זיהוי מוטציות על ידי ברזולוציה גבוהה התכה באוכלוסיית לעיבוד לקרקע של אורז

Summary

במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקול המתואר כניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה (HRM)-היעד מבוסס המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע). שיטה זו משתמשת שינויים פלואורסצנטית במהלך ההיתוך של דופלקס ה-DNA והוא מתאים הקרנת תפוקה גבוהה של הן הכניסה/מחיקה (Indel) ו-substition בסיס יחיד (SBS).

Abstract

היעד המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע) היא אסטרטגיה של גנטיקה הפוכה עבור הקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות המושרה. עם זאת, למערכת לעיבוד קרקע יש פחות ישימות לצורך הכנסה/מחיקה (indel) ולעיבוד קרקע מסורתי צריך שלבים מורכבים יותר, כמו העיכול של CEL I נוקלאז ואלקטרופורזה ג'ל. כדי לשפר את יעילות התפוקה והבחירה, וכיצד להפוך את ההקרנה של שני האינדידלים והבסיס היחיד (SBSs) אפשרי, מערכת לעיבוד קרקע מבוססת (HRM) חדשה ברזולוציה גבוהה מפותחת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט HRM-לעיבוד קרקע ולהראות יישום שלה בהקרנה מוטציה. שיטה זו יכולה לנתח את המוטציות של ה-PCR הגברה על ידי מדידת הדנטורציה של דנ א כפול שנתקע בטמפרטורות גבוהות. ניתוח HRM מבוצע ישירות פוסט-PCR ללא עיבוד נוסף. יתר על כן, פשוטה, בטוחה ומהירה (SSF) שיטת הפקת DNA משולב עם HRM-לעיבוד לקרקע כדי לזהות הן Indels ו-SBSs. הפשטות שלה, חוסן ותפוקה גבוהה להפוך אותו שימושי לסריקת מוטציה אורז וגידולים אחרים.

Introduction

מוטציות הן משאבים גנטיים חשובים עבור צמח גנומיקה פונקציונלית מחקר ורבייה של זנים חדשים. הגישה הגנטית הקדמי (כלומר מתוך בחירת מוטציה לשכפול גנים או מגוון התפתחות) היתה השיטה העיקרית והבלעדית לשימוש של מוטציות המושרה על 20 שנה לפני. הפיתוח של שיטת גנטיקה הפוכה הרומן, לעיבוד קרקע (כיעד המושרה נגעים מקומיים Genomes) על ידי McCallum ואח '¹ פתחה פרדיגמה חדשה והיא הוחלה מאז מספר רב של בעלי חיים ומינים צמח². לעיבוד קרקע הוא שימושי במיוחד עבור תכונות רבייה כי הם מבחינה טכנית קשה או יקר להיקבע (למשל, עמידות למחלות, תוכן מינרלי).

לעיבוד הקרקע פותחה בתחילה עבור מוטציות פוינט הנגרמת על ידי מוטגנים כימיים (למשל, EMS^1,3). הוא כולל את השלבים הבאים: הקמת אוכלוסיית לעיבוד קרקע (ים); ה-DNA הכנה ואיגוד של צמחים בודדים; הגברה של מקטע הדנ א של המטרה הטרודופלקסים היווצרות על ידי דנטורציה וריפוי של הגברה ומחשוף של ה-PCR באמצעות CEL I nuclease; ועל הנגעים המולקולריים. הספציפיים שלהם^3,4 עם זאת, שיטה זו עדיין מורכבת יחסית, גוזלת זמן ותפוקה נמוכה. כדי להפוך אותה ליעילה יותר ובעלת תפוקה גבוהה יותר, פותחו שיטות רבות לעיבוד קרקע, כגון מחיקה לעיבוד קרקע (לפני הקרקע) (טבלה 1)^{1,3,5,6, . שבע},^{שמונה,תשע,10,11,12}

הניתוח HRM עיקול, אשר מבוסס על שינויי הזריחה במהלך המסת ה-DNA דופלקס, הוא פשוט, חסכוני, והתפוקה גבוהה שיטה להקרנה מוטציה ו-הקלדה¹³. HRM כבר נעשה שימוש נרחב במחקר הצמח כולל מבוסס HRM לעיבוד קרקע (HRM-לעיבוד קרקע) עבור סינון מוטציות SBS הנגרמת על ידי EMS מוטגנזה¹⁴. כאן, הצגנו פרוטוקולים מפורטים HRM-לעיבוד קרקע להקרנה של מוטציות (הן Indel ו-SBS) הנגרמת על ידי גמא (γ) קרני אורז.

Protocol

1. ההכנות

1. פיתוח מγ לאוכלוסיות מוטחות
   1. התייחס כ 20,000 זרעי אורז יבשים (עם תוכן לחות של ca. 14%) של קו אורז יפני (למשל, DS552) עם ¹³⁷למדעי השורה ב-100 Gy (1 gy/min) במתקן הקרנה γ (למשל, תא גמא).
      הערה: זרעים המשמשים לטיפול צריך להיות בעל יכולת קיום גבוהה (למשל, עם קצב נביטה > 85%). מינון הקרנה עבור אורז indica יכול להיות גדל כדי 150 Gy.
   2. מזרעו את הזרעים לקרינה לאחר הנביטה על מיטה שתיל ושתילים השתלת בנפרד לשדה האורז ולצמוח לתוך האוכלוסיה M₁ .
      הערה: זריעה ישירה של₁ צמחים בדלילות יכולה גם להיות מוחלת על שמירת עלות העבודה. מניעת חציית M₁ צמחים עם זנים אחרים של אורז באמצעות בידוד פיזי או ביולוגי אמצעים.
   3. בתפזורת-הקציר M₂ זרעים מן₁ צמחים, עם 1-2 זרעים מכל אחד בהלה₁ , כדי ליצור a₂ אוכלוסיה.
      הערה: בפועל ולמען הפשטות, הקציר של כל הזרעים של M₁ ולאחר ערבוב מלא, חלק הוא שנדגמו ליצירת אוכלוסיה M₂ .
   4. משרים כ 5,000 M₂ זרעים במים עבור 24 (אינדיקה אורז)-36 (אורז יפני) h בטמפרטורת החדר. אז תן זרעים לנבוט ב 37 ° c עבור 2 ימים על נייר סינון לח מנות פטרי.
      הערה: יותר M₂ זרעים יכולים להיות מונבטים לניתוח כדי להגדיל את ההסתברות של זיהוי מוטציות.
   5. מניחים את הזרעים מונבטים כדי לזריעה פאנלים עם חורים קטנים ולגדול אותם הידרופונטי עבור 3-4 שבועות בפתרון התרבות שונה מ יושידה ואח '¹⁵ בבית החממה עם 12 h photoperiod [בשעות היום (30 ± 2) ° צ' ולילה (24 ± 2) ° c].
2. דגימה של רקמות עלה: גזור דיסק אחד (Φ ~ 2 מ"מ) מן העלה המורחבת במלואו של כל זריעה באותו מיקום באמצעות מנקב חור.
3. הכנת פתרונות להפקת דנ א
   1. מאגר A: להוסיף 2 מ ל של 5 M NaOH ו 10 mL של 20% רצף 20 כדי להפוך את הנפח הסופי של 50 mL. מאגר הכנה טרי. לפני חילוץ הדי. אנ. איי
   2. מאגר B: להוסיף 20 מ ל של 1 M Tris-HCl (pH 8.0) ו 80 μL של 0.5 M EDTA לעשות נפח סופי של 100 mL.
4. צבעי היסוד המולקולארית
   1. תחל ניתוח HRM: עיצוב התחל עבור הגברה של רצף היעד באמצעות תוכנה (למשל, פריימר Premier5) ולסנתז על ידי חברה מסחרית.
      הערה: בגלל hrm הוא פחות ישים על ניתוח של שברים ארוכים, ולכן, הגברה צריכה להיות פחות מ 400 Bp. קטעים עם גבוה מדי (> 75%) או נמוך מדי (< 25%) כמו כן, תוכן GC אינו טוב לניתוח HRM.
   2. התחל בקרת איכות: השתמש 24 סמנים SSR מופץ על 12 כרומוזומים אורז מ פנג ואח '¹⁶.

2. הפקת דנ א

1. מניחים 4 דיסקים עלים לתוך כל טוב של 96-היטב PCR צלחת, להוסיף מאגר פתרון (50 mL/טוב). הקפאת הצלחת במקפיא של 80 ° c במשך 10 דקות.
2. להקפיא את הצלחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הדגירה ב 95 ° c עבור 10 דקות.
3. הוסף 50 μL של מאגר B לכל באר ומערבבים היטב על ידי vortexing.
4. צנטריפוגה את הצלחת עבור 1 דקות ב 1,500 x g. הסופרנטאנט מוכן. לPCR

3. הגברה של הPCR

1. PCR אופטימיזציה
   1. הוסיפו את הריאגנטים הבאים לכל ה-PCR היטב: 1 μL של דנ א (הסופרנטאנט בשלב 2.4), 5 μL של מיקס מאסטר 2x (המכיל מאגר של 2x PCR, 4 ממול/L MgCl₂, 0.4 Minm/l 2 '-deאוקסיטבונאוסייד triphosphates (dNTPs), ו 50 U/ML TAQ DNA פולימראז, 0.2 μl כל אחד 10 לפני/L התחל, ולעשות נפח הסופי של עד 10 μl באמצעות המים חינם נוקלאז.
   2. השתמש בבלוק תרמי בעל יכולת הדרגתיות כדי לקבוע את טמפרטורת הריפוי המיטבית עבור כל קטע יעד באמצעות התוכנית הבאה של ה-PCR: 5 דקות ב-94 ° צ', ואחריו 40 מחזורים של 30 ב-94 ° c, 30 בשעה 52-62 ° צ' (טמפרטורת מעבר) ו -30 s ב-72 ° c. , עם הארכה הסופית ב 72 ° c עבור 8 דקות וחסימה ב -16 ° c.
   3. בחנו הגברה על 1% ג'ל לקביעת טמפרטורת הריפוי האופטימלית.
      הערה: טמפרטורת ריפוי אופטימלית צריכה לאפשר הגברה מסוימת של מקטע המטרה, ללא הגברה ומלא מדויקת של מטרות.
2. PCR לניתוח HRM
   הערה: הצלחות תואמות hrm ו-DNA של M₂ שתילים שחולצו כפי שמתואר בשלב 2.4 משמשים ל-PCR.
   1. בצע בדיקות בנפח הסופי של 10 μL, עם 1 μL של ה-DNA (סופרנטאנט), 5 μL של מיקס מאסטר 2x, 0.2 μL כל אחד 10 μc/L התחל, ו 1 μL של צבע זריחה 10x. בכל אחת מהלוחיות נמנים מדגם מסוג פראי אחד (WT) ובקרה אחת שלילית (ללא דנ א).
   2. להוסיף טיפה של שמן מינרלי כל טוב כדי למנוע אידוי.
   3. לאטום את הצלחת עם הסרט והצנטריפוגה ומכה דבק ב 1,000 x g עבור 1 דקות.
   4. הפעל את ה-PCR באמצעות טמפרטורת הריפוי האופטימיזציה.
      הערה: במקרים מסוימים, צבע הקרינה הפלואורסצנטית עלולה להשפיע על הגברה של ה-pcr, ולכן הצבע נוסף לאחר השלמת ה-pcr. במקרים כאלה, הצבע משולב לתוך גדילי ה-DNA על ידי הדאגנטיזה וריפוי.

