JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы представляем протокол, который описывается как анализ плавления с высоким разрешением (HRM) на основе целевых индуцированных локальных поражений в геномах (TILLING). Этот метод использует изменения флуоресценции во время плавления дуплекса ДНК и подходит для высокой пропускной связи скрининга как вставки / удаления (Indel) и одной базы субстанции (SBS).

Аннотация

Целевая индуцированная локальная поражения в геномах (TILLING) является стратегией обратной генетики для высокой пропускной проверки индуцированных мутаций. Тем не менее, система TILLING имеет меньшую применимость для обнаружения вставки/удаления (Indel) и традиционные TILLING нуждается в более сложных шагах, таких как самоанализ пищеварения CEL I и электрофорез геля. Для повышения эффективности пропускной способностью и отбора, а также для того, чтобы сделать возможным скрининг как Indels, так и отдельных базовых субстанций (SBSs), разработана новая система плавления с высоким разрешением (HRM) tillING. Здесь мы представляем подробный протокол HRM-TILLING и показываем его применение при скрининге мутаций. Этот метод может анализировать мутации ампулконов ПЦР путем измерения денатурации двухцепочечной ДНК при высоких температурах. Анализ HRM непосредственно выполняется после ПЦР без дополнительной обработки. Кроме того, простой, безопасный и быстрый (SSF) метод извлечения ДНК интегрирован с HRM-TILLING для идентификации как Indels, так и SBS. Его простота, надежность и высокая пропускная готовность делают его потенциально полезным для сканирования мутаций в рисе и других культурах.

Введение

Мутанты являются важными генетическими ресурсами для исследования функциональной геномики растений и разведения новых сортов. Передовой подход к генетике (т.е. от выбора мутантов до клонирования генов или развития разнообразия) был основным и единственным методом использования индуцированных мутаций около 20 лет назад. Разработка нового метода обратной генетики, TILLING (Нацеливание индуцированных местных поражений в геномах) McCallum et al.1 открыл новую парадигму, и с тех пор она была применена в большом количестве животных и растений видов2. TILLING особенно полезен для размножения, которые технически трудно или дорого определить (например, устойчивость к болезням, содержание минералов).

TILLING был первоначально разработан для мутаций точек скрининга, индуцированныххимическими мутагенами (например, EMS 1,3). Она включает в себя следующие шаги: создание TILLING населения (ы); подготовка ДНК и объединение отдельных растений; ПЦР усиление фрагмента ДНК-мишени; формации гетеродплексов путем денатурации и аннулирования ампулктонов ПЦР и расщепления с помощью cel I nuclease; и идентификация мутантов и ихспецифических молекулярных поражений 3,4. Тем не менее, этот метод по-прежнему является относительно сложным, отнимает много времени и низкой пропускной их. Чтобы сделать его более эффективным и с более высокой пропускной их, многие модифицированные методы TILLING были разработаны, такие как удаление TILLING (De-TILLING) (Таблица 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

Анализ кривой HRM, который основан на изменениях флуоресценции во время плавления дуплекса ДНК, является простым, экономичным и высокопроизводительным методом для скрининга мутаций и генотипирования13. HRM уже широко используется в исследованиях растений, включая HRM на основе TILLING (HRM-TILLING) для скрининга мутаций SBS, индуцированных EMS mutagenesis14. Здесь мы представили подробные протоколы HRM-TILLING для скрининга мутаций (как Indel, так и SBS), индуцированных гамма-лучами в рисе.

