박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

요약

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

초록

박테리아에 있는 세포 분열 그리고 세포 모양에 영향을 미치는 요인의 조사는 인구 수준에서 행해진 관측이 진정으로 단 하나 세포 수준에서 일어나는 무슨을 반영하지 않을 수 있기 때문에 고해상도 형광 현미경 검사법과 함께 일반적으로 수행됩니다. 살아있는 세포 시간 경과 현미경 검사법은 잠재적으로 중요한 생물학 질문에 대답하는 것을 돕기 위하여, 일어나는 단백질의 세포 외 현지화 및 유전자 발현의 타이밍에 관하여 귀중한 통찰력을 제공하는 세포 분열 또는 세포 형태학에 있는 변경을 감시하는 것을 허용합니다. 여기에서, 우리는 고해상도 데콘볼루션 현미경을 사용하여 바실러스 subtilis 및 황색포도상구균에 있는 표현형 변경을 감시하기 위하여 우리의 프로토콜을 기술합니다. 이 보고서의 목적은 박테리아뿐만 아니라 다른 유기체에서 다른 생물학적 과정을 연구하기 위해 형광 현미경 실험을 수행에 관심이다른 조사자에 의해 채택 될 수있는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

서문

세균성 세포 생물학의 필드는 현미경 기술^1,2에있는 최근 발전에 의해 현저하게 향상되었습니다. 다른 기기 들 중에서도 타임랩스 형광 현미경 실험을 수행할 수 있는 현미경은 여전히 귀중한 도구입니다. 연구원은 녹색 형광 단백질 (GFP) 기반 전사 및 번역 기자 융합, 형광 D 아미노산 (FDAA)^3,또는 세포벽, 막 및 DNA를 라벨링하기 위한 다른 얼룩을 사용하여 다양한 생리적 사건을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법은 미생물 세포 생물학자 중 인기를 유지하는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 단순히 말기 표현형을 보여주는 것 이외에, 타임랩스 현미경을 사용하여 관찰된 표현형이 어떻게 발생하는지에 대한 정보를 제공하는 것은 연구 결과에 상당한 가치를 더할 수 있으며 잠재적으로 어떤 세포 과정이 잠재적 약물 후보에 의해 표적으로 되고 있는지에 대한 단서를 제공할 수 있다^4.

완전 전동, 반전, 광시야 형광 현미경을 사용하여 고해상도 이미징을 수행하는 프로토콜(재료 표참조)이 이 문서에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 타임랩스 현미경을 수행할 수 있는 그밖 형광 현미경의 필요에 맞게 적응될 수 있었습니다. 여기에 설명된 소프트웨어는 재료 표에표시된 특정 제조업체 제공 소프트웨어에 해당하지만 일반적으로 다른 현미경 제조업체 또는 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ^5에서제공하는 소프트웨어에는 현미경 데이터를 분석하는 동등한 도구가 있습니다. 타임랩스가 도움이 되지 않는 조건의 경우 이 문서에서 설명한 대로 시간 코스 실험을 수행할 수 있습니다. 여기에서 기술된 프로토콜은 2개의 다른 세균성 종에 있는 표현형 변경을 공부하기 위하여 상세한 가이드를 제공합니다: B. subtilis 및 S. 아우레우스. 사용되는 균주에 대한 표 1을 참조하십시오.

프로토콜

1. 일반적인 성장 조건

1. 항생제로 보충된 적절한 성장 배지의 2 mL을 접종(필요한 경우) 스트레인의 단일 콜로니와 함께 이미지화한다. 이러한 종자 배양물을 22°C에서 밤새 교양하여 인큐베이터에 배양하였다.
   참고: 이 문서에서 사용되는 특정 박테리아 성장 조건은 대표 결과 섹션에 제공됩니다.
2. 125 mL 플라스크에서 신선한 매체에 하룻밤 배양액을 희석하고 항생제 (필요한 경우)로 보충하십시오.
3. 37°C에서 37°C에서 배양물을 중장악기 상까지 성장시다(OD₆₀₀ = 0.5).
   참고: 유도제 또는 억제제는 적절한 성장 단계에서 성장 배양에 직접 첨가될 수 있다.
4. 다음 절에 기재된 바와 같이 현미경 시료 준비를 위한 원하는 배양 조건에서 세포를 수확한다.

2. 견본 준비

1. 분자 생물학 등급 0.25 g, 낮은 EEO, agarose와 25 mL의 성장 배지를 적절한 항생제 (필요한 경우)와 결합하여 1 %의 아가로스를 준비하십시오. 전자 레인지의 도움으로 약 30s의 도움으로 혼합물을 가열하고 멸균 100mm x 15mm 페트리 접시에 부어 고체하게하십시오.
2. 필요에 따라 세포 배양의 5-50 μL aliquot를 취하고 세포를 염색한다. 이 단계에서 적절한 염료를 가진 얼룩 세포 (예를 들어, 실험을 위한 형광 염료 FM4-64 (막 얼룩)를 첨가한다(도1).).
   1. 피펫 배양 시료 또는 스테인드 시료의 5 μL aliquot는 35 mm 유리 바닥 배양 접시의 바닥에 이미지화된다(14 mm 마이크로웰 직경 및 코팅되지 않은 No. 1.5 커버슬립; 재료표참조).
      주의 : 폴리 - L-리신 코팅 커버립을 사용하지 마십시오 특히 그들은 다른 성장 패턴을 유도 할 수 로 타임 랩스 현미경 검사법 (우리는 뿐만 아니라 폴리 - D-리신이 관찰 한 데이터; 데이터는 표시되지 않음) 및 / 또는 단백질 역학에 영향을^{미치는 6.}
   2. 염료의 사용을 최소화하기 위해, 얼룩 3-4 μL 세포 현탁액 (OD₆₀₀ = 0.5에서 수확, 약 2.7 x 10⁷ 및 3.4 x 10⁷ B. subtilis 및 S. 아우레우스 각각 1 mL 배양당) 유리 바닥 접시에 직접.
   3. 미리 자른 아가로즈 슬래브(직경 11mm 또는 원하는 크기의 덮개 면적과 겹치기, 멸균 튜브 또는 면도날의 열린 끝을 사용하여 잘라낸 것)를 시료 위에 놓고 부드럽게 탭하여 아가로즈 슬래브가 커버슬립에 평평하게 놓여 있는지 확인합니다.
3. 이미징 후(다음 섹션 참조), 시야에 있는 세포 수가 바람직하지 않은 경우, 원심분리에 의한 희석 또는 농도를 통해 시료의 세포 밀도를 조정하고 필요에 따라 성장 배지/버퍼를 사용하여 샘플의 세포 비율을 변경합니다.
   참고: 배양 배지에서 방출되는 자가형광을 최소화하기 위해 세포는 버퍼(예: 표준 1x 인산 완충액 염수)로 세척하고 이미징 전에 적절한 양의 버퍼로 재중단할 수 있습니다. 이 단계에서 더 작은 세포 또는 소포는 원심 분리 후에 유지되지 않을 수 있으며 따라서 손실 될 수 있습니다.
4. 아가로즈 패드가 건조되는 것을 방지하고, 특히 타임랩스 실험을 위해 배양 접시(커버슬립 주변)의 공간에 파이펫(~5 μL drops)을 사용하여 물을 첨가하여 아가로즈 패드가 건조되는 것을 방지하고, 특히 타임랩스 실험을 위해 이미지를 획득하는 동안 습도를 유지하는 데 도움을 줍니다.
5. 배양 접시가 15-20 분 동안 현미경의 제조업체에서 제공하는 불투명 한 구획인 인큐베이션 챔버 내부의 온도와 평형화 할 수 있습니다.
   참고 : 가열 요소를 켜고 이미징 하기 몇 시간 전에 인큐베이션 챔버를 원하는 온도로 설정합니다. 이렇게 하면 하드웨어가 새 온도로 안정화됩니다. 장기간 타임랩스 이미징을 위해 비커나 플라스크를 작업 영역에서 멀리 떨어진 현미경 챔버 내부에 놓고 습도를 유지하십시오.

3. 이미징

1. 실험 당일, 현미경 시스템을 켭니다. 바탕 화면에서 적절한 아이콘을 클릭하여 이미징 소프트웨어(재료 표참조)를 시작합니다. 소프트웨어의 시작 대화 상자에서 현미경 초기화 옵션(현미경으로 묘사된 단추)을 클릭하여 현미경을 초기화합니다. 초기화 전에 현미경 의 거친 조정을 사용하여 목표가 완전히 낮아지도록 하십시오.
   참고: 초기화 후 시작 메뉴(resolve3D, 데이터 수집 및 필터 모니터)에 세 개의 추가 대화 상자가 나타납니다.
2. 제조업체에서 제공하는 100x 오일 침지 목표에 1.517(굴절률) 오일을 떨어뜨립니다(수치 조리개 = 1.4, 작동 거리 = 0.12 mm; 재료 표참조).
   참고: 이미징이 수행되는 온도에 적합한 침지 오일을 선택하는 것이 중요합니다.
3. 샘플이 들어있는 유리 바닥 접시를 금속 하우징(관)에 적재하고 스테이지 클램프로 부드럽게 밀어 넣습니다.
4. 거친 조정 노브를 사용하여 오일이 접시의 유리 바닥과 접촉 할 때까지 목표를 올립니다. 아이 피스와 미세 조정 노브를 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다. 세포가 초점이 되면 현미경 본체 전면에 있는 셀렉터 스위치를 왼쪽으로 이동하여 눈 조각에서 카메라 모드로 손잡이를 돌립니다.
5. 이미징 소프트웨어를 사용하여 실험을 시작합니다. resolve3D 창에서 플라스크로 표시된 실험 디자인/실행 아이콘을 선택합니다. 디자인/실행 실험이라는제목이 있는 새 대화 상자가 나타납니다.
   1. 설계를 사용하여 Z 스택 및 샘플 두께수를 설정한 다음 설계/실행 실험 대화 상자에서 단면 탭을 설정합니다.
      참고: 대표적인 결과 섹션의 실험의 경우, 스틸 이미지에 대한 200 nm 간격에서 17개의 Z 스택과 타임랩스 현미경을 위한 200 nm 간격의 4개의 Z-스택을 사용하였다.
   2. 샘플에서 셀의 두께를 측정하려면 resolve3D 대화 상자의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 Z 평면을 점진적으로 수동으로 조정합니다. 셀이 초점이 벗어난 위치를 이미지 수집의 상한 및 하한으로 표시합니다. 실험을 실행하기 전에 이 정보를 가져옵니다.
   3. 타임랩스 이미징 중에 광독성 및 광표백을 최소화하려면 Z 스택 수를 줄이고 이미지 수집을 위해 셀의 중간 평면을 선택합니다.
6. 설계를 사용하여 실험에 적합한 필터 세트를 선택한 다음 디자인/실행 실험 대화 상자에서 채널 탭(TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; m체리: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. 또한 POL/DIC 정보 수집에 대한 참조를 선택합니다. resolve3D 대화 상자에서 적절한 옵션을 선택하여 이미징 전에 선택한 개별 채널에 대한 백분율 전송(광도) 및 노출 기간을 조정합니다.
      참고: 실험 테스트에서 고려되지 않은 테스트 필드에서 선택한 매개 변수가 약한 신호를 놓치거나 과포화하지 않고 의미 있는 형광 데이터를 얻는지 식별합니다. 그런 다음 실험 설정에 대해 이러한 매개 변수를 가져옵니다.
7. resolve3D 대화 상자에서 포인트 목록 단추를 선택하여 포인트 목록을 엽니다. 제목이 있는 점 목록이새 대화 상자로 나타납니다. 현미경 스테이지 컨트롤을 사용하여 적절한 시야를 찾고 포인트 목록 대화 상자에서 마크 포인트 옵션을 선택하여 실험에 사용할 여러 필드로 표시합니다.
   참고: 현미경이 포인트 목록의 점에 다시 초점을 맞출 때마다 대체 점을 선택해야 합니다. 이것은 목록의 적절한 지점에 현미경을 집중한 다음 바꾸기 지점 단추를 선택하여 수행할 수 있습니다. 다시 초점을 맞출 때 아날로그 거친 / 미세 조정 노브를 만지지 않는 것이 중요합니다. 소프트웨어만 사용하여 초점을 조정합니다.
8. 먼저 설계/실행 실험 대화 상자에서 설계 및 타임랩스 탭을 선택하여 타임랩스 매개변수를 설정합니다. 타임랩스 확인란을 선택합니다. 타임랩스 이미지/총 시간 측면에서 적절한 타임랩스 매개변수를 입력합니다.
9. 먼저 디자인을 선택한 다음 디자인/실행 실험 대화 상자에서 포인트 탭을 선택하여 포인트 목록에서 이미지할 점을 설정합니다. 방문 점 목록 옵션을 선택하고 전체 시퀀스인 경우 쉼표 또는 하이픈으로 구분된 텍스트 상자에 이미지할 점을 입력합니다.
10. 실험을 시작하기 전에 디자인/실행 대화 상자의 실행 탭을 사용하여 파일 이름과 파일 위치를 편집합니다. 설정 단추를 선택하거나, 데이터 폴더를 선택한 다음, 적절한 폴더를 선택하거나 새 폴더를 만들어 파일 위치를 변경할 수 있습니다. 이미지 파일 이름 텍스트 상자에 새 파일 이름을 입력하여 파일 이름을 변경합니다.
11. 실험 시작 대화 상자에서 재생 버튼을 선택하여 실험을 시작합니다.
    참고: 타임랩의 경우 DIC 설정을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 각 시야에서 초점을 지속적으로 확인하고(불필요한 광표백을 방지하기 위해) 시간이 지남에 따라 세포가 초점이 떨어지는 경향이 있기 때문에 포인트 목록의 정보를 다시 초점을 맞추고 업데이트합니다.

4. 이미지 처리

1. 그림 생성을 위해 원하는 원시(R3D) 이미지 파일을 엽니다.
   참고: 최근에 저장된 파일은 이미징 소프트웨어의 시작 대화 상자의 데이터 폴더 단추를 사용하여 사용할 수 있습니다.
2. 데콘볼루션 프로그램을 실행하여 초점이 벗어난 형광 등^7,8을제거하여 데콘브이드 D3D 이미지 파일을 생성합니다. 시작 대화 상자에서 프로세스 탭을 선택한 다음 데톤볼브를선택합니다. 새 대화 상자가 나타납니다 .
   1. 적절한 이미지 번호(각 이미지 파일의 왼쪽 위 모서리에 있음)를 데톤볼루션 대화 상자의 입력으로 드래그하여 데톤볼루션 매개변수를 설정합니다. deconvolution 대화 상자에서 더 많은 옵션 단추를 선택하고 처리 확인란 후 자르기 테두리 롤오프를 선택 취소합니다(그렇지 않으면 해당 DIC 파일 위에 이미지를 중첩할 수 없음).
   2. deconvolution 대화 상자에서 수행 버튼을 클릭하여 원시 이미지 파일을 deconvolve합니다.
      참고: 원하는 결과를 위해 소프트웨어 제조업체의 지침 매뉴얼에 표시된 대로 데선 표시 매개 변수를 조정할 수 있습니다.
3. 필요한 경우 모든 파장(색상) 채널에서 수동 배경 잡음 빼기 및 밝기/대비 조정을 수행합니다. 이 작업을 수행하려면 디콘브해결 이미지 파일에서 대비 조정 버튼을 선택합니다.
4. 먼저 D3D 대화 상자 상단의 파일 옵션을 선택하여 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 그런 다음 TIFF로 저장을 선택하고 적절한 Z 스택(포커스 내에 있음)을 식별하고 선택하거나 원하는 필터 세트를 선택하거나 선택 취소합니다.
5. 제조업체에서 제공하는 소프트웨어 또는 ImageJ^5와같은 자유롭게 사용할 수 있는 프로그램을 사용하여 데이터 정량화를 수행합니다.
   1. 셀 크기 정량화의 경우 해당 D3D 이미지 파일의 도구 탭을 클릭한 다음 거리 측정 옵션을 선택합니다. 왼쪽 클릭을 통해 마우스를 사용하여 원하는 이미지 파일의 시작점과 끝점을 선택하여 거리를 측정합니다.
      참고: 셀 크기 정량화 중에 이미지를 확대하는 것이 가장 좋습니다.
   2. 형광 신호 정량화의 경우 해당 D3D 이미지 파일의 도구 탭 아래에 있는 데이터 검사기 옵션을 사용합니다.
      참고: 형광 신호 정량화를 완료할 때 이미지를 확대하고 관련 필터만 선택해야 합니다.
   3. 형광 신호를 정량화하려면 열/행 옵션이 특정 차원으로 설정된 상자를 그립니다. 정량화할 신호가 있는 영역을 선택하고 값을 기록합니다. 동일한 크기의 상자를 사용하여 셀 바로 바깥쪽영역을 선택하여 배경 신호를 측정합니다. 셀 내에서 수득된 형광 신호로부터 기록된 값에서 배경 값을 뺍니다.

결과

GpsB 표현형
이전에 우리는 Sa-GpsB가 세포 용해^9에서안티 센스 RNA 결과를 사용하여 GpsB의 고갈로 필수적인 단백질임을 보여주었습니다. 여기에서 우리는 이 문서에서 기술한 타임랩스 현미경 프로토콜을 사용하여 단백질 국소화에 있는 각종 세포 분열 표현형 그리고 변경의 출현이 어떻게 붙잡을 수 있었다는 것을 기술합니다. 이를 위해, S. 아우레우스 균주 R...

토론

현미경 검사법은 미생물 유기체에 관련된 연구 결과에 있는 주류를 남아 있습니다. 그들의 미크론 규모 세포 크기를 감안할 때, 단세포 수준 연구 결과는 전통적으로 전자 현미경 검사법 (EM)에 의존했습니다. EM은 최근 몇 년 동안 매우 강력한 기술이되었지만 제한된 사용자 액세스¹⁶외에도 고유의 고유한 제한 사항이 있습니다. 형광 현미경 기술의 개선과 FDAA^3와

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI	Invitrogen	D3571	Microscopy
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopy
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
IPTG	Fisher BioReagents	BP1755-10	Dioxane-free
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ inhibitor
SoftWorx	GE		Manufacturer-supplied imaging software