Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Riepilogo

Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Abstract

Le indagini sui fattori che influenzano la divisione cellulare e la forma cellulare nei batteri sono comunemente eseguite in combinazione con la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, poiché le osservazioni fatte a livello di popolazione potrebbero non riflettere realmente ciò che si verifica a livello di singola cellula. La microscopia a tempo variabile a cellule vive consente agli sperimentatori di monitorare i cambiamenti nella divisione cellulare o nella morfologia cellulare che forniscono preziose informazioni sulla localizzazione subcellulare delle proteine e sulla tempistica dell'espressione genica, come accade, per aiutare potenzialmente a rispondere a importanti domande biologiche. Qui, descriviamo il nostro protocollo per monitorare i cambiamenti fenotipici in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus utilizzando un microscopio di deconvoluzione ad alta risoluzione. L'obiettivo di questa relazione è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che può essere adottato da altri ricercatori interessati a condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza per studiare diversi processi biologici nei batteri e in altri organismi.

Introduzione

Il campo della biologia cellulare batterica è stato notevolmente migliorato dai recenti progressi nelle tecniche di microscopia^1,2. Tra gli altri strumenti, i microscopi in grado di condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza timelapse rimangono uno strumento prezioso. I ricercatori possono monitorare vari eventi fisiologici in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti come le proteine fluorescenti verdi (GFP) e le fusioni di reporter traslazionali, gli amminoacidi D-aminoacidi fluorescenti (FDAA)³o utilizzare altre macchie per etichettare la parete cellulare, la membrana e il DNA. Non sorprende quindi che la microscopia a fluorescenza rimanga popolare tra i biologi delle cellule microbiche. Oltre a mostrare semplicemente i fenotipi finali, fornire informazioni su come i fenotipi osservati nascono utilizzando la microscopia timelapse potrebbe aggiungere un valore significativo ai risultati e potenzialmente offrire indizi su quali processi cellulari sono presi di mira da potenziali candidati alla droga⁴.

I protocolli per condurre l'imaging ad alta risoluzione utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo completamente motorizzato, invertito e a campo largo (vedi tabella dei materiali)sono forniti in questo articolo. Questi protocolli potrebbero essere adattati alle esigenze di altri microscopi a fluorescenza in grado di condurre la microscopia timelapse. Anche se il software qui discusso corrisponde allo specifico software fornito dal produttore come indicato nella Tabella dei Materiali, il software comunemente fornito da altri produttori di microscopi o il Modello^{ImmagineJ 5}liberamente disponibile, dispone di strumenti equivalenti per l'analisi dei dati di microscopia. Per le condizioni in cui il timelapse non è favorevole, gli esperimenti di ciclo temporale potrebbero essere condotti come descritto in questo articolo. I protocolli qui descritti forniscono una guida dettagliata per studiare i cambiamenti fenotipici in due diverse specie batteriche: B. subtilis e S. aureus. Vedere la Tabella 1 per i ceppi utilizzati.

Protocollo

1. Condizioni generali di crescita

1. Inoculare 2 mL di mezzo di crescita appropriato integrato con antibiotici (dove richiesto) con una singola colonia del ceppo (s) da immaginare. Incubare queste colture di semi durante la notte a 22 gradi centigradi in un incubatore agitazione.
   NOTA: Le condizioni specifiche di crescita batterica utilizzate in questo articolo sono fornite nella sezione dei risultati rappresentativi.
2. Diluire le colture durante la notte 1:20 in supporti freschi in un flacone da 125 mL, integrare con antibiotici (dove richiesto).
3. Coltivare colture a 37 gradi centigradi in un'incubatrice tremante fino alla fase media del logaritmico (OD₆₀₀ - 0,5).
   NOTA: L'induttore o l'inibitore potrebbe essere aggiunto direttamente alle colture in crescita nella fase di crescita appropriata.
4. Raccogliere le cellule nelle condizioni di coltura desiderate per la preparazione del campione di microscopia, come descritto nella sezione seguente.

2. Preparazione del campione

1. Preparare l'1% di agarose combinando 0,25 g di grado di biologia molecolare, basso EEO, agarose con 25 mL di mezzo di crescita integrato con antibiotici appropriati (se necessario) per la microscopia timelapse o acqua sterile. Riscaldare il composto con l'aiuto di un forno a microonde per circa 30 s e versarlo in una sterile parabola Petri da 100 mm x 15 mm e lasciarla solidificare.
2. Prendete un 5-50 ll della coltura cellulare a seconda della necessità e macchiare le cellule. Cellule di colorazione appropriate in questa fase (ad esempio, aggiungere colorante fluorescente FM4-64 (macchia di membrana) per un esperimento (Figura 1)).
   1. Pipetta un 5 - L di campione di coltura o campione colorato da immagini sul fondo di un piatto di coltura del fondo di vetro 35 mm (con diametro del micropo di 14 mm e coverslip n. 1.5 non rivestito; vedere la Tabella dei materiali).
      AVVISO: Non utilizzare copricapi rivestiti poli-L-lisina soprattutto per la microscopia timelapse in quanto potrebbero indurre diversi modelli di crescita (abbiamo osservato questo anche con poli-D-lysina; dati non mostrati) e/o influenzare la dinamica delle proteine⁶.
   2. Per ridurre al minimo l'uso di coloranti, colorare le tinture da 3 a 4 once (raccolte a_{OD 600} - 0,5; circa 2,7 x 10⁷ e 3,4 x 10⁷ per B. subtilis e S. aureus rispettivamente per 1 mL di coltura) direttamente sul piatto inferiore in vetro.
   3. Posizionare una lastra di agarose pre-tagliata (11 mm di diametro o di qualsiasi dimensione desiderata per sovrapporre l'area del coperchio; tagliare utilizzando l'estremità aperta di un tubo sterile o di una lama di rasoio) sulla parte superiore del campione e toccare delicatamente per assicurarsi che la lastra di agarosa sia appoggiata contro il coperchio.
3. Dopo l'imaging (vedi sezione seguente), se il numero di cellule nel campo visivo non è auspicabile, regolare la densità cellulare del campione tramite diluizione o concentrazione mediante centrifugazione e modificare il rapporto delle cellule nel campione utilizzando il mezzo di crescita / buffer, se necessario.
   NOTA: per ridurre al minimo l'autofluorescenza proveniente dal mezzo di coltura, le cellule possono essere lavate nel buffer (ad esempio nella salina buffer di fosfato 1x standard) e risospese nella quantità appropriata di buffer prima dell'imaging. È possibile che in questa fase le cellule più piccole o vesciche non possono essere mantenute dopo la centrifugazione e quindi saranno perse.
4. Aggiungete l'acqua usando una pipetta (5 gocce di lgg.l) nello spazio all'interno del piatto di coltura (intorno al coperchio) per evitare che il pad agarose si secchi e per aiutare a mantenere l'umidità durante l'acquisizione dell'immagine, in particolare per gli esperimenti timelapse.
5. Lasciare che i piatti della coltura eclichino alla temperatura all'interno della camera di incubazione, un vano opaco incorporato fornito dal produttore, del microscopio per 15-20 min.
   NOTA: Accendere l'elemento riscaldante e impostare la camera di incubazione alla temperatura desiderata diverse ore prima dell'imaging. Ciò garantirà che l'hardware si stabilizzi alla nuova temperatura. Per l'imaging timelapse prolungato, posizionare un becher o un pallone con acqua all'interno della camera del microscopio, lontano dall'area di lavoro, per mantenere l'umidità.

3. Imaging

1. Il giorno dell'esperimento, accendere il sistema di microscopio. Avviare il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) facendo clic sull'icona appropriata sul desktop. Inizializzare il microscopio facendo clic sull'opzione Inizializza microscopio (pulsante raffigurato con un microscopio) nella finestra di dialogo di avvio del software. Assicurarsi che l'obiettivo sia completamente abbassato utilizzando la regolazione grossolana del microscopio prima dell'inizializzazione.
   NOTA: dopo l'inizializzazione dovrebbero essere visualizzate tre finestre di dialogo aggiuntive oltre al menu di avvio: resolve3D, raccolta dati e monitoraggio dei filtri.
2. Posizionare una goccia di 1,517 (indice di rifrazione) sull'obiettivo di immersione dell'olio 100x fornito dal produttore (Apertura numerica : 1,4, Distanza di lavoro : 0,12 mm; vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: È importante scegliere l'olio di immersione appropriato per la temperatura alla quale viene condotta l'imaging.
3. Caricare la teglia inferiore in vetro contenente il campione nell'alloggiamento metallico (bara) e far scorrere delicatamente nel morsetto del palco.
4. Utilizzare la manopola di regolazione grossolana per sollevare l'obiettivo fino a quando l'olio entra in contatto con il fondo di vetro del piatto. Utilizzare il pezzo dell'occhio e la manopola di regolazione fine per mettere a fuoco il campione. Una volta che le cellule sono a fuoco girare la manopola dal pezzo dell'occhio alla modalità fotocamera spostando l'interruttore selettore situato sulla parte anteriore del corpo del microscopio a sinistra.
5. Iniziare l'esperimento utilizzando il software di imaging. Nella finestra resolve3D, selezionare l'icona Progetta/esegui esperimento raffigurata da un pallone. Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo denominata design/run experiment.
   1. Impostare il numero di stack di z e lo spessore del campione utilizzando la scheda di progettazione e quindi sezionamento nella finestra di dialogo dell'esperimento di progettazione/esecuzione.
      NOTA: per gli esperimenti nella sezione dei risultati rappresentativi, sono stati utilizzati 17 stack di z a intervalli di 200 nm per immagini fisse e quattro stack a intervalli di 200 nm per la microscopia timelapse.
   2. Per misurare lo spessore delle celle nel campione, regolare manualmente il piano z in modo incrementale utilizzando le frecce su e giù nella finestra di dialogo resolve3D. Contrassegnare il punto in cui le celle non vengono a fuoco come limite superiore e inferiore per l'acquisizione dell'immagine. Importare queste informazioni prima di eseguire l'esperimento.
   3. Per ridurre al minimo la fototossicità e il fotobleaching durante l'imaging timelapse, ridurre il numero di stack di z e scegliere il piano intermedio delle celle per l'acquisizione dell'immagine.
6. Selezionare il set di filtri appropriato per l'esperimento utilizzando la scheda Progettazione, quindi canali nella finestra di dialogo Progetta/Esegui esperimento (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Inoltre, selezionare un riferimento per la raccolta di informazioni POL/DIC. Regolare la trasmissione percentuale (intensità luminosa) e la durata dell'esposizione per i singoli canali selezionati prima dell'imaging selezionando le opzioni appropriate nella finestra di dialogo resolve3D.
      NOTA: in un campo visivo di prova che non viene considerato per l'esperimento testa queste impostazioni per identificare se i parametri selezionati ottengono dati di fluorescenza significativi senza perdere il segnale debole o sovrasaturarlo. Quindi importare questi parametri per l'impostazione sperimentale.
7. Aprire l'elenco dei punti selezionando il pulsante Elenco punti nella finestra di dialogo resolve3D. Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo denominata elenco di punti. Contrassegnare diversi campi visivi da utilizzare nell'esperimento trovando campi di visualizzazione appropriati utilizzando i controlli della fase del microscopio e selezionando l'opzione del punto di contrassegno nella finestra di dialogo elenco punti.
   NOTA: Un punto di sostituzione dovrà essere selezionato ogni volta che il microscopio viene rifocalizzato su un punto nell'elenco dei punti. Questo può essere fatto concentrando il microscopio sul punto appropriato nell'elenco e quindi selezionando il pulsante del punto di sostituzione. È importante non toccare la manopola di regolazione analogica grossolana/fine durante la messa a fuoco; utilizzare solo il software per regolare la messa a fuoco.
8. Impostare i parametri timelapse selezionando prima il progetto e quindi la scheda timelapse nella finestra di dialogo di progettazione/esecuzione dell'esperimento. Selezionare la casella di controllo timelapse. Immettere i parametri timelapse appropriati in termini di immagini timelapse/tempo totale.
9. Impostare i punti da visualizzare dall'elenco dei punti selezionando prima il progetto e quindi la scheda Punti nella finestra di dialogo dell'esperimento di progettazione/esecuzione. Selezionare l'opzione dell'elenco dei punti di visita e immettere i punti da visualizzare nella casella di testo separati da virgole o trattini se si tratta di una sequenza completa.
10. Prima di iniziare un esperimento, modificare i nomi e i percorsi dei file utilizzando la scheda Esegui nella finestra di dialogo Progettazione/esecuzione. La posizione del file può essere modificata selezionando il pulsante delle impostazioni, selezionando la cartella dati e quindi selezionando la cartella appropriata o creandone una nuova. Modificare i nomi dei file immettendo il nuovo nome del file nella casella di testo Nome file immagine.
11. Inizia l'esperimento selezionando il pulsante di riproduzione nella finestra di dialogo Inizia esperimento.
    NOTA: per il timelapse, controllare continuamente lo stato attivo in ogni campo visivo durante l'esperimento utilizzando l'impostazione DIC (per evitare fotosblandi) e rifocalizzare e aggiornare le informazioni nell'elenco dei punti in quanto le celle tendono a perdere lo stato attivo nel tempo.

4. Elaborazione delle immagini

1. Aprire i file di immagine raw (R3D) desiderati per la generazione di figure.
   NOTA: i file salvati di recente possono essere individuati utilizzando il pulsante della cartella dati nella finestra di dialogo di avvio del software di imaging.
2. Eseguire il programma di deconvoluzione per rimuovere la luce di fluorescenza fuori fuoco^7,8, al fine di produrre un file di immagine D3D deconvolved. Selezionare la scheda Processo nella finestra di dialogo di avvio, quindi selezionare deconvolve. Verrà visualizzata una nuova finestra di dialogo denominata deconvolve.
   1. Impostare i parametri di deconvoluzione trascinando il numero di immagine appropriato (situato nell'angolo superiore sinistro di ogni file di immagine) all'input nella finestra di dialogo di deconvoluzione. Nella finestra di dialogo di deconvoluzione, selezionare il pulsante Altre opzioni e deselezionare la casella di controllo di rolloff del bordo del ritaglio dopo l'elaborazione (altrimenti le immagini non possono essere sovrapposte al file DIC corrispondente).
   2. Fare clic sul pulsante Fai clic nella finestra di dialogo di deconvoluzione per deconvolve file di immagine raw.
      NOTA: i parametri di deconvoluzione potrebbero essere regolati come indicato dal manuale di orientamento del produttore del software per i risultati desiderati.
3. Se necessario, eseguite la sottrazione manuale del disturbo di fondo e la regolazione luminosità/contrasto in uno o tutti i canali di lunghezza d'onda (colore). A tale scopo, selezionare il pulsante di regolazione del contrasto nel file di immagine deconvolved.
4. Salvare l'immagine come file TIFF selezionando prima l'opzione del file nella parte superiore della finestra di dialogo D3D. Quindi selezionare Salva come TIFF, identificare e selezionare gli stack di z appropriati (che sono allo stato attivo), selezionare o deselezionare i set di filtri desiderati.
5. Eseguire la quantificazione dei dati utilizzando qualsiasi software fornito dal produttore o programmi liberamente disponibili come ImageJ⁵.
   1. Per la quantificazione delle dimensioni delle celle, fare clic sulla scheda degli strumenti nel file di immagine D3D appropriato, quindi selezionare l'opzione delle distanze di misurazione. Misurare le distanze selezionando i punti iniziale e finale sul file di immagine desiderato utilizzando il mouse con i clic con i pulsanti sinistro del mouse.
      NOTA: È consigliabile ingrandire l'immagine durante la quantificazione delle dimensioni delle celle.
   2. Per la quantificazione del segnale di fluorescenza utilizzare l'opzione Data Inspector nella scheda utensile del file di immagine D3D appropriato.
      NOTA: È meglio ingrandire l'immagine e selezionare solo i filtri pertinenti al completamento della quantificazione del segnale di fluorescenza.
   3. Per quantificare il segnale di fluorescenza, disegnare una casella con l'opzione colonna/riga impostata su una dimensione specifica. Selezionare un'area con segnale da quantificare e registrare il valore. Misurare il segnale di sfondo utilizzando la stessa casella di dimensioni per selezionare un'area immediatamente al di fuori delle celle. Sottrarre il valore di sfondo dal valore registrato dal segnale di fluorescenza ottenuto all'interno della cella.

Risultati

Fenotipi GpsB
In precedenza abbiamo dimostrato che Sa-GpsB è una proteina essenziale come esaurimento di GpsB utilizzando un RNA antisenso risultati in lisi cellulare⁹. Qui descriviamo come l'emergere di vari fenotipi della divisione cellulare e i cambiamenti nella localizzazione delle proteine potrebbero essere catturati utilizzando il protocollo di microscopia timelapse descritto in questo articolo. A questo scopo, S. aureus sforza RB143 [SH1000 che ospita pEPSA5 (v...

Discussione

La microscopia è rimasta un pilastro negli studi relativi agli organismi microbici. Data la loro dimensione cellulare su scala micron, gli studi a livello di cellula singola si sono tradizionalmente basati sulla microscopia elettronica (EM). Sebbene EM sia diventata una tecnica piuttosto potente negli ultimi anni, ha i suoi limiti intrinseci oltre al limitato accesso degli utenti¹⁶. I miglioramenti nelle tecniche di microscopia a fluorescenza e lo sviluppo di diverse sonde fluorescenti, come FDAA...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI	Invitrogen	D3571	Microscopy
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopy
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
IPTG	Fisher BioReagents	BP1755-10	Dioxane-free
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ inhibitor
SoftWorx	GE		Manufacturer-supplied imaging software