Identifizieren von Mutationen durch hochauflösendes Schmelzen in einer TILLING-Bevölkerung von Reis

Zusammenfassung

In diesem Artikel stellen wir das Protokoll vor, das als HRM-basiertes Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) beschrieben wird. Diese Methode nutzt Fluoreszenzänderungen beim Schmelzen des DNA-Duplex und eignet sich für das Hochdurchsatz-Screening sowohl der Insertion/Deletion (Indel) als auch der Single Base Substition (SBS).

Zusammenfassung

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) ist eine Strategie der Reverse-Genetik für das Hochdurchsatz-Screening von induzierten Mutationen. Das TILLING-System ist jedoch weniger anwendbar für die Insertion/Deletion (Indel)-Erkennung und herkömmliche TILLING-Schritte benötigen komplexere Schritte, wie cel I Nuklease-Verdauung und Gelelektrophorese. Um den Durchsatz und die Selektionseffizienz zu verbessern und das Screening sowohl von Indels als auch von Single Base Substitions (SBSs) zu ermöglichen, wird ein neues HIGH-Resolution-Melting-System (HRM) entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes HRM-TILLING Protokoll vor und zeigen dessen Anwendung im Mutationsscreening. Diese Methode kann die Mutationen von PCR-Amplicons analysieren, indem die Denaturierung von doppelsträngiger DNA bei hohen Temperaturen gemessen wird. Die HRM-Analyse erfolgt direkt nach der PCR ohne zusätzliche Verarbeitung. Darüber hinaus ist eine einfache, sichere und schnelle (SSF) DNA-Extraktionsmethode in HRM-TILLING integriert, um sowohl Indels als auch SBSs zu identifizieren. Seine Einfachheit, Robustheit und hoher Durchsatz machen es potenziell nützlich für Mutationsscans in Reis und anderen Kulturen.

Einleitung

Mutanten sind wichtige genetische Ressourcen für die pflanzenfunktionelle Genomforschung und die Züchtung neuer Sorten. Ein Forward-Genetik-Ansatz (d.h. von der mutierten Selektion bis zum Genklonen oder der Sortenentwicklung) war vor etwa 20 Jahren die wichtigste und einzige Methode für die Verwendung induzierter Mutationen. Die Entwicklung einer neuartigen Reverse-Genetik-Methode, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) von McCallum et al.¹ eröffnete ein neues Paradigma und wurde seitdem bei einer großen Anzahl von Tier- und Pflanzenarten angewendet². TILLING ist besonders nützlich für Zuchteigenschaften, die technisch schwierig oder kostspielig zu bestimmen sind (z. B. Krankheitsresistenz, Mineralgehalt).

TILLING wurde ursprünglich für Screening-Punktmutationen entwickelt, die durch chemische Mutagene induziert werden (z.B. EMS^1,3). Sie umfasst die folgenden Schritte: die Einrichtung einer TILLING-Bevölkerung; DNA-Vorbereitung und -Pooling einzelner Pflanzen; PCR-Verstärkung des Ziel-DNA-Fragments; Heteroduplexe Bildung durch Denaturierung und Glühen von PCR-Amplicons und Spaltung durch CEL I Nuklease; und Identifizierung mutierter Individuen und ihrer spezifischen molekularen Läsionen^3,4. Diese Methode ist jedoch nach wie vor relativ komplex, zeitaufwändig und mit geringem Durchsatz. Um es effizienter und mit höherem Durchsatz zu machen, wurden viele modifizierte TILLING-Methoden entwickelt, wie z.B. Löschen TILLING (De-TILLING) (Tabelle 1)^{1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12}.

Die HRM-Kurvenanalyse, die auf Fluoreszenzänderungen beim Schmelzen des DNA-Duplexs basiert, ist eine einfache, kostengünstige und hochdurchsatzstarke Methode für Mutationsscