CPCs únicos em 300 μL de FBS 10% em PBS contendo 1:200 (Vol/Vol) PerCP-efluor 710 conjugado anticorpo Cxcr4.
  2. Incubar à temperatura ambiente para 5min e lave adicionando 1-2 mL de PBS frio. Centrifugue as únicas CPCs durante 3 min a 270 x g e a temperatura ambiente e lave mais duas vezes seguidas de centrifugação.
  3. Aspirar o sobrenadante e adicionar 500 μL de solução de triagem FACS para suspender os CPCs únicos e filtrar como na etapa 3,4.
  4. Isolar Cxcr4 + e Cxcr4-células usando FACS. Colete as células classificadas em 1 mL de FBS. Mantenha a amostra da célula e as células classificadas a 4 ° c.

5. análise de células progenitoras cardíacas específicas do campo cardíaco isolado

  1. Centrífuga classificado CPCs por 3 min em 270 x g e temperatura ambiente. As células classificadas podem ser usadas para análises de expressão de genes e proteínas ou podem ser reculturadas para análises em pontos de tempo posteriores.
  2. Para re-cultura CPCS isolados, aspirar o sobrenadante, ressuscitar as células em meio SFD e mas ~ 3 x 104 células por poço de uma placa 384-bem revestida com 0,1% (w/v) gelatina.  Se o aumento da morte celular for observado após a triagem, adicione 10 μM de Y-27632 (inibidor de rocha) à amostra. Dois dias após o reculture, bater espontâneo deve ser anotado.
  3. Para analisar a capacidade de CPCs chapeados para diferenciar-se aos cardiomiócitos, colete as células no dia 12 de diferenciação. Use Trypsin como descrito nas etapas 1.2-1.5 para isolar o único CMs. ressuscite as células em 4% (p/v) paraformaldeído (PFA) e incubar por 30 min à temperatura ambiente para fixar as células.
  4. Centrifugue as células durante 3 min a 895 x ge a temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e suspender as células em PBS para lavar o PFA. Repita este passo mais uma vez.
  5. Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 10% FBS em PBS. Incubar metade da amostra de células com anticorpo anti-troponina T de rato (1:500) e utilize o resto da amostra como um controlo negativo. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
  6. Lave as células duas vezes, conforme descrito na etapa 5,4 usando PBS. Aspirar o sobrenadante e ressuspender ambas as amostras de células em 10% FBS em PBS com 1:500 burro anti-mouse IgG (H + L) anticorpo secundário, Alexa fluor 647 conjugar. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
  7. Lave duas vezes com PBS como na etapa 5,6. Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 200 μL de PBS. Use um citometro de fluxo para analisar as células.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Após aproximadamente 132 h de diferenciação, os CPCs Tbx1-RFP e Hcn4-GFP podem ser detectados usando um microscópio fluorescente (Figura 2). Geralmente, as células GFP e RFP aparecem aproximadamente ao mesmo tempo. As duas populações de CPCs continuam a se expandir em estreita proximidade e comumente em um padrão complementar. O ajuste das concentrações de activin A e BMP4 alterará as porcentagens de FHF vs SHF CPCs (Figura 3). A especificação de CP...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Em nosso protocolo, nós descrevemos uma metodologia para gerar esferoides cardíacos e CPCS campo-específicos isolados do coração. Esses podem ser usados para estudar mecanismos de especificação de CPC e suas propriedades, bem como para a modelagem da doença de câmara cardíaca específica. Um trabalho publicado anteriormente utilizou uma linha de mESC com dois repórteres fluorescentes (Mef2c/nkx 2.5) para estudar a cardiogênese in vitro, no entanto, ambos os marcadores são expressos no dia embrionário 9.5-10...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgações.

Agradecimentos

E. T. foi apoiado por a magia que importa e AHA. C. K. foi apoiado por subvenções da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
β-mercaptoethanolSigmaM6250
0.1% (w/v) GelatinEMD MilliporeES-006-B
100 mM Sodium PyruvateGibco11360
100x Pen/StrepGibco15070-063
1x PBS w/o Calcium and MagnesiumThermo Fisher Scientific21-040-CV
20% ParaformaldehydeThermo Fisher Scientific50-980-493
5 mL Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainerBD Falcon35223
Activin AR & D Systems338-AC-010
Ascorbic AcidSigmaA-4544
B27 minus vitamin A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
BMP4R & D Systems314-BP
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
Cell sorterSonySH800Sony or any other fluorescence-activated cell sorter
Cell strainer 70μmThermo Fisher Scientific08-771-2
Centrifuge Sorvall Legend XTThermo Fisher Scientific75004508
CHIR99021Selleck chemicalsS2924
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 flaskCorning07-200-875
Countless II FL automated cell counterThermo Fisher Scientific
Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo Fisher ScientificA-31571, Lot #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)Gibco11965-092
EDTASigmaE6758
ESGRO (LIF)MilliporeESG1106
EVOS FL microscopeThermo Fisher ScientificAMF4300
Fetal Bovine SerumInvitrogenSH30071.03
Glasgow’s MEM (GMEM)Gibco11710035
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
Ham’s F12Gibco10-080-CV
HEPESSigmaH3375
IMDMGibco12440053
Monothioglycero (MTG)SigmaM-6145
Mouse anti-Troponin T antibodyThermo Fisher ScientificMS-295-P1
N2-SUPPLEMENTGibco17502-048
Non-essential amino acid solution (NEAAInvitrogen11140-050
PD0325901SelleckchemS1036
PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibodyThermo Fisher Scientific46-9991-82
Suspension culture dish 150 mm x 25 mmCorning430597
T25 flasksCorning353109
TrypLE (Trypsin)Gibco12604
Y-27632 (ROCK inhibitor)Stem cell technologies72304

Referências

  1. Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  2. Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  3. Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors--a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
  4. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  5. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  6. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  7. Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
  8. Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
  9. Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292(2013).
  10. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
  11. Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
  12. Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
  13. Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
  14. Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
  15. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  16. Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
  17. Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
  18. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
  19. Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
  20. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  21. Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413(2012).
  22. Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
  23. Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164(2014).
  24. Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
  25. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140(2018).
  26. Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Biologia do desenvolvimentoedi o 149c lulas troncocampos card acosprogenitores card acosesfer ides card acosTbx1Hcn4Cxcr4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados