Microscopía de Fluorescencia de Células Vivas para Investigar la Localización de Proteínas Subcelulares y Cambios de Morfología Celular en Bacterias

Resumen

Este artículo proporciona una guía paso a paso para investigar la dinámica de localización subcelular de proteínas y para monitorear los cambios morfológicos usando microscopía de fluorescencia de alta resolución en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.

Resumen

Las investigaciones de factores que influyen en la división celular y la forma celular en las bacterias se realizan comúnmente junto con la microscopía de fluorescencia de alta resolución, ya que las observaciones realizadas a nivel de población pueden no reflejar realmente lo que ocurre a un nivel de célula única. La microscopía timelapse de células vivas permite a los investigadores monitorear los cambios en la división celular o la morfología celular que proporcionan información valiosa sobre la localización subcelular de proteínas y el momento de la expresión génica, como sucede, para ayudar potencialmente a responder preguntas biológicas importantes. Aquí, describimos nuestro protocolo para monitorear los cambios fenotípicos en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus usando un microscopio de desconvolución de alta resolución. El objetivo de este informe es proporcionar un protocolo simple y claro que pueda ser adoptado por otros investigadores interesados en llevar a cabo experimentos de microscopía de fluorescencia para estudiar diferentes procesos biológicos en bacterias y otros organismos.

Introducción

El campo de la biología celular bacteriana se ha visto significativamente mejorado por los recientes avances en las técnicas de microscopía^1,2. Entre otros instrumentos, los microscopios que son capaces de realizar experimentos de microscopía de fluorescencia timelapse siguen siendo una herramienta valiosa. Los investigadores pueden monitorear varios eventos fisiológicos en tiempo real utilizando proteínas fluorescentes tales como, fusión de reporteros transcripcionales y traslacionales basados en proteínas fluorescentes verdes (GFP), fluorescentes D-aminoácidos (FDAA)^3,o usar otras manchas para etiquetar la pared celular, la membrana y el ADN. Por lo tanto, no es de extrañar que la microscopía de fluorescencia siga siendo popular entre los biólogos de células microbianas. Además de simplemente mostrar los fenotipos finales, proporcionar información sobre cómo surgen los fenotipos observados mediante la microscopía timelapse podría agregar un valor significativo a los hallazgos y potencialmente ofrecer pistas sobre qué procesos celulares están siendo blanco de posibles candidatos^{a medicamentos 4}.

En este artículo se proporcionan los protocolos para realizar imágenes de alta resolución utilizando un microscopio de fluorescencia de campo ancho totalmente motorizado, invertido (véase la Tabla de Materiales). Estos protocolos podrían adaptarse a las necesidades de otros microscopios de fluorescencia que son capaces de realizar microscopía timelapse. Aunque el software discutido aquí corresponde al software específico suministrado por el fabricante como se indica en la Tabla de Materiales,el software comúnmente suministrado por otros fabricantes de microscopios o el ImageJ⁵de libre disposición, tienen herramientas equivalentes para analizar datos de microscopía. Para condiciones en las que el timelapse no es propicio, se podrían llevar a cabo experimentos de curso de tiempo como se describe en este artículo. Los protocolos descritos aquí proporcionan una guía detallada para estudiar los cambios fenotípicos en dos especies bacterianas diferentes: B. subtilis y S. aureus. Consulte la Tabla 1 para las cepas utilizadas.

Protocolo

1. Condiciones generales de crecimiento

1. Inocular 2 ml de medio de crecimiento adecuado suplementado con antibióticos (cuando sea necesario) con una sola colonia de la(s) cepa(s) a la imagen. Incubar estos cultivos de semillas durante la noche a 22 oC en una incubadora de temblores.
   NOTA: Las condiciones específicas de crecimiento bacteriano utilizadas en este artículo se proporcionan en la sección de resultados representativos.
2. Diluir los cultivos nocturnos 1:20 en medios frescos en un matraz de 125 ml, suplemento con antibióticos (cuando sea necesario).
3. Cultivar el cultivo(s) a 37 oC en una incubadora de temblores hasta la fase logarítmica media (OD₆₀₀ a 0,5).
   NOTA: El inductor o inhibidor podría añadirse directamente al cultivo o cultivos en crecimiento en la fase de crecimiento adecuada.
4. Cosecha las células en las condiciones de cultivo deseadas para la preparación de muestras de microscopía como se describe en la siguiente sección.

2. Preparación de la muestra

1. Preparar el 1% de agarosa combinando 0,25 g de grado de biología molecular, eEO bajo, agarosa con 25 ml de medio de crecimiento complementado con antibióticos apropiados (cuando sea necesario) para la microscopía de timelapse o agua estéril. Calentar la mezcla con la ayuda de un microondas durante aproximadamente 30 s y verter en una placa estéril de 100 mm x 15 mm Petri y dejar que se solidifique.
2. Tome una alícuota de 5–50 l del cultivo celular dependiendo de la necesidad y manchar las células. Células de mancha con tintes apropiados en esta etapa (por ejemplo, añadir tinte fluorescente FM4-64 (mancha de membrana) para un experimento(Figura 1)).
   1. Pipetear una alícuota de 5 ol de la muestra de cultivo o muestra de vid manchada que se va a tomar una imagen en la parte inferior de un plato de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm (con un diámetro de micropozo de 14 mm y unrevestimiento No. 1.5; véase la Tabla de Materiales).
      ADVERTENCIA: No utilice cubiertas recubiertas de poli-L-lisina especialmente para la microscopía timelapse, ya que podrían inducir un patrón de crecimiento diferente (hemos observado esto con poli-D-lisina también; datos no mostrados) y / o afectar la dinámica de^{proteínas 6}.
   2. Para minimizar el uso de colorantes, ten la suspensión celular de 3-4 l (cosechada a OD₆₀₀ a 0,5; aproximadamente 2,7 x 10⁷ y 3,4 x 10⁷ para B. subtilis y S. aureus respectivamente por cultivo de 1 ml) directamente en el plato inferior de vidrio.
   3. Coloque una losa de agarosa precortada (11 mm de diámetro o de cualquier tamaño deseado para superponer el área del cubreobjetos; corte utilizando el extremo abierto de un tubo estéril o una cuchilla de afeitar) en la parte superior de la muestra y toque suavemente para asegurarse de que la losa de agarosa esté acostada contra el cubreobjetos.
3. Después de la toma de imágenes (ver sección siguiente), si el número de celdas en el campo de visión no es deseable, ajuste la densidad celular de la muestra a través de la dilución o concentración por centrifugación y modifique la proporción de células en la muestra utilizando medio de crecimiento/ búfer según sea necesario.
   NOTA: Para minimizar la autofluorescencia que emana del medio de cultivo, las células se pueden lavar en tampón (por ejemplo, en la salina tampón de fosfato 1x estándar) y resuspenderse en la cantidad adecuada de tampón antes de la toma de imágenes. Es posible que en este paso las células o vesículas más pequeñas no se conserven después de la centrifugación y, por lo tanto, se pierdan.
4. Agregue agua utilizando una pipeta (gotas de 5 l) al espacio dentro de la placa de cultivo (alrededor de la cubierta) para evitar que la almohadilla de agarosa se seque y para ayudar a mantener la humedad durante el transcurso de la adquisición de la imagen, especialmente para los experimentos de timelapse.
5. Permita que los platos de cultivo se equilibren a la temperatura dentro de la cámara de incubación, un compartimento opaco incorporado proporcionado por el fabricante, del microscopio durante 15-20 min.
   NOTA: Encienda el elemento calefactor y ajuste la cámara de incubación a la temperatura deseada varias horas antes de la toma de imágenes. Esto garantizará que el hardware se estabilice a la nueva temperatura. Para obtener imágenes prolongadas de timelapse, coloque un vaso de precipitados o un matraz con agua dentro de la cámara del microscopio, lejos del área de trabajo, para mantener la humedad.

3. Imágenes

1. El día del experimento, encienda el sistema del microscopio. Inicie el software de imágenes (consulte Tabla de materiales)haciendo clic en el icono correspondiente en el escritorio. Inicializar el microscopio haciendo clic en la opción Inicializar microscopio (botón representado con un microscopio) en el cuadro de diálogo de inicio del software. Asegúrese de que el objetivo se reduce por completo utilizando el ajuste grueso del microscopio antes de la inicialización.
   NOTA: Después de la inicialización, deben aparecer tres cuadros de diálogo adicionales además del menú de inicio: resolve3D, recopilación de datos y monitor de filtro.
2. Coloque una gota de aceite de 1.517 (índice de refracción) en el objetivo de inmersión en aceite 100x suministrado por el fabricante (Apertura numérica 1,4, Distancia de trabajo a 0,12 mm; ver Tabla de materiales).
   NOTA: Es importante elegir el aceite de inmersión adecuado para la temperatura a la que se llevan a cabo las imágenes.
3. Cargue el plato inferior de vidrio que contiene la muestra en la carcasa metálica (ataúd) y deslice suavemente en la abrazadera del escenario.
4. Utilice la perilla de ajuste gruesa para elevar el objetivo hasta que el aceite entre en contacto con la parte inferior de vidrio del plato. Utilice la pieza ocular y la perilla de ajuste fina para enfocar la muestra. Una vez que las células estén enfocadas, gire la perilla de la pieza ocular al modo de cámara moviendo el interruptor selector situado en la parte delantera del cuerpo del microscopio hacia la izquierda.
5. Comience a experimentar con el software de imágenes. En la ventana resolve3D, seleccione el icono de experimento Diseño/ejecución representado por un matraz. Debería aparecer un nuevo cuadro de diálogo titulado diseño/experimento de ejecución.
   1. Establezca el número de pilas Z y el grosor de la muestra mediante la ficha diseño y, a continuación, seccionamiento en el cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución.
      NOTA: Para los experimentos en la sección de resultados representativos, se utilizaron 17 pilas Z a intervalos de 200 nm para imágenes fijas y cuatro pilas Z a intervalo de 200 nm para microscopía de lapso de tiempo.
   2. Para medir el grosor de las celdas de la muestra, ajuste manualmente el plano Z de forma incremental utilizando las flechas arriba y abajo del cuadro de diálogo resolve3D. Marque dónde las celdas se desenfocan como límite superior e inferior para la adquisición de imágenes. Importe esta información antes de ejecutar el experimento.
   3. Para ayudar a minimizar la fototoxicidad y el fotoblanqueo durante la toma de imágenes de timelapse, reduzca el número de pilas Z y elija el plano medio de las celdas para la adquisición de imágenes.
6. Seleccione el conjunto de filtros adecuado para el experimento utilizando la ficha diseño y, a continuación, canales en el cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Además, seleccione una referencia para la recopilación de información POL/DIC. Ajuste la transmisión porcentual (intensidad de la luz) y la duración de la exposición para los canales individuales seleccionados antes de la toma de imágenes seleccionando las opciones adecuadas en el cuadro de diálogo resolve3D.
      NOTA: En un campo de visión de prueba que no se tiene en cuenta para la prueba del experimento, estos ajustes para identificar si los parámetros seleccionados obtienen datos significativos de fluorescencia sin que falte señal débil o que la sobresaturan. A continuación, importe estos parámetros para la configuración experimental.
7. Abra la lista de puntos seleccionando el botón Lista de puntos en el cuadro de diálogo resolve3D. Debería aparecer un nuevo cuadro de diálogo de lista de puntos autorizados. Marque varios campos de vista que se utilizarán en el experimento buscando campos de visión adecuados mediante los controles de etapa del microscopio y seleccionando la opción de punto de marca en el cuadro de diálogo de lista de puntos.
   NOTA: Se tendrá que seleccionar un punto de sustitución cada vez que el microscopio se vuelva a enfocar en un punto de la lista de puntos. Esto se puede hacer enfocando el microscopio en el punto apropiado de la lista y luego seleccionando el botón de reemplazar punto. Es importante no tocar la perilla de ajuste analógico grueso / fino al reenfocar; utilizar sólo el software para ajustar el enfoque.
8. Establezca los parámetros de timelapse seleccionando primero el diseño y, a continuación, la pestaña timelapse en el cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución. Active la casilla de verificación timelapse. Introduzca los parámetros de timelapse adecuados en términos de imágenes de timelapse/tiempo total.
9. Establezca los puntos que se van a crear en la lista de puntos seleccionando primero el diseño y, a continuación, la ficha Puntos del cuadro de diálogo del experimento de diseño/ejecución. Seleccione la opción de lista de puntos de visita e introduzca los puntos que se van a crear una imagen en el cuadro de texto separados por comas o guiones si se trata de una secuencia completa.
10. Antes de iniciar un experimento, edite los nombres de archivo y las ubicaciones de archivo mediante la pestaña Ejecutar del cuadro de diálogo Diseño/ejecución. La ubicación del archivo se puede cambiar seleccionando el botón de configuración, seleccionando la carpeta de datos y, a continuación, seleccionando la carpeta adecuada o creando una nueva. Cambie los nombres de archivo introduciendo el nuevo nombre de archivo en el cuadro de texto Nombre de archivo de imagen.
11. Comience el experimento seleccionando el botón de reproducción en el cuadro de diálogo Iniciar experimento.
    NOTA: Para timelapse, compruebe continuamente el enfoque en cada campo de visión a lo largo del experimento utilizando la configuración DIC (para evitar el fotoblanqueo innecesario) y vuelva a enfocar y actualice la información en la lista de puntos a medida que las celdas tienden a perder el foco con el tiempo.

4. Procesamiento de imágenes

1. Abra los archivos de imagen sin procesar (R3D) deseados para la generación de figuras.
   NOTA: Los archivos guardados recientemente se pueden encontrar mediante el botón de carpeta de datos del cuadro de diálogo de inicio del software de imágenes.
2. Ejecute el programa de desconvolución, para eliminar la luz de fluorescencia desenfocada^7,8, con el fin de producir un archivo de imagen D3D desconvolved. Seleccione la pestaña de proceso en el cuadro de diálogo de inicio y, a continuación, seleccione deconvolve. Aparecerá un nuevo cuadro de diálogo titulado deconvolve.
   1. Establezca los parámetros de desconvolución arrastrando el número de imagen adecuado (ubicado en la esquina superior izquierda de cada archivo de imagen) a la entrada del cuadro de diálogo de deconvolución. En el cuadro de diálogo de desconvolución, seleccione el botón de más opciones y anule la selección de la casilla de verificación de desplazamiento del borde de recorte después del procesamiento (de lo contrario, las imágenes no se pueden superponer sobre el archivo DIC correspondiente).
   2. Haga clic en el botón hacerlo en el cuadro de diálogo de deconvolución para desconvolver el archivo de imagen sin procesar.
      NOTA: Los parámetros de desconvolución podrían ajustarse según lo indicado en el manual de instrucciones del fabricante del software para obtener los resultados deseados.
3. Si es necesario, realice la resta manual de ruido de fondo y el ajuste de brillo/contraste en cualquiera o todos los canales de longitud de onda (color). Para ello, seleccione el botón de ajuste de contraste en el archivo de imagen desconvoluda.
4. Guarde la imagen como un archivo TIFF seleccionando primero la opción de archivo en la parte superior del cuadro de diálogo D3D. A continuación, seleccione Guardar como TIFF, identifique y seleccione pilas Z adecuadas (que están dentro del foco), seleccione o anule la selección de los conjuntos de filtros deseados.
5. Realice la cuantificación de datos utilizando cualquier software suministrado por el fabricante o programas de libre disponibilidad, como ImageJ^5.
   1. Para la cuantificación del tamaño de celda, haga clic en la pestaña de la herramienta en el archivo de imagen D3D adecuado y, a continuación, seleccione la opción de medir distancias. Mida las distancias seleccionando los puntos inicial y final en el archivo de imagen deseado con el ratón a través de los clics izquierdos.
      NOTA: Es mejor acercar la imagen durante la cuantificación del tamaño de la celda.
   2. Para la cuantificación de la señal de fluorescencia, utilice la opción de inspector de datos en la pestaña de herramientas del archivo de imagen D3D adecuado.
      NOTA: Lo mejor es acercar la imagen y tener sólo filtros relevantes seleccionados al completar la cuantificación de la señal de fluorescencia.
   3. Para cuantificar la señal de fluorescencia, dibuje una caja con la opción de columna/fila establecida en una dimensión específica. Seleccione un área con la señal que desea cuantificar y registre el valor. Mida la señal de fondo utilizando el mismo cuadro de tamaño para seleccionar un área inmediatamente fuera de las celdas. Restar el valor de fondo del valor registrado de la señal de fluorescencia obtenida dentro de la célula.

Resultados

Fenotipos GpsB
Anteriormente hemos demostrado que Sa-GpsB es una proteína esencial ya que el agotamiento de GpsB utilizando un ARN antisentido da como resultado la lisis celular⁹. Aquí describimos cómo la aparición de varios fenotipos de división celular y cambios en la localización de proteínas podrían capturarse utilizando el protocolo de microscopía timelapse descrito en este artículo. Para ello, las cepas de S. aureus RB143 [SH1000 que albergan pEPSA5 (ve...

Discusión

La microscopía ha seguido siendo un pilar en los estudios relacionados con organismos microbianos. Dado su tamaño de célula a escala de micrones, los estudios a nivel de una sola célula se han basado tradicionalmente en la microscopía electrónica (EM). Aunque EM se ha convertido en una técnica bastante poderosa en los últimos años, tiene sus propias limitaciones intrínsecas además del acceso limitado de los usuarios^16. Las mejoras en las técnicas de microscopía de fluorescencia y el d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI	Invitrogen	D3571	Microscopy
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopy
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
IPTG	Fisher BioReagents	BP1755-10	Dioxane-free
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ inhibitor
SoftWorx	GE		Manufacturer-supplied imaging software