細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

要約

この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。

要約

細菌の細胞分裂および細胞形状に影響を与える因子の調査は、集団レベルで行われた観察が単一細胞レベルで起こることを本当に反映していない可能性があるため、一般的に高分解能蛍光顕微鏡と組み合わせて行われる。生細胞タイムラプス顕微鏡検査により、研究者は細胞分裂または細胞形態の変化を監視することができ、タンパク質の細胞内局在化や遺伝子発現のタイミングに関する貴重な洞察を提供し、重要な生物学的質問に答えるのに役立つ可能性があります。ここでは、高分解能デコンボリューション顕微鏡を用いて、バチルス・サチリスと黄色ブドウ球菌の表現型変化をモニタリングするプロトコルについて説明する。本報告書の目的は、細菌や他の生物の異なる生物学的過程を研究するために蛍光顕微鏡実験を行うことに興味を持つ他の研究者が採用できる、シンプルで明確なプロトコルを提供することである。

概要

細菌細胞生物学の分野は、顕微鏡^技術1、2の最近の進歩によって有意に増強された。他の器械の間で、タイムラプス蛍光顕微鏡実験を行うことができる顕微鏡は貴重な用具のままである。研究者は、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの転写および翻訳レポーター融合、蛍光D-アミノ酸(FDAA)3、または細胞壁、膜およびDNAを標識するための他の染色を使用して、蛍光タンパク質を使用してリアルタイムで様々な生理学的事象を監視することができます。したがって、微生物細胞生物学者の間で蛍光顕微鏡が依然として普及しているのは驚くべきことではない。単に末端表現型を示すことに加えて、タイムラプス顕微鏡を用いて観察された表現型がどのように生じるかについての情報を提供することは、所見に大きな価値を加え、潜在的な薬物候補によって標的とされている細胞プロセスに関する手がかりを提供する可能性^がある4.

この記事では、完全に電動、反転、広視野蛍光顕微鏡(材料表参照)を用いて高解像度イメージングを行うプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、タイムラプス顕微鏡を行うことができる他の蛍光顕微鏡のニーズに合わせて適合させることができる。ここで説明するソフトウェアは、材料の表に示されている特定の製造元が提供するソフトウェアに対応していますが、他の顕微鏡メーカーまたは自由に入手可能な ImageJ⁵によって一般的に提供されるソフトウェアには、顕微鏡データを分析するための同等のツールがあります。タイムラプスが役に立たない場合は、この記事の説明に従って、タイムコース実験を行うことができる。ここで説明するプロトコルは、2つの異なる細菌種の表現型変化を研究するための詳細なガイドを提供する:B.サチリスとS.アウレウス。使用するひずみについては、表 1 を参照してください。

プロトコル

1. 一般的な成長条件

1. 画像化する株の単一コロニーを用いた抗生物質(必要な場合)を補充した適切な成長培地の2mLを接種する。これらの種子培養物を振とうインキュベーターで22°Cで一晩インキュベートする。
   注: この記事で使用する特定の細菌増殖条件は、代表的な結果セクションに記載されています。
2. 125 mLフラスコで新鮮なメディアで一晩培養1:20を希釈し、抗生物質を補う(必要な場合)。
3. 中対数期(OD₆₀₀ = 0.5)まで振とうインキュベーターで37°Cで培養を成長させます。
   注:誘導剤または阻害剤は、適切な増殖段階で成長培養物に直接添加することができる。
4. 以下のセクションで説明するように、顕微鏡試料調製のための所望の培養条件で細胞を採取する。

2. サンプル調製

1. 0.25 gの分子生物学グレード、低EEO、アガロース、タイムラプス顕微鏡検査または滅菌水に適切な抗生物質(必要な場合)を補充した25mLの成長培地を組み合わせて1%アガロースを調製します。約30sの電子レンジの助けを借りて混合物を加熱し、滅菌100ミリメートルx15ミリメートルペトリ皿にそれを注ぎ、それを固ませます。
2. 必要に応じて細胞培養物の5~50μLのアリコートを服用し、細胞を染色します。この段階で適切な染料で細胞を染色する(例えば、実験のために蛍光色素FM4-64(膜染色)を加える(図1))。
   1. ピペットは、35ミリメートルのガラス底培養皿の底部に画像化される培養サンプルまたは染色されたサンプルの5μLアリコート(14ミリメートルのマイクロウェル直径と未コーティングNo.5カバースリップ;材料の表を参照)。
      注意:彼らは異なる成長パターンを誘発することができるので、特にタイムラプス顕微鏡のためにポリ-L-リジンコーティングされたカバーリップを使用しないでください(我々は同様にポリD-リジンでこれを観察しました;データは示されていません)および/またはタンパク質^{ダイナミクス6}に影響を与えます。
   2. 染料の使用を最小限に抑えるために、ステンド3~4μL細胞懸濁液(OD_600=0.5で収穫;B.サチリスおよびS.aureusの場合はそれぞれ約2.7 x 107および3.4 x 10⁷⁾をガラス底皿に直接取り付けます。
   3. サンプルの上に、プレカットアガローススラブ(直径11mmまたは任意のサイズの)を取り付け、滅菌チューブまたはカミソリブレードの開いた端を使用してカットし、アガローススラブがカバースリップに対して平らに横たわっていることを確認するためにゆっくりとタップします。
3. イメージングの後(次のセクションを参照)、視野内の細胞数が望ましくない場合は、遠心分離によって希釈または濃度を介してサンプルの細胞密度を調整し、必要に応じて増殖培地/バッファーを使用してサンプル内の細胞の比率を変更する。
   注:培養培地からの自己蛍光を最小限に抑えるために、細胞を緩衝液(例えば標準的な1xリン酸緩衝生理食塩分)で洗浄し、イメージング前に適切な量の緩衝液に再懸濁することができる。このステップでは、遠心分離後に小さな細胞や小胞が保持されず、失われる可能性があります。
4. ピペット(約5μL滴)を使用して、アガロースパッドが乾燥するのを防ぎ、特にタイムラプス実験のために、画像取得の過程で湿度を維持するために、培養皿の中のスペース(カバースリップの周り)に水を追加します。
5. 培養料理は、15〜20分間顕微鏡のインキュベーション室内の温度に平衡化することを可能にします。
   メモ:発熱体の電源を入れ、インキュベーションチャンバをイメージングの数時間前に所望の温度に設定します。これにより、ハードウェアが新しい温度に安定します。長時間のタイムラプスイメージングを行うには、ビーカーまたはフラスコを顕微鏡室内に入れ、作業領域から離して湿度を維持します。

3. イメージング

1. 実験当日は、顕微鏡システムをオンにします。デスクトップ上の適切なアイコンをクリックして、イメージング ソフトウェアを起動します(「マテリアルの表」を参照)。ソフトウェアの起動ダイアログ ボックスで[顕微鏡を初期化]オプション(顕微鏡で示されたボタン)をクリックして、顕微鏡を初期化します。初期化前に顕微鏡粗い調整を使用して、目的が完全に下がっていることを確認します。
   注 : 初期化後、スタート メニューに加えて、resolve3D、データ収集、およびフィルタ モニタの 3 つのダイアログ ボックスが表示されます。
2. メーカーが提供する100xオイル浸漬目的に1.517(屈折率)オイルを1.517(屈折率)の滴を置きます(数値絞り = 1.4、作動距離= 0.12 mm;材料表を参照)。
   メモ:イメージングを行う温度に適した浸漬油を選択することが重要です。
3. サンプルを含むガラス底皿を金属製ハウジング(棺)に積み込み、ステージクランプにそっと滑り込みます。
4. 粗い調整ノブを使用して、油が皿のガラス底に接触するまで目的を上げます。目のピースと微調整ノブを使用して、サンプルを焦点にします。細胞が焦点を合わせると、顕微鏡本体の前面にあるセレクタースイッチを左に動かして、ノブをアイピースからカメラモードに変えます。
5. イメージングソフトウェアを使用して実験を開始します。resolve3Dウィンドウで、フラスコで表される[設計/実行]実験アイコンを選択します。新しいダイアログ ボックスが表示されます。
   1. [設計/実行実験]ダイアログ ボックスの[設計]タブと[断面]タブを使用して、Z スタックとサンプルの厚さの数を設定します。
      注:代表的な結果セクションの実験では、静止画像の場合は200nm間隔で17個のZスタック、タイムラプス顕微鏡検査には200nm間隔で4つのZスタックが使用されました。
   2. サンプル内のセルの厚さを測定するには、resolve3Dダイアログ ボックスの上矢印と下向き矢印を使用して、Z 平面を手動で増分調整します。セルがフォーカスを外す場所を、イメージ取得の上限と下限としてマークします。実験を実行する前に、この情報をインポートします。
   3. タイムラプスイメージング中の光毒性と光白化を最小限に抑えるには、Zスタックの数を減らし、画像取得用の細胞の中面を選択します。
6. [設計/実行実験] ダイアログ ボックス (TRITC: EX 542/27;EM 597/45;FITC/GFP: EX 475/28;EM 525/48;mCherry: EX 575/25;EM 632/60;サイ: EX 632/22;EM 676/34)。
   1. また、POL/DIC 情報の収集の参照を選択します。resolve3Dダイアログボックスで適切なオプションを選択して、イメージング前に選択した個々のチャンネルの透過率(光強度)と露出時間を調整します。
      注:実験テストでは考慮されないテストフィールドでは、選択したパラメータが弱い信号を欠いたり、過剰に飽和することなく、意味のある蛍光データを取得するかどうかを識別するために、これらの設定をテストします。次に、実験用のこれらのパラメータをインポートします。
7. resolve3Dダイアログ ボックスの[ポイント リスト]ボタンを選択して、ポイント リストを開きます。新しいダイアログ ボックスが [ポイント リスト]に表示されます。顕微鏡ステージコントロールを使用して適切な視野を見つけ、ポイントリストダイアログボックスでマークポイントオプションを選択して、実験で使用する複数の視野をマークします。
   注: 顕微鏡がポイント リスト内の点に再焦点を合わせるたびに、置換点を選択する必要があります。これは、リスト内の適切なポイントに顕微鏡を焦点を合わせ、ポイントの置換ボタンを選択することで行うことができます。再焦点を合わせるときにアナログ粗い/微調整ノブに触れないようにすることが重要です。フォーカスを調整するには、ソフトウェアのみを使用してください。
8. タイムラプスパラメータを設定するには、まず設計を選択し、次に[設計/実行]の[実験]ダイアログ ボックスの[タイムラプス]タブを選択します。[タイムラプス] チェック ボックスをオンにします。タイムラプス画像/合計時間の観点から適切なタイムラプスパラメータを入力します。
9. 最初にデザインを選択し、次に[設計/実行実験]ダイアログ ボックスの[ポイント]タブを選択して、ポイント リストからイメージするポイントを設定します。[訪問ポイント] リスト オプションを選択し、完全なシーケンスの場合は、カンマまたはハイフンで区切ってテキスト ボックスにイメージするポイントを入力します。
10. 実験を開始する前に、[デザイン/実行] ダイアログ ボックスの[実行]タブを使用してファイル名とファイルの場所を編集します。ファイルの場所を変更するには、設定ボタンを選択してデータ フォルダを選択し、適切なフォルダを選択するか、新しいフォルダを作成します。イメージ ファイル名テキスト ボックスに新しいファイル名を入力して、ファイル名を変更します。
11. 実験の開始ダイアログ ボックスで再生ボタンを選択して、実験を開始します。
    注:タイムラプスの場合は、DIC設定を使用して実験全体の各視野にフォーカスを継続的にチェックし(不要な光漂白を避けるため)、細胞が時間の経過と一度に焦点を合わせなくなりがちなため、ポイントリストの情報を再フォーカスして更新します。

4. 画像処理

1. 図を生成するために、目的の生 (R3D) イメージ ファイルを開きます。
   注: 最近保存したファイルは、イメージング ソフトウェアの起動ダイアログ ボックスの [データ フォルダ] ボタンを使用して見つけることができます。
2. デコンボリューションプログラムを実行し、焦点の合っていない蛍光^光7、8を除去し、デコンボレードD3D画像ファイルを生成します。[スタートアップ] ダイアログ ボックスの[プロセス]タブを選択し、[deconvolve]を選択します。新しいダイアログ ボックスが表示されます。
   1. 適切なイメージ番号(各イメージ ファイルの左上隅にある)を[デコンボリューション]ダイアログ ボックスの入力にドラッグして、デコンボリューション パラメータを設定します。[デコンボリューション]ダイアログ ボックスで、[その他のオプション]ボタンを選択し、[処理後にトリミング枠のロールオフ]チェック ボックスをオフにします(それ以外の場合は、対応する DIC ファイルの上にイメージを重ね合わせることはできません)。
   2. [デコンボリューション] ダイアログ ボックスの[do it]ボタンをクリックして、生のイメージ ファイルをデコンボイします。
      注:デコンボリューションパラメータは、ソフトウェアの製造元のガイダンスマニュアルで示されているように調整して、目的の結果を得ることができます。
3. 必要に応じて、一部またはすべての波長(カラー)チャンネルで手動のバックグラウンドノイズ減算と明るさ/コントラスト調整を行います。これを行うには、デコンボリュートされたイメージ ファイルのコントラスト調整ボタンを選択します。
4. D3Dダイアログ ボックスの上部にあるファイルオプションを選択して、イメージを TIFF ファイルとして保存します。次に、[TIFF として保存] を選択し、適切な Z スタック(フォーカス内)を識別して選択し、目的のフィルタ セットを選択または選択解除します。
5. 製造元が提供するソフトウェアまたは ImageJ⁵などの自由に利用可能なプログラムを使用してデータ定量化を実行します。
   1. セル サイズの定量化については、適切な D3D イメージ ファイルのツールタブをクリックし、[距離の計測]オプションを選択します。マウスを左クリックして、目的の画像ファイルの始点と終点を選択して距離を計測します。
      注: セル サイズの定量化中に画像を拡大することをお勧めします。
   2. 蛍光信号定量の場合は、適切な D3D 画像ファイルのツールタブの下にあるデータインスペクターオプションを使用します。
      注:画像を拡大し、蛍光信号の定量を完了するときに関連するフィルタのみを選択することをお勧めします。
   3. 蛍光信号を定量化するには、列/行オプションが特定の次元に設定されたボックスを描画します。信号を定量化する領域を選択し、値を記録します。同じサイズのボックスを使用して背景信号を測定し、セルのすぐ外側の領域を選択します。細胞内で得られた蛍光シグナルから記録された値から背景値を差し引きます。

結果

GpsB表現型
以前は、Sa-GpsBはアンチセンスRNAを使用したGpsBの枯渇として必須タンパク質であり、細胞^溶解9をもたらすことが示されています。ここでは、この記事で説明するタイムラプス顕微鏡プロトコルを用いて、様々な細胞分裂表現型の出現とタンパク質の局在化の変化をどのように捉えることができるかについて説明する。この目的のために、S.アウレ...

ディスカッション

顕微鏡検査は、微生物に関する研究において主力であり続けています。ミクロンスケールの細胞サイズを考えると、単細胞レベルの研究は従来、電子顕微鏡(EM)に依存してきました。EMは近年非常に強力な技術となっていますが、限られたユーザー^{アクセス16}に加えて、独自の本質的な制限があります。蛍光顕微鏡技術の改良とFDAA³のような異なる蛍光プロー...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI	Invitrogen	D3571	Microscopy
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopy
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
IPTG	Fisher BioReagents	BP1755-10	Dioxane-free
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ inhibitor
SoftWorx	GE		Manufacturer-supplied imaging software