протокол

1. Подготовка

  1. Развитие мутагенизированных популяций, связанных с лучами,
    1. Лечить около 20 000 сушеных семян риса (с содержанием влаги около 14%) рисовой линии японики (например, DS552) с 137С гамма-лучей при 100 Ги (1 Г/мин) в объекте облучения (например, гамма-клетка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семена, используемые для лечения должны иметь высокую жизнеспособность (например, с частотой прорастания Доза облучения риса индика может быть увеличена до 150 Ги.
    2. Посеять облученные семена после прорастания на саженец и пересадить саженцы индивидуально на рисовое поле и вырасти в m1 населения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прямое посев М1 растений редко может быть применен для экономии затрат на рабочую силу. Предотвращение перебора растений M1 с другими сортами риса с использованием средств физической или биологической изоляции.
    3. Массовый урожай M2 семян из M1 растений, с 1-2 семена от каждого M1 паники, чтобы сформировать M2 населения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На практике и для простоты, урожай все семена Растений М1 и после полного смешивания, часть берется для формирования M2 населения.
    4. Замочите около 5000 М2 семян в воде для 24 (Индика рис)-36 (japonica рис) ч при комнатной температуре. Затем дайте семенам прорасти при 37 градусах По Цельсия в течение 2 дней на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больше семян M2 может быть прорастано для анализа, чтобы увеличить вероятность выявления мутантов.
    5. Поместите проросшие семена в посевные панели с небольшими отверстиями и выращивайте их гидропонно в течение 3-4 недель в культурном растворе, модифицированном из Yoshida et al.15 в стеклянной будке с фотопериодом 12 ч (дневной (30 х 2) КК и ночью (24 х 2) КС.
  2. Выборка листовых тканей: Вырезать один диск (2 мм) из полностью расширенного листа каждого посева в том же положении с помощью отверстия перфоратор.
  3. Подготовка решений для экстракции ДНК
    1. Буфер A: Добавить 2 мл 5 M NaOH и 10 мл 20% Tween 20, чтобы сделать окончательный объем 50 мл. Свежеприготовленный буфер А перед извлечением ДНК.
    2. Буфер B: Добавить 20 мл 1 M Tris-HCl (pH 8.0) и 80 л 0,5 М EDTA, чтобы сделать окончательный объем 100 мл.
  4. ПЦР праймеры
    1. Праймеры для анализа HRM: Дизайн праймеров для усиления целевой последовательности с помощью программного обеспечения (например, Primer Premier5) и синтезировать коммерческой компанией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что HRM менее применима к анализу длинных фрагментов, и, следовательно, ампликоны должны быть меньше 400 bp. Фрагменты со слишком высокими (Яgt;75%) или слишком низко (злот;25%) Содержание GC также не хорошо подходит для анализа HRM.
    2. Праймеры для контроля качества: Используйте 24 Маркеры SSR, распределенные по 12 рисовым хромосомам из Пэн и др.16.

2. Извлечение ДНК

  1. Поместите 4 листовых диска в каждую скважину 96-хорошей пластины ПЦР, добавьте буфер A раствор (50 мл/хорошо). Заморозить тарелку в морозильной камере -80 градусов в течение 10 минут.
  2. Разморозить тарелку при комнатной температуре, а затем инкубировать при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
  3. Добавьте 50 кЛ буфера B к каждой скважине и хорошо перемешайте путем вихря.
  4. Центрифуга пластины в течение 1 мин на 1500 х г. Супернатант готов к ПЦР.

3. Усиление ПЦР

  1. Оптимизация ПЦР
    1. Добавьте следующие реагенты к каждому ПЦР хорошо: 1 кЛ ДНК (супернатант в шаге 2.4), 5 qL 2x Master Mix (содержащий 2x PCR буфер, 4 ммоль / L MgCl2, 0,4 ммоль / л 2'-deoxyribonucleoside трифосфаты (dNTPs), и 50 U/mL Taq полимерДНК, каждый nomol /L праймеры, и сделать окончательный объем до 10 л с использованием нуклеаза свободной воды.
    2. Используйте градиент-способный тепловой блок для определения оптимальной температуры annealing для каждого целевого фрагмента с помощью следующей программы ПЦР: 5 мин при 94 градусах по Цельсию, затем 40 циклов по 30 с при температуре 94 градусов по Цельсию, 30 с при температуре 52-62 градусов по Цельсию и 30 с при температуре 72 градусов по Цельсию , с окончательным расширением при 72 градусах по Цельсию в течение 8 мин и удержанием при 16 градусах Цельсия.
    3. Изучите ампелоны на 1% гелей агарозы для определения оптимальной температуры аннулирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура аннулирования должна позволить специфическое усиление целевого фрагмента, без неспецифического усиления и грунтового димеризации.
  2. ПЦР для анализа HRM
    ПРИМЕЧАНИЕ: HRM совместимые пластины и ДНК Саженцы M2 извлечены, как описано в шаге 2.4 используются для ПЦР.
    1. Выполняйте ПХР в окончательном томе в 10 зл, с 1 зл ДНК (супернатант), 5 Зл 2x Master Mix, 0,2 л каждый из 10 ймоль / L праймеров, и 1 Л 10x флуоресцентный краситель. В каждую пластину входит один дикий тип (WT) родительский образец и один отрицательный (без ДНК) контроль.
    2. Добавьте каплю минерального масла в каждую скважину, чтобы предотвратить испарение.
    3. Запечатайте тарелку клейкой пленкой и центрифугой при 1000 х г в течение 1 мин.
    4. Запустите ПЦР, используя оптимизированную температуру аннулирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, флуоресценция краситель может повлиять на усиление ПЦР, следовательно, краситель добавляется после завершения ПЦР. В таких случаях краситель включается в нити ДНК путем денатурирования и аннулирования.

