Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.

Zusammenfassung

Untersuchungen von Faktoren, die die Zellteilung und die Zellform von Bakterien beeinflussen, werden häufig in Verbindung mit einer hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, da Beobachtungen auf Populationsebene möglicherweise nicht wirklich widerspiegeln, was auf einer einzelnen Zellebene geschieht. Die Zeitraffermikroskopie mit Live-Zellen ermöglicht es den Forschern, die Veränderungen in der Zellteilung oder Zellmorphologie zu überwachen, die wertvolle Erkenntnisse über die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen und den Zeitpunkt der Genexpression liefern, um möglicherweise bei der Beantwortung wichtiger biologischer Fragen zu helfen. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Überwachung phänotypischer Veränderungen bei Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus mit einem hochauflösenden Dekonvolutionmikroskop. Ziel dieses Berichts ist es, ein einfaches und klares Protokoll zu erstellen, das von anderen Forschern angenommen werden kann, die an der Durchführung von Fluoreszenzmikroskopieexperimenten interessiert sind, um verschiedene biologische Prozesse bei Bakterien und anderen Organismen zu untersuchen.

Einleitung

Der Bereich der bakteriellen Zellbiologie wurde durch die jüngsten Fortschritte in den Mikroskopietechniken^1,2deutlich verbessert. Unter anderem sind Mikroskope, die in der Lage sind, Zeitrafferfluoreszenzmikroskopieexperimente durchzuführen, ein wertvolles Werkzeug. Die Forscher können verschiedene physiologische Ereignisse in Echtzeit mit fluoreszierenden Proteinen wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP) basierende Transkriptions- und Translationalreporterfusionen, fluoreszierende D-Aminosäuren (FDAA)³überwachen oder andere Flecken zur Kennzeichnung der Zellwand, Membran und DNA verwenden. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Fluoreszenzmikroskopie bei mikrobiellen Zellbiologen nach wie vor beliebt ist. Neben der einfachen Darstellung der Endphänotypen könnte die Bereitstellung von Informationen darüber, wie die beobachteten Phänotypen mittels Zeitraffermikroskopie entstehen, den Befunden einen signifikanten Mehrwert verleihen und potenziell Hinweise darauf liefern, welche zellulären Prozesse von potenziellen Wirkstoffkandidaten ins Visier genommen werden⁴.

Die Protokolle zur Durchführung hochauflösender Bildgebung mit einem vollmotorisierten, invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle)finden Sie in diesem Artikel. Diese Protokolle könnten an die Anforderungen anderer Fluoreszenzmikroskope angepasst werden, die in der Lage sind, Zeitraffermikroskopie durchzuführen. Obwohl die hier diskutierte Software der spezifischen vom Hersteller gelieferten Software entspricht, wie in der Tabelle der Materialienangegeben, verfügen Software, die üblicherweise von anderen Mikroskopherstellern geliefert wird, oder das frei verfügbare ImageJ⁵über gleichwertige Werkzeuge zur Analyse von Mikroskopiedaten. Für Bedingungen, bei denen Zeitraffer nicht förderlich ist, könnten Zeit-Kurs-Experimente durchgeführt werden, wie in diesem Artikel beschrieben. Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen detaillierten Leitfaden zur Untersuchung der phänotypischen Veränderungen bei zwei verschiedenen Bakterienarten: B. subtilis und S. aureus. Siehe Tabelle 1 für verwendete Stämme.

Protokoll

1. Allgemeine Wachstumsbedingungen

1. Impfen 2 ml des geeigneten Wachstumsmediums mit Antibiotika (falls erforderlich) mit einer einzigen Kolonie der Stämme abgebildet werden. Inkubieren Sie diese Samenkulturen über Nacht bei 22 °C in einem Schüttelbrutzentrum.
   HINWEIS: Die in diesem Artikel verwendeten spezifischen bakteriellen Wachstumsbedingungen finden Sie unter dem Abschnitt repräsentative Ergebnisse.
2. Verdünnen Sie die Nachtkulturen 1:20 in frischen Medien in einem 125 ml Kolben, ergänzen Sie sie mit Antibiotika (falls erforderlich).
3. Kultur(en) bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bis zur mittelogarithmischen Phase (OD₆₀₀ = 0,5) wachsen.
   HINWEIS: Induktoren oder Inhibitoren könnten in der entsprechenden Wachstumsphase direkt zur Wachstumskultur(n) hinzugefügt werden.
4. Erntezellen unter gewünschten Kulturbedingungen für die Mikroskopieprobenvorbereitung, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.

2. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie 1% Agarose vor, indem Sie 0,25 g molekularbiologische Qualität, niedrige EEO, Agarose mit entweder 25 ml Wachstumsmedium mit geeigneten Antibiotika (falls erforderlich) für Zeitraffermikroskopie oder steriles Wasser ergänzt kombinieren. Erhitzen Sie die Mischung mit Hilfe einer Mikrowelle für ca. 30 s und gießen Sie sie in eine sterile 100 mm x 15 mm Petrischale und lassen Sie sie erstarren.
2. Nehmen Sie je nach Bedarf ein Aliquot der Zellkultur von 5–50 L und färben Sie sie. Flecken Zellen mit geeigneten Farbstoffen in diesem Stadium (z. B. fluoreszierender Farbstoff FM4-64 (Membranfleck) für ein Experiment hinzufügen(Abbildung 1)).
   1. Pipette eine 5 l Aliquot der Kulturprobe oder gebeizt Probe auf den Boden einer 35 mm Glasbodenkulturschale abgebildet werden (mit 14 mm Mikrobrunnendurchmesser und unbeschichteten Nr. 1.5 Coverslip; siehe Tabelle der Materialien).
      VORSICHT: Verwenden Sie nicht poly-L-Lysin beschichtete Abdeckungen, insbesondere für die Zeitraffermikroskopie, da sie unterschiedliche Wachstumsmuster induzieren könnten (wir haben dies auch bei Poly-D-Lysin beobachtet; Daten nicht gezeigt) und/oder die Proteindynamik beeinflussen⁶.
   2. Um die Verwendung von Farbstoffen zu minimieren, färben Sie die Zellsuspension 3–4 l (geerntet bei OD₆₀₀ = 0,5; ca. 2,7 x 10⁷ und 3,4 x 10⁷ für B. subtilis bzw. S. aureus pro 1 ml Kultur) direkt auf der Glasbodenschale.
   3. Legen Sie eine vorgeschnittene Agaroseplatte (11 mm Durchmesser oder beliebige reine Größe) auf die Oberseite der Probe, um den Bereich des Deckels zu überlappen; mit dem offenen Ende eines sterilen Rohres oder einer Rasierklinge schneiden) und tippen Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Agaroseplatte flach gegen den Deckelschlupf liegt.
3. Wenn die Anzahl der Zellen im Sichtfeld nach der Bildgebung (siehe folgenden Abschnitt) nicht wünschenswert ist, passen Sie die Zelldichte der Probe durch Verdünnung oder Konzentration durch Zentrifugation an und ändern Sie das Verhältnis der Zellen in der Probe mit dem Wachstumsmedium/Puffer bei Bedarf.
   ANMERKUNG: Um die vom Kulturmedium ausgehtde Autofluoreszenz zu minimieren, können Zellen im Puffer gewaschen (z. B. in standard1x Phosphatpuffer-Saline) und vor der Bildgebung in angemessener Puffermenge resuspendiert werden. Es ist möglich, dass in diesem Schritt kleinere Zellen oder Vesikel nach der Zentrifugation nicht zurückgehalten werden und somit verloren gehen.
4. Fügen Sie Wasser mit einer Pipette (5 L Tropfen) in den Raum innerhalb der Kulturschale (um den Deckel) hinzu, um das Trocknen des Agarose-Pads zu verhindern und um die Feuchtigkeit während der Bildaufnahme, insbesondere bei Zeitrafferexperimenten, aufrechtzuerhalten.
5. Lassen Sie Kulturgerichte auf die Temperatur in der Inkubationskammer ausdemadien, einem vom Hersteller bereitgestellten eingebauten opaken Fach des Mikroskops für 15–20 min.
   HINWEIS: Schalten Sie das Heizelement ein und stellen Sie die Inkubationskammer einige Stunden vor der Bildgebung auf eine gewünschte Temperatur ein. Dadurch wird sichergestellt, dass sich die Hardware auf die neue Temperatur stabilisiert. Für eine längere Zeitraffer-Bildgebung legen Sie einen Becher oder Kolben mit Wasser in die Mikroskopkammer, weg vom Arbeitsbereich, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.

3. Imaging

1. Schalten Sie am Tag des Experiments das Mikroskopsystem ein. Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien), indem Sie auf das entsprechende Symbol auf dem Desktop klicken. Initialisieren Sie das Mikroskop, indem Sie im Startdialogfeld der Software auf die Option Mikroskop initialisieren (Mit einem Mikroskop dargestellt) klicken. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv mit der Grobeinstellung des Mikroskops vor der Initialisierung vollständig abgesenkt wird.
   HINWEIS: Nach der Initialisierung sollten zusätzlich zum Startmenü drei zusätzliche Dialogfelder angezeigt werden: resolve3D, Datenerfassung und Filtermonitor.
2. Legen Sie einen Tropfen von 1,517 (Refractive Index) Öl auf das 100x Öl Immersion Objektiv vom Hersteller geliefert (Numerische Blende = 1,4, Arbeitsabstand = 0,12 mm; siehe Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Es ist wichtig, das geeignete Tauchöl für die Temperatur zu wählen, bei der die Bildgebung durchgeführt wird.
3. Die Glasbodenschale mit Probe in das Metallgehäuse (Sarg) legen und vorsichtig in die Bühnenklemme schieben.
4. Verwenden Sie den groben Verstellknopf, um das Ziel zu erhöhen, bis das Öl mit dem Glasboden der Schale in Kontakt tritt. Verwenden Sie das Augenstück und den Feinverstellknopf, um die Probe in den Fokus zu rücken. Sobald die Zellen im Fokus sind, drehen Sie den Knopf vom Augenstück in den Kameramodus, indem Sie den Auswahlschalter auf der Vorderseite des Mikroskopkörpers nach links bewegen.
5. Beginnen Sie mit dem Experimentieren mit der Imaging-Software. Wählen Sie im resolve3D-Fenster das Design-/Ausführungsexperimentsymbol aus, das von einem Kolben dargestellt wird. Ein neues Dialogfeld mit dem Titel design/run experiment.
   1. Legen Sie die Anzahl der Z-Stacks und die Probendicke mithilfe des Entwurfs fest und schneiden Sie dann die Registerkarte im Dialogfeld Entwurf/Ausführung von Experimenten ab.
      HINWEIS: Für die Experimente im repräsentativen Ergebnisbereich wurden 17 Z-Stacks im 200-nm-Intervall für Standbilder und vier Z-Stacks im Abstand von 200 nm für die Zeitraffermikroskopie verwendet.
   2. Um die Dicke der Zellen in der Probe zu messen, passen Sie die Z-Ebene manuell inkrementell an, indem Sie die Auf- und Abwärtspfeile im Dialogfeld resolve3D verwenden. Markieren Sie, wo die Zellen a-focus als obere und untere Grenze für die Bildaufnahme gehen. Importieren Sie diese Informationen, bevor Sie das Experiment ausführen.
   3. Um Phototoxizität und Photobleichungen während der Zeitraffer-Bildgebung zu minimieren, reduzieren Sie die Anzahl der Z-Stacks und wählen Sie die Mittelebene der Zellen für die Bildaufnahme.
6. Wählen Sie den entsprechenden Filtersatz für das Experiment mithilfe des Entwurfs und dann der Registerkarte Kanäle im Dialogfeld Design/Ausführen von Experimenten aus (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
   1. Wählen Sie außerdem eine Referenz für die Erfassung von POL/DIC-Informationen aus. Passen Sie die prozentuale Übertragung (Lichtintensität) und die Dauer der Belichtung für einzelne Kanäle an, die vor der Bildgebung ausgewählt wurden, indem Sie die entsprechenden Optionen im Dialogfeld resolve3D auswählen.
      HINWEIS: In einem Testfeld, das für den Versuchstest nicht berücksichtigt wird, können diese Einstellungen ermitteln, ob die ausgewählten Parameter aussagekräftige Fluoreszenzdaten erhalten, ohne ein schwaches Signal zu verpassen oder zu übersät. Importieren Sie dann diese Parameter für die Versuchseinrichtung.
7. Öffnen Sie die Punkteliste, indem Sie im Dialogfeld resolve3D die Schaltfläche Punkteliste auswählen. Ein neues Dialogfeld mit dem Titel Punkteliste. Markieren Sie mehrere Sichtfelder, die im Experiment verwendet werden sollen, indem Sie mithilfe der Mikroskopstufensteuerung geeignete Sichtfelder finden und die Markierungspunktoption im Dialogfeld Punkteliste auswählen.
   HINWEIS: Ein Austauschpunkt muss jedes Mal ausgewählt werden, wenn das Mikroskop auf einen Punkt in der Punkteliste neu fokussiert wird. Dies kann geschehen, indem Sie das Mikroskop auf den entsprechenden Punkt in der Liste fokussieren und dann die Schaltfläche "Punkt ersetzen" auswählen. Es ist wichtig, den analogen groben/feinen Einstellknopf beim Umfokussieren nicht zu berühren; verwenden Sie nur die Software, um den Fokus anzupassen.
8. Legen Sie Zeitrafferparameter fest, indem Sie zuerst die Entwurfs- und dann die Registerkarte Zeitraffer im Dialogfeld Design/Ausführen von Experimenten auswählen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitraffer. Geben Sie die entsprechenden Zeitrafferparameter in Bezug auf Zeitrafferbilder/Gesamtzeit ein.
9. Legen Sie Punkte fest, die aus der Punkteliste abgebildet werden sollen, indem Sie zuerst das Design auswählen und dann die Registerkarte "Punkte" im Dialogfeld Design/Ausführen von Experimenten. Wählen Sie die Option "Listenpunkte" aus, und geben Sie Punkte ein, die in das textfeld getrennt durch Kommas oder Bindestriche abgebildet werden sollen, wenn es sich um eine vollständige Sequenz handelt.
10. Bearbeiten Sie vor Beginn eines Experiments Dateinamen und Dateispeicherorte mithilfe der Registerkarte Ausführen im Dialogfeld Entwurf/Ausführung. Der Speicherort der Datei kann geändert werden, indem Sie die Schaltfläche "Einstellungen" auswählen, den Datenordner auswählen und dann den entsprechenden Ordner auswählen oder einen neuen Ordner erstellen. Ändern Sie Dateinamen, indem Sie den neuen Dateinamen in das Textfeld Bilddateiname eingeben.
11. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die Wiedergabeschaltfläche im Dialogfeld "Experiment beginnen" auswählen.
    HINWEIS: Überprüfen Sie für Zeitraffer kontinuierlich den Fokus auf jedes Sichtfeld während des Gesamten DesExperiments mithilfe der DIC-Einstellung (um unnötiges Photobleichen zu vermeiden) und die Informationen in der Punkteliste neu zu fokussieren und zu aktualisieren, da Zellen im Laufe der Zeit tendenziell aus dem Fokus geraten.

4. Bildverarbeitung

1. Öffnen Sie die gewünschten Raw-Bilddateien (R3D) für die Generierung von Figuren.
   HINWEIS: Kürzlich gespeicherte Dateien können über die Schaltfläche Datenordner im Startdialogfeld der Imaging-Software gefunden werden.
2. Führen Sie das Dekonvolution-Programm aus, um das nicht fokussierte Fluoreszenzlicht^7,8zu entfernen, um eine dekonvolvede D3D-Bilddatei zu erzeugen. Wählen Sie die Registerkarte Prozess im Dialogfeld "Start" aus, und wählen Sie dann deconvolveaus. Ein neues Dialogfeld mit dem Titel deconvolvewird angezeigt.
   1. Legen Sie die Dekonvolution-Parameter fest, indem Sie die entsprechende Bildnummer (in der oberen linken Ecke jeder Bilddatei) auf die Eingabe im Dialogfeld Dekonvolution ziehen. Aktivieren Sie im Dialogfeld Dekonvolution die Schaltfläche "Weitere Optionen", und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Zuschneiderahmen", nachdem Sie das Kontrollkästchen verarbeitet haben (sonst können die Bilder nicht über die entsprechende DIC-Datei überlagert werden).
   2. Klicken Sie im Dialogfeld Dekonvolution auf die Schaltfläche "Do it", um die Rohbilddatei zu dekonvolvenieren.
      HINWEIS: Die Dekonvolution-Parameter können entsprechend der Anleitung des Softwareherstellers für gewünschte Ergebnisse angepasst werden.
3. Führen Sie bei Bedarf manuelle Hintergrundrauschensubtraktion und Helligkeits-/Kontrastanpassung in einem oder allen Wellenlängenkanälen (Farbe) durch. Wählen Sie dazu die Kontrasteinstellungstaste in der dekonvolvedbildnen Bilddatei aus.
4. Speichern Sie das Bild als TIFF-Datei, indem Sie zuerst die Dateioption oben im D3D-Dialogfeld auswählen. Wählen Sie dann Speichern als TIFF aus, identifizieren und wählen Sie geeignete Z-Stacks (die sich im Fokus befinden), wählen Sie gewünschte Filtersätze aus oder deaktivieren Sie diese.
5. Führen Sie die Datenquantifizierung mit einer vom Hersteller bereitgestellten Software oder frei verfügbaren Programmen wie ImageJ⁵durch.
   1. Klicken Sie für die Quantifizierung der Zellengröße auf die Werkzeugregisterkarte in der entsprechenden D3D-Bilddatei, und wählen Sie dann die Option Entfernungen messen aus. Messen Sie Die Entfernungen, indem Sie Start- und Endpunkte in der gewünschten Bilddatei mit der Maus durch linksklicks auswählen.
      HINWEIS: Es ist am besten, das Bild während der Quantifizierung der Zellengröße zu vergrößern.
   2. Verwenden Sie für die Fluoreszenzsignalquantifizierung die Dateninspektor-Option unter der Werkzeugregisterkarte der entsprechenden D3D-Bilddatei.
      HINWEIS: Es ist am besten, das Bild zu vergrößern und nur relevante Filter ausgewählt zu haben, wenn die Fluoreszenzsignalquantifizierung abgeschlossen wird.
   3. Um das Fluoreszenzsignal zu quantifizieren, zeichnen Sie ein Feld mit der Option Spalte/Zeile, die auf eine bestimmte Dimension festgelegt ist. Wählen Sie einen Bereich mit signal aus, der quantifiziert werden soll, und zeichnen Sie den Wert auf. Messen Sie das Hintergrundsignal, indem Sie das gleiche Größenfeld verwenden, um einen Bereich direkt außerhalb der Zellen auszuwählen. Subtrahieren Sie den Hintergrundwert von dem Wert, der vom Fluoreszenzsignal in der Zelle aufgezeichnet wurde.

Ergebnisse

GpsB-Phänotypen
Zuvor haben wir gezeigt, dass Sa-GpsB ein essentielles Protein ist, da die Erschöpfung von GpsB mit einer Antisense-RNA zu einer Zelllyse⁹führt. Hier beschreiben wir, wie die Entstehung verschiedener Zellteilungsphänotypen und Veränderungen in der Proteinlokalisierung mit dem in diesem Artikel beschriebenen Zeitraffermikroskopieprotokoll erfasst werden konnten. Zu diesem Zweck wurden die S. aureus-Stämme RB143 [SH1000 mit pEPSA5 (leerer Vektor)] u...

Diskussion

Die Mikroskopie ist nach wie vor eine tragende Säule in Studien über mikrobielle Organismen. Angesichts ihrer Mikron-Zellgröße stützten sich Einzelzell-Level-Studien traditionell auf Elektronenmikroskopie (EM). Obwohl EM in den letzten Jahren zu einer recht leistungsfähigen Technik geworden ist, hat es neben dem eingeschränkten Benutzerzugriff¹⁶seine eigenen intrinsischen Einschränkungen. Verbesserungen in fluoreszenzmikroskopischen Techniken und die Entwicklung verschiedener Fluoreszenzso...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher BioReagents	BP160-100	Molecular Biology Grade - Low EEO
DAPI	Invitrogen	D3571	Microscopy
FM4-64	Invitrogen	T3166	Microscopy
Glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
IPTG	Fisher BioReagents	BP1755-10	Dioxane-free
Microscope	GE	DeltaVision Elite	Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque.
PC190723	MilliporeSigma	3445805MG	FtsZ inhibitor
SoftWorx	GE		Manufacturer-supplied imaging software