4. HRM סריקה ואישור מוטציה

1. הסר את הסרט דבק מלוחית והכנס את הצלחת לתוך מכונת HRM.
2. בחר ' הפעלה חדשה ' מתפריט הקובץ או לחץ על לחצן הפעלה בחלק העליון של המסך.
3. ציין את טמפרטורת ההתחלה והסיום עבור ההמיס מ-55 ° צ' עד 95 ° c.
   הערה: לאחר ההפעלה הראשונה, ניתן לקבוע את טווח הטמפרטורה הנמס עבור שבר מסוים; מכאן, הטמפרטורה להמיס יכול להיות מותאם לניתוח עוקבות של אותו שבר כדי לחסוך זמן.
4. בחרו דוגמאות לניתוח התכה ברזולוציה גבוהה, לא לכלול דוגמאות דומות לפקד השלילי.
5. לנרמל את עקומות ההיתוך יש התחלה זהה הסוף הזריחה. ודא באופן חזותי שסמני הטמפרטורה ' מינימום ' ו'נמוכה יותר של Max ' נמצאים באזור של עקומות.
6. שמור ∆ F (הבדל של זריחה) רמת בהגדרת ברירת המחדל של 0.05.
7. בחר את המשותף לעומת Variant מרשימת בחירת התקנים ובחר את הרגישות הרגילה.
8. השתמש ב-WT כפקד; דגימות עם ערך ∆ F של ≥ 0.05 מ WT נחשבים להכיל צמח מוטציה.
9. זיהוי ואישור של צמחי מוטציה.
   1. זהה את ארבעת הצמחים, שעליהם. כל בריכת המוטציות נעשתה
   2. לחלץ דנ א מכל אחד מצמחים אלה באמצעות שיטת CTAB לפי אלן ואח '¹⁷ עם כמה שינויים.
      הערה: dnase-Free rnase ו-naac אינם משמשים כאשר מיצוי ה-dna באמצעות שיטת ctab המתוארת על ידי אלן ואח '¹⁷, כמו איכות ה-DNA הוא מספיק טוב עבור PCR הגברה נוספת. להתאים את ה-DNA לריכוז הסופי של ~ 25 ng/μL לאחר הקוונפיקציה באמצעות ספקטרוסקופיה.
   3. להגביר את קטע המטרה באמצעות התחל והתוכנית באופן זהה לניתוח HRM.
   4. זיהוי נגעים מולקולריים ספציפיים על ידי רצף הגברה.
      הערה: לאחר סיום הגברה ה-PCR, שלח את ההגברה לחברה לקביעת רצף השורות. הנגע המולקולרי יכול להיות מזוהה על ידי השוואת הרצפים בין הצמח M₂ ו WT.

5. בקרת איכות של מוטציות נבחרות עם סמנים מולקולריים

1. לבצע PCR עבור 24 סמנים SSR בנפח הסופי של 10 μL עם 25 ng של דנ א גנומית (שחולצו באמצעות פרוטוקול CTAB), 5 μL של מיקס מאסטר 2x, 0.2 μL של כל אחד 10 μM התחל SSR.
2. הפעל את ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 5 דקות ב 94 ° c, ואחריו 30 מחזורים של 30 בשעה 94 ° c, 30 בתוך 55 ° צ' ו 30 בשעה 72 ° c, עם סיומת סופית ב-72 ° c עבור 7 דקות.
3. הפרד את המגברה על שמונה% ג'ל פוליאקרילמיד וגלה פולימורפיזם של רסיסים מוחלקים על ידי כתמים מכסף¹⁸.
4. השווה את משתני SSR של המשתנים שנבחרו ואת ה-WT.
   הערה: מוטציות המושרה לעיתים קרובות יש הhaplotypes זהה ל-wt שלהם, אם יותר מאשר אחד סמנים ssr שונים בין משתנה ו-wt, המשתנה הוא גבוה עשוי להיות מזהם גנטי (למשל, תערובת או צמח החוצה) ולא המושרה . מוטציה¹⁸

תוצאות

מחקר וסריקה של HRM

בסך הכל, 1,140 במאגר דגימות DNA מ 4,560 M₂ שתילים יוצרו ונתון הגברה PCR. שני שברי עם גודל של 195 bp ו 259 bp הוגברה עבור OsLCT1 ו spdt, בהתאמה (שולחן2). רוב הדגימות היו עקומות התכה לא שונה באופן משמעותי מן WT (ΔF < 0.05). עקומות HRM שונה באופן משמעותי מן WT (...

Discussion

לעיבוד קרקע הוכיחה להיות כלי גנטי עוצמה הפוכה לזיהוי מוטציות המושרה עבור ניתוח פונקציונלי גנטי הרבייה יבול. עבור תכונות מסוימות לא בקלות נצפתה או נחוש, לעיבוד קרקע עם זיהוי מוטציה בתפוקה גבוהה PCR המבוסס יכול להיות שיטה שימושית כדי להשיג מוטציות עבור גנים שונים. שיטת "HRM-לעיבוד קרקע" שימש בא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2× Taq plus PCR Master Mix	Tiangen, China	KT201	PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate	Bio-rad, America	MSP-9651	Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus	Eppendorf, German	6333000073	PCR amplification
LightScanner	Idaho Technology, USA	LCSN-ASY-0011	For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0	Idaho Technology, USA		For analysis of the fluorescence change
EvaGreen	Biotium, USA	31000-T	Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000	Thermo Scientific, USA	ND2000	For DNA quantification