4. HrM сканирование и подтверждение мутации

  1. Снимите клейкую пленку с пластины и вставьте пластину в HRM-машину.
  2. Выберите New Run из меню файлов или нажмите кнопку «Запуск» в верхней части экрана.
  3. Укажите начальные и окончание температуры для расплава от 55 градусов по Цельсию до 95 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После первого запуска, диапазон температуры расплава может быть определен для конкретного фрагмента; следовательно, температура расплава может быть скорректирована для последующего анализа того же фрагмента, чтобы сэкономить время.
  4. Выберите образцы для анализа плавления с высоким разрешением, исключите образцы, аналогичные отрицательному контролю.
  5. Нормализуйте плавящиеся кривые, чтобы иметь то же начало и окончание флуоресценции. Визуально подтвердите, что курсоры температуры Нижнего Мина и Нижнего Макса находятся в области кривых.
  6. Держите уровень «F» (разница флуоресценции) при настройке по умолчанию 0,05.
  7. Выберите Общий и Вариант из списка выбора стандартов и выберите нормальную чувствительность.
  8. Используйте WT в качестве элемента управления; образцы со значением ВТ в размере 0,05 фунтов, считаются содержат растения-мутанты.
  9. Идентификация и подтверждение растений-мутантов.
    1. Определите четыре растения, из которых был сделан каждый бассейн мутантов.
    2. Извлекайте ДНа от каждого из этих заводов используя метод CTAB согласно Allen et al.17 с некоторыми изменениями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DNase-бесплатно RNase и NaAc не используются при извлечении ДНК с помощью метода CTAB, описанного Аллен и др.17, как качество ДНК достаточно хорошо для дальнейшего усиления ПЦР. Отрегулируйте ДНК до конечной концентрации в 25 нг/Л после количественной оценки с помощью спектрофотометра.
    3. Увеличьте целевой фрагмент с помощью праймеров ПЦР и программируйте так же, как и для анализа HRM.
    4. Определите специфические молекулярные поражения sanger sequencing ампиконов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения усиления ПЦР, отправить ампликоны в компанию для секвенирования Sanger. Молекулярное поражения можно определить, сравнив последовательности между заводом М2 и WT.

5. Контроль качества выбранных мутантов с помощью молекулярных маркеров

  1. Выполните ПЦР для 24 маркеров SSR в окончательном объеме 10 зЛ с 25 нг геномной ДНК (извлеченных с использованием протокола CTAB), 5 qL 2x мастер смеси, 0,2 л каждого из 10 мкм SSR праймеров.
  2. Запуск ПЦР с использованием следующей программы: 5 мин при 94 градусах по Цельсию, затем 30 циклов 30 с при 94 градусах По Цельсию, 30 с при 55 градусах По Цельсию и 30 с при 72 градусах По Цельсию, с окончательным расширением при 72 градусах по Цельсию в течение 7 мин.
  3. Разделите ампликоны на 8% гелей полиакриламидида и выявить полиморфизм усиленных фрагментов на серебристое окрашивание18.
  4. Сравните гаплотипы SSR выбранных вариантов и WT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индуцированные мутанты часто имеют гаплотипы SSR идентичны их WT, если больше чем одно маркеры SSR друг между вариантом и WT, вариант высок правоподобный для того чтобы быть генетическим contaminant (например, смесь или outcrossed завод) довольно чем наведено мутант18.

Результаты

Сканирование и анализ HRM

В общей сложности было произведено 1140 объединенных образцов ДНК из 4560 м2 саженцев, которые подверглись усилению ПЦР. Два фрагмента размером 195 б.п. и 259 б.п. были усилены для OsLCT1 и SPDTсоответственно (таблица2). В больши...

Обсуждение

TILLING оказался мощным обратным генетическим инструментом для выявления индуцированных мутаций для функционального анализа генов и разведения сельскохозяйственных культур. Для некоторых черт, которые не легко наблюдать или определить, TILLING с высокой пропускной памятью ПЦР на основе му...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (No 2016YFD0102103) и Национальным фондом естественных наук Китая (No31701394).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2× Taq plus PCR Master MixTiangen, ChinaKT201PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plateBio-rad, AmericaMSP-9651Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexusEppendorf, German6333000073PCR amplification
LightScannerIdaho Technology, USALCSN-ASY-0011For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0Idaho Technology, USAFor analysis of the fluorescence change
EvaGreenBiotium, USA31000-TFluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000Thermo Scientific, USAND2000For DNA quantification

Ссылки

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151HRMTILLINGSBS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены