JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, Genomlarda Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi (HRM) tabanlı Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING) olarak tanımlanan protokolü satılmaktadır. Bu yöntem, DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerini kullanır ve hem ekleme/silme (Indel) hem de tek baz ikamesi (SBS) yüksek işlem li tarama için uygundur.

Özet

Genomlarda Hedef Kaynaklı Lokal Lezyonlar (TILLING), indüklenen mutasyonların yüksek iş lenme taraması için ters genetik stratejisidir. Ancak TILLING sistemi ekleme/silme (Indel) tespiti için daha az uygulanabilirliğe sahiptir ve geleneksel TILLING'in CEL I nükleaz sindirimi ve jel elektroforez gibi daha karmaşık adımlara ihtiyacı vardır. Verim ve seçim verimliliğini artırmak ve hem Indels hem de tek baz ikamelerinin (SBSs) taranmasını mümkün kılmak için, yeni bir yüksek çözünürlüklü erime (HRM) tabanlı TILLING sistemi geliştirilmiştir. Burada ayrıntılı bir HRM-TILLING protokolü sunmakta ve mutasyon taramasında uygulamamızı gösteriyoruz. Bu yöntem, yüksek sıcaklıklarda çift iplikli DNA denatürasyonu ölçerek PCR amplicons mutasyonları analiz edebilirsiniz. HRM analizi ek işleme gerek kalmadan doğrudan PCR sonrası gerçekleştirilir. Ayrıca, basit, güvenli ve hızlı (SSF) DNA çıkarma yöntemi HEM Indels ve SBSs tanımlamak için HRM-TILLING ile entegre edilmiştir. Sadeliği, sağlamlığı ve yüksek iş kalitesi, pirinç ve diğer ürünlerde mutasyon taraması için potansiyel olarak yararlı olmasını sağlayabilir.

Giriş

Mutantlar bitki fonksiyonel genomik araştırma ve yeni çeşitlerin ıslahı için önemli genetik kaynaklardır. İleri genetik yaklaşım (yani mutant seçiminden gen klonlama veya çeşitli gelişime kadar) yaklaşık 20 yıl önce indüklenen mutasyonların kullanımında ana ve tek yöntem olarak kullanılmıştır. McCallum ve ark.1 tarafından yeni bir ters genetik yöntemi, TILLING (Hedefleme Kaynaklı Lokal Lezyonlar Genomlar) gelişimi yeni bir paradigma açıldı ve o zamandan beri hayvan ve bitki türlerinin çok sayıda uygulanmıştır2. TILLING özellikle teknik olarak zor veya maliyetli olan (örneğin, hastalık direnci, mineral içeriği) üreme özellikleri için yararlıdır.

TILLING başlangıçta kimyasal mutajenler tarafından indüklenen tarama noktası mutasyonları için geliştirilmiştir (örn. EMS1,3). Aşağıdaki adımları içerir: bir TILLING nüfus (lar) kurulması; DNA hazırlama ve bireysel bitkilerin havuzlanması; Hedef DNA parçasının PCR amplifikasyonu; PCR amplikonve dekoltesinin CEL I nükleaz tarafından denatürasyonu ve tavallanması ile heteroduplexes oluşumu; ve mutant bireylerin ve spesifik moleküler lezyonların tanımlanması3,4. Ancak, bu yöntem hala nispeten karmaşık, zaman alıcı ve düşük iş için. Daha verimli ve daha yüksek iş ile yapmak için, silme TILLING (De-TILLING) ( Tablo1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

DNA dupleksinin erimesi sırasında floresan değişikliklerine dayanan HRM eğrisi analizi, mutasyon taraması ve genotipleme için basit, uygun maliyetli ve yüksek iş lenme yöntemidir13. HRM zaten yaygın Olarak EMS mutagenez 14 tarafından indüklenen SBS mutasyonları taranması için HRMtabanlı TILLING (HRM-TILLING) dahil olmak üzere bitki araştırmalarında kullanılmıştır. Burada, pirinçteki gama (γ) ışınları ile indüklenen mutasyonların (Hem Indel hem de SBS) taranması için ayrıntılı HRM-TILLING protokolleri sunduk.

Protokol

1. Hazırlıklar

  1. Γ-ışınları mutajenize popülasyonların gelişimi
    1. Yaklaşık 20.000 kurutulmuş pirinç tohumu (%14) nem içeriği ile tedavi bir γ ışınlama tesisinde (örneğin, gama hücresi) 100 Gy (1 Gy/dk) ilejaponica pirinç hattı (örn. DS552).
      NOT: Tedavi için kullanılan tohumlar yüksek canlılığa sahip olmalıdır (örn. çimlenme oranı >%85). Indica pirinç için ışınlama dozu 150 Gy artırılabilir.
    2. Bir fide yatağında çimlenme ve bir çeltik tarlasına ayrı ayrı fide nakli sonra ışınlanmış tohumek ve M1 nüfus haline büyümek.
      NOT: M1 bitkilerinin doğrudan tohumlanması da işçilik maliyetini korumak için uygulanabilir. Fiziksel veya biyolojik izolasyon araçlarını kullanarak M1 bitkilerinin diğer pirinç çeşitleriyle geçişini önleyin.
    3. Toplu hasat M2 tohumları M1 bitkilerden, her M1 panik 1-2 tohum ile, bir M2 popülasyon oluşturmak için.
      NOT: Uygulamada ve basitlik için, M1 bitkilerin tüm tohumları hasat ve tamamen karıştırıldıktan sonra, bir kısmı M2 popülasyonu oluşturmak için örneklenir.
    4. Oda sıcaklığında 24 (indica pirinç)-36 (japonica pirinç) h için suda yaklaşık 5.000 M2 tohum ıslatın. Daha sonra petri kaplarında nemli filtre kağıdı üzerinde 2 gün boyunca 37 °C'de çimlenmeye izin verin.
      NOT: Daha fazla M2 tohumu mutantların belirlenmesi olasılığını artırmak için analiz için çimlenebilir.
    5. Çimlenmiş tohumları küçük deliklerli tohumlama panellerine yerleştirin ve Yoshida ve ark. 15'ten değiştirilen bir kültür çözümünde 3-4 hafta hidroponik olarak 12 saatlik fotoperi [gündüz (30±2) °C ve gece (24±2) °C] olan bir cam evde yetiştirin.
  2. Yaprak dokularının örneklemesi: Bir delik zımba layıcı kullanarak her tohumlamanın tamamen uzatılmış yaprağından bir disk (Φ ~2 mm) kesin.
  3. DNA ekstraksiyon çözeltilerinin hazırlanması
    1. Tampon A: 50 mL'lik son hacmi yapmak için 2 mL 5 M NaOH ve %20 Ara 20 mL ekleyin. DNA çıkarmadan önce a arabelleği yeni hazırlayın.
    2. Tampon B: 100 mL'lik son hacim yapmak için 1 M Tris-HCl (pH 8.0) ve 0.5 M EDTA'dan 80 μL 20 mL ekleyin.
  4. PCR astarlar
    1. HRM analizi için astarlar: Yazılım (örneğin, Primer Premier5) kullanarak hedef sıranın yükseltilmesi için astarlar ve ticari bir şirket tarafından sentezleme.
      NOT: HRM uzun parçaların analizi için daha az uygulanabilir olduğundan ve dolayısıyla, amplicons az olmalıdır 400 bp. Çok yüksek (>75%) ile parçalar veya çok düşük (<25%) GC içeriği de HRM analizi için iyi değildir.
    2. Kalite kontrolü için astarlar: Peng ve ark. 16'dan 12 pirinçkromozomuna dağıtılan 24 SSR belirteçlerini kullanın.

2. DNA Çıkarma

  1. 96 kuyulu BIR PCR plakanın her kuyuya 4 yaprak disk yerleştirin, arabellek A çözeltisi (50 mL/iyi) ekleyin. Plakayı -80 °C'lik bir dondurucuda 10 dakika dondurun.
  2. Oda sıcaklığında plakayı defreeze ve sonra 95 °C'de 10 dakika kuluçka.
  3. Her kuyuya 50 μL arabellek B ekleyin ve girdap ile iyice karıştırın.
  4. 1.500 x g 1 dakika için plaka santrifüj. Supernatant PCR için hazırdır.

3. PCR Amplifikasyon

  1. PCR Optimizasyonu
    1. Her PCR'ye aşağıdaki reaktifleri iyi ekleyin: 1 μL DNA (adım 2.4'teki süpernatant), 5 μL 2x Master Mix(2x PCR tampon, 4 mmol/L MgCl 2, 0.4 mmol/L 2'-deoksiribonükleoside trifosfatlar (dNTPs) ve 50 U/mL Taq DNA polimeraz, 0.2 000 000 000 000 μmol/L astarlar ve nükleaziçermeyen su kullanarak 10°L'ye kadar son bir hacim yapın.
    2. Aşağıdaki PCR programını kullanarak her hedef parçası için en uygun tavlama sıcaklığını belirlemek için degrade özelliğine sahip bir termal blok kullanın: 94 °C'de 5 dk, ardından 94 °C'de 30 s, 52-62 °C'de 30 s (degrade sıcaklık) ve 72 °C'de 30 s , 8 dk için 72 °C'de son uzatma ve 16 °C'de tutun.
    3. Optimum tavlama sıcaklığının belirlenmesi için %1 agarose jeller üzerindeki amperonları inceleyin.
      NOT: Optimal bir tavlama sıcaklığı, spesifik amplifikasyon ve astar dimerizasyonu olmaksızın hedef parçanın spesifik amplifikasyonunu sağlamalıdır.
  2. HRM analizi için PCR
    NOT: 2.4 adımda açıklandığı şekilde çıkarılan M2 fidelerinin HRM uyumlu plakaları ve DNA'sı PCR için kullanılmaktadır.
    1. 1 μL DNA (supernatant), 5 μL 2x Master Mix, 0,2 μL her 10 μmol/L astar ve 1 0x floresan boya 1 0°L ile 10 μL son hacimde PCR gerçekleştirin. Her plaka bir yabani tip (WT) ebeveynli örnek ve bir negatif (DNA olmadan) kontrol içerir.
    2. Buharlaşmayı önlemek için her kuyuya bir damla mineral yağ ekleyin.
    3. 1 dk için 1.000 x g yapışkan film ve santrifüj ile plaka mühür.
    4. PcR'yi optimize edilmiş annealing sıcaklığını kullanarak çalıştırın.
      NOT: Birkaç durumda floresan boya PCR amplifikasyonunu etkileyebilir, bu nedenle boya PCR tamamlandıktan sonra eklenir. Bu gibi durumlarda boya, PCR sonrası denatüre ve annealing ile DNA iplikçiklerine dahil edilir.

4. HRM Tarama ve Mutasyon Onayı

  1. Yapışkan filmi plakadan çıkarın ve plakayı bir HRM makinesine takın.
  2. Dosya menüsünden Yeni Çalıştır'ı seçin veya ekranın üst kısmındaki Çalıştır düğmesine basın.
  3. Erimenin başlangıç ve bitiş sıcaklıklarını 55 °C ile 95 °C arasında belirtiniz.
    NOT: İlk çalıştırmadan sonra, erime sıcaklığı nın aralığı belirli bir parça için belirlenebilir; bu nedenle, erime sıcaklığı zaman kazanmak için aynı parçanın sonraki analizi için ayarlanabilir.
  4. Yüksek çözünürlüklü erime analizi için örnekleri seçin, negatif denetime benzer örnekleri hariç tayın.
  5. Aynı başlangıç ve floresan biten için erime eğrileri normalleştirin. Alt Min ve Alt Maksı İmlatörlerinin eğrilerin bir bölgesinde olduğunu görsel olarak doğrulayın.
  6. 0,05 varsayılan ayarında F (floresan farkı) düzeyini tutun.
  7. Standartlar seçim listesinden Ortak ve Varyant'ı seçin ve Normal duyarlılığı seçin.
  8. WT'yi kontrol olarak kullanın; WT'den ≥0.05 değerinde ki numunelerin mutant bitki içerdiği kabul edilir.
  9. Mutant bitkilerin tanımlanması ve onaylanması.
    1. Her mutant havuzunun yapıldığı dört bitkiyi tanımlayın.
    2. Allen ve ark. 17'ye göre bazı değişikliklerle ctab yöntemi kullanarak bu bitkilerin her birinden DNA ayıklayın.
      NOT: DNA kalitesi daha fazla PCR amplifikasyon için yeterli olduğundan, Allen ve ark.17tarafından tanımlanan CTAB yöntemi kullanılarak DNA ayıklanırken DNA'sız RNase ve NaAc kullanılmaz. Dna'yı bir spektrofotometre kullanarak nicelleştirmeden sonra ~25 ng/μL'lik son konsantrasyona ayarlayın.
    3. PCR astarlarını kullanarak hedef parçayı yükseltin ve HRM analiziyle aynı programı yapın.
    4. Amplikonrların Sanger dizilimi ile spesifik moleküler lezyonları tanımlayın.
      NOT: PCR amplifikasyon tamamlandıktan sonra, Sanger sıralama için bir şirkete amplicons gönderin. Moleküler lezyon, M2 bitkisi ile WT arasındaki diziler karşılaştırılarak tanımlanabilir.

5. Moleküler Belirteçli Seçilmiş Mutantların Kalite Kontrolü

  1. 24 SSR belirteçleri için 25 ng genomik DNA (CTAB protokolü kullanılarak çıkarılan), 5 μL 2x ana karışım, 10 μM SSR astarın her birinin 0,2 μL'si ile 10°L'lik son hacimde PCR gerçekleştirin.
  2. Aşağıdaki programı kullanarak PCR çalıştırın: 94 °C'de 5 dk, 94 °C'de 30 s, 55 °C'de 30 s ve 72 °C'de 30 s, 7 dk için 72 °C'de son uzatma ile takip edin.
  3. % 8 poliakrilamid jeller üzerinde amplicons ayırın ve gümüş boyama18amplifiye parçalarıpolimorfizm ortaya .
  4. Seçilen varyantların SSR haplotiplerini ve WT'yi karşılaştırın.
    NOT: İndüklenen mutantlar genellikle WT ile aynı SSR haplotiplerine sahiptir, eğer birden fazla SSR belirteci bir varyant ile WT arasında farklılık gösterirse, varyantın indüklenen bir bitki yerine genetik bir kirletici (örn. karışım veya çaprazdan çıkmış bir bitki) olma olasılığı yüksektir. mutant18.

Sonuçlar

HRM Tarama ve Analiz

Toplamda 4.560 M2 fideden 1.140 havuzdna örneği üretildi ve PCR amplifikasyonuna tabi tutuldu. OsLCT1 ve SPDTiçin sırasıyla 195 bp ve 259 bp boyutunda iki parça yükseltildi (Tablo 2). Örneklerin çoğunda WT'den önemli ölçüde farklı olmayan erime eğrileri vardı (ΔF < 0.05). WT'den önemli ölçüde farklı OLAN HRM eğrileri (ΔF > 0.05) yazılım tarafından WT'den farklı renk(ler) ile grupla...

Tartışmalar

TILLING gen fonksiyonel analizi ve bitki ıslahı için indüklenen mutasyonları tanımlamak için güçlü bir ters genetik araç olduğunu kanıtlamıştır. Kolay gözlenmeyen veya belirlenemeyen bazı özellikler için, yüksek iş itrılişli PCR tabanlı mutasyon tespiti ile TILLING farklı genler için mutantlar elde etmek için yararlı bir yöntem olabilir. HRM-TILLING yöntemi mutasyon taraması için domates12,buğday11 ve üzüm20 EMS-mu...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2016YFD0102103) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.31701394) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Taq plus PCR Master MixTiangen, ChinaKT201PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plateBio-rad, AmericaMSP-9651Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexusEppendorf, German6333000073PCR amplification
LightScannerIdaho Technology, USALCSN-ASY-0011For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0Idaho Technology, USAFor analysis of the fluorescence change
EvaGreenBiotium, USA31000-TFluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, USAND2000For DNA quantification

Referanslar

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 151y ksek z n rl kl erime analiziHRMTILLINGmutasyon taramasIndel ve SBSgama nlarpirin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır