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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En este artículo, presentamos el protocolo que se describe como análisis de fusión de alta resolución (HRM) basado en lesiones locales inducidas por objetivos en genomas (TILLING). Este método utiliza cambios de fluorescencia durante la fusión del dúplex de ADN y es adecuado para el cribado de alto rendimiento tanto de inserción/eliminación (Indel) como de substición de base única (SBS).

Resumen

Las lesiones locales inducidas por el objetivo en los genomas (TILLING) es una estrategia de genética inversa para el cribado de alto rendimiento de mutaciones inducidas. Sin embargo, el sistema TILLING tiene menos aplicabilidad para la detección de inserción/eliminación (Indel) y TILLING tradicional necesita pasos más complejos, como la digestión nucleasa CEL I y la electroforesis de gel. Para mejorar el rendimiento y la eficiencia de selección, y para hacer posible el cribado tanto de Indels como de substiciones de base única (SBS), se desarrolla un nuevo sistema TILLING basado en fusión de alta resolución (HRM). Aquí, presentamos un protocolo HRM-TILLING detallado y mostramos su aplicación en el cribado de mutaciones. Este método puede analizar las mutaciones de los amplicons de PCR midiendo la desnaturalización del ADN de doble cadena a altas temperaturas. El análisis HRM se realiza directamente después de PCR sin procesamiento adicional. Además, un método de extracción de ADN simple, seguro y rápido (SSF) se integra con HRM-TILLING para identificar tanto Indels como SBSs. Su simplicidad, robustez y alto rendimiento lo hacen potencialmente útil para la exploración de mutaciones en arroz y otros cultivos.

Introducción

Los mutantes son importantes recursos genéticos para la investigación de genómica funcional vegetal y la cría de nuevas variedades. Un enfoque genético directo (es decir, desde la selección mutante hasta la clonación genética o el desarrollo de variedades) solía ser el método principal y único para el uso de mutaciones inducidas hace unos 20 años. El desarrollo de un nuevo método de genética inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) de McCallum et al.1 abrió un nuevo paradigma y desde entonces se ha aplicado en un gran número de especies animales y vegetales2. TILLING es particularmente útil para los rasgos de reproducción que son técnicamente difíciles o costosos de determinar (por ejemplo, resistencia a enfermedades, contenido mineral).

TILLING fue desarrollado inicialmente para mutaciones de puntos de detección inducidas por mutágenos químicos (por ejemplo, EMS1,3). Incluye los siguientes pasos: el establecimiento de una(s) población(es) TILLING; Preparación del ADN y agrupación de plantas individuales; Amplificación pcR del fragmento de ADN objetivo; heteroduplexes la formación por desnaturalización y recocido de los amplicones de PCR y la escisión por nucleasa CEL I; y la identificación de los individuos mutantes y sus lesiones moleculares específicas3,4. Sin embargo, este método sigue siendo relativamente complejo, consume mucho tiempo y de bajo rendimiento. Para hacerlo más eficiente y con un mayor rendimiento, se han desarrollado muchos métodos TILLING modificados, como la eliminación TILLING (De-TILLING) (Tabla1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

El análisis de curvas HRM, que se basa en cambios en la fluorescencia durante la fusión del dúplex de ADN, es un método simple, rentable y de alto rendimiento para el cribado de mutaciones y el genotipado13. HRM ya ha sido ampliamente utilizado en la investigación de plantas incluyendo TILLING basado en HRM (HRM-TILLING) para el cribado de mutaciones SBS inducidas por EMS mutagenesis14. Aquí, presentamos protocolos detallados de HRM-TILLING para el cribado de mutaciones (tanto Indel como SBS) inducidas por rayos gamma en el arroz.

Protocolo

1. Preparativos

  1. Desarrollo de poblaciones mutadas de rayos de la misma
    1. Tratar unas 20.000 semillas de arroz secas (con un contenido de humedad de alrededor del 14%) de una línea de arroz japonica (por ejemplo, DS552) con 137rayos gamma Cs a 100 Gy (1 Gy/min) en una instalación de irradiación (por ejemplo, célula gamma).
      NOTA: Las semillas utilizadas para el tratamiento deben tener una alta viabilidad (por ejemplo, con una tasa de germinación >85%). La dosis de irradiación para el arroz indica podría aumentarse a 150 Gy.
    2. Siembra las semillas irradiadas después de la germinación en un lecho de plántulas y trasplanta las plántulas individualmente a un arrozal y crece hasta convertirse en la población M 1.
      NOTA: La siembra directa de plantas M1 también podría aplicarse para ahorrar costos de mano de obra. Evitar el cruce de plantas M1 con otras variedades de arroz utilizando medios de aislamiento físico o biológico.
    3. Cosecha a granel M2 semillas de las plantas M1, con 1-2 semillas de cada M1 pánico, para formar una población M2.
      NOTA: En la práctica y para simplificar, cosechar todas las semillas de M1 plantas y después de mezclar completamente, una porción se muestrea para formar una población M2.
    4. Remoje alrededor de 5.000 M2 semillas en agua para 24 (arroz indica)-36 (arroz japonica) h a temperatura ambiente. Luego deje que las semillas germinen a 37 oC durante 2 días en papel de filtro húmedo en platos Petri.
      NOTA: Se pueden germinar más semillas M2 para su análisis con el fin de aumentar la probabilidad de identificar mutantes.
    5. Colocar las semillas germinadas en paneles de siembra con pequeños agujeros y cultivarlas hidropónicamente durante 3-4 semanas en una solución de cultivo modificada de Yoshida et al.15 en un invernadero con un fotoperiodo de 12 h [durante el día (30o2) y de noche (24oC) oC].
  2. Muestreo de los tejidos de las hojas: Corte un disco (2 mm) de la hoja completamente extendida de cada sembrada en la misma posición utilizando un perforador.
  3. Preparación de soluciones de extracción de ADN
    1. Buffer A: Añadir 2 mL de 5 M NaOH y 10 mL de 20% Tween 20 para hacer el volumen final de 50 mL. Recién preparar el tampón A antes de la extracción de ADN.
    2. Zona de influencia B: Añadir 20 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8.0) y 80 ml de 0,5 M EDTA para hacer un volumen final de 100 ml.
  4. Imprimaciones PCR
    1. Primers para el análisis HRM: Imprimaciones de diseño para amplificación de la secuencia objetivo utilizando software (por ejemplo, Primer Premier5) y sintetizado por una empresa comercial.
      NOTA: Debido a que HRM es menos aplicable al análisis de fragmentos largos, y por lo tanto, los amplicons deben ser menos de 400 bp. Fragmentos con demasiado alto (>75%) o demasiado bajo (<25%) El contenido de GC tampoco es bueno para el análisis de HRM.
    2. Primers para el control de calidad: Utilice los 24 marcadores SSR distribuidos en los 12 cromosomas de arroz de Peng et al.16.

2. Extracción de ADN

  1. Coloque 4 discos de hoja en cada pocal de una placa PCR de 96 pocillos, agregue la solución tampón A (50 ml/pozo). Congele la placa en un congelador de -80 oC durante 10 minutos.
  2. Descongelar la placa a temperatura ambiente, y luego incubar a 95 oC durante 10 minutos.
  3. Añadir 50 l de tampón B a cada pocto y mezclar bien mediante el vórtice.
  4. Centrifugar la placa durante 1 min a 1.500 x g. El sobrenadante está listo para PCR.

3. Amplificación de PCR

  1. Optimización de PCR
    1. Añadir los siguientes reactivos a cada pozo de PCR: 1 l de ADN (el sobrenadante en el paso 2.4), 5 l de 2x Master Mix (que contiene 2x tamp PCR, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/L 2'-desoxirribonucleósido trifosfatos (dNTPs), y 50 U/mL Taq ADN polimerasa, 0,2 l cada uno de 10 Imprimaciones de mol/L, y hacer un volumen final de hasta 10 ol utilizando agua libre de nucleasas.
    2. Utilice un bloque térmico con capacidad de gradiente para determinar la temperatura de recocido óptima para cada fragmento de destino utilizando el siguiente programa de PCR: 5 min a 94 oC, seguido de 40 ciclos de 30 s a 94 oC, 30 s a 52-62 oC (temperatura de gradiente) y 30 s a 72 oC , con una extensión final a 72oC durante 8 min y una retención a 16oC.
    3. Examine los amplicons en geles de agarosa al 1% para determinar la temperatura óptima de recocido.
      NOTA: Una temperatura de recocido óptima debe permitir una amplificación específica del fragmento de destino, sin amplificación inespecífica y la dimización de imprimación.
  2. PCR para el análisis de HRM
    NOTA: Las placas compatibles con HRM y el ADN de las plántulas M2 extraídas como se describe en el paso 2.4 se utilizan para PCR.
    1. Realizar PCRs en un volumen final de 10 l, con 1 l de ADN (sobrenadante), 5 l de mezcla maestra 2x, 0,2 ml cada uno de 10 imprimaciones de mol/L y 1 l de tinte de fluorescencia de 10x. En cada placa incluye una muestra de crianza de tipo salvaje (WT) y un control negativo (sin ADN).
    2. Añadir una gota de aceite mineral a cada pocal para evitar la evaporación.
    3. Sellar la placa con película adhesiva y centrifugar a 1.000 x g durante 1 min.
    4. Ejecute el PCR con la temperatura de recocido optimizada.
      NOTA: En algunos casos, el tinte de fluorescencia puede afectar a la amplificación de PCR, por lo tanto, el tinte se añade después de la finalización de la PCR. En tales casos, el tinte se incorpora en las hebras de ADN mediante la desnaturalización y recocido post-PCR.

4. Análisis hrM y confirmación de mutación

  1. Retire la película adhesiva de la placa e inserte la placa en una máquina HRM.
  2. Seleccione Nueva ejecución en el menú de archivos o pulse el botón Ejecutar en la parte superior de la pantalla.
  3. Especifique las temperaturas inicial y final de la fusión de 55 oC a 95 oC.
    NOTA: Después de la primera ejecución, el rango de temperatura de fusión se puede determinar para un fragmento en particular; por lo tanto, la temperatura de fusión se puede ajustar para el análisis posterior del mismo fragmento para ahorrar tiempo.
  4. Seleccione muestras para el análisis de fusión de alta resolución, excluya muestras similares al control negativo.
  5. Normalizar las curvas de fusión para tener la misma fluorescencia inicial y final. Confirme visualmente que los cursores de temperatura Mínimo mínimo e Mínimo máximo se encuentran en una región de las curvas.
  6. Mantenga el nivel de F (diferencia de fluorescencia) en el ajuste predeterminado de 0,05.
  7. Seleccione La variante común frente a la variante en la lista de selección Estándares y elija la sensibilidad Normal.
  8. Utilice el WT como control; se considera que las muestras con un valor de f de 0,05 de WT contienen plantas mutantes.
  9. Identificación y confirmación de plantas mutantes.
    1. Identifique las cuatro plantas, de las cuales se hizo cada piscina mutante.
    2. Extraiga ADN de cada una de estas plantas utilizando un método CTAB según Allen et al.17 con algunas modificaciones.
      NOTA: RNase libre de DNase y NaAc no se utilizan cuando se extrae ADN utilizando el método CTAB descrito por Allen et al.17, ya que la calidad del ADN es lo suficientemente buena para una mayor amplificación de PCR. Ajustar el ADN a una concentración final de 25 ng/L después de la cuantificación utilizando un espectrofotómetro.
    3. Amplifique el fragmento de destino utilizando imprimaciones PCR y programe lo mismo que para el análisis hrM.
    4. Identificar lesiones moleculares específicas por secuenciación de Sanger de los amplicons.
      NOTA: Una vez finalizada la amplificación de PCR, envíe los amplificadores a una empresa para la secuenciación de Sanger. La lesión molecular se puede identificar comparando las secuencias entre la planta M2 y la WT.

5. Control de calidad de mutantes seleccionados con marcadores moleculares

  1. Realizar PCR para los 24 marcadores SSR en un volumen final de 10 l con 25 ng de ADN genómico (extraído mediante el protocolo CTAB), 5 s de mezcla maestra 2x, 0,2 l de cada una de las imprimaciones SSR de 10 m.
  2. Ejecutar PCR utilizando el siguiente programa: 5 min a 94 oC, seguido de 30 ciclos de 30 s a 94 oC, 30 s a 55 oC y 30 s a 72 oC, con una extensión final a 72 oC durante 7 min.
  3. Separe los amplicons en geles de poliacrilamida al 8% y revele el polimorfismo de los fragmentos amplificados por la tinción de plata18.
  4. Compare los haplotipos SSR de las variantes seleccionadas y el WT.
    NOTA: Los mutantes inducidos a menudo tienen haplotipos SSR idénticos a su WT, si más de un marcador de SSR es diferente entre una variante y la WT, la variante es de alta probabilidad de ser un contaminante genético (por ejemplo, una mezcla o planta cruzada) en lugar de una planta inducida mutante18.

Resultados

Análisis y análisis de HRM

En total, se produjeron 1.140 muestras de ADN agrupadas de 4.560 M2 plántulas y se sometieron a amplificación de PCR. Se ampliaron dos fragmentos con el tamaño de 195 bp y 259 bp para OsLCT1 y SPDT, respectivamente (Tabla 2). La mayoría de las muestras tenían curvas de fusión no significativamente diferentes de la WT (F < 0,05). Las curvas HRM son significativamente diferentes de las WT (F > 0.05)...

Discusión

TILLING ha demostrado ser una poderosa herramienta genética inversa para identificar mutaciones inducidas para el análisis funcional de genes y la reproducción de cultivos. Para algunos rasgos que no se observan o determinan fácilmente, TILLING con detección de mutaciones basadas en PCR de alto rendimiento puede ser un método útil para obtener mutantes para diferentes genes. El método HRM-TILLING se ha utilizado en poblaciones mutadas en EMS de tomate12,trigo11 y vi...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2016YFD0102103) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.31701394).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Taq plus PCR Master MixTiangen, ChinaKT201PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plateBio-rad, AmericaMSP-9651Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexusEppendorf, German6333000073PCR amplification
LightScannerIdaho Technology, USALCSN-ASY-0011For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0Idaho Technology, USAFor analysis of the fluorescence change
EvaGreenBiotium, USA31000-TFluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, USAND2000For DNA quantification

Referencias

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
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  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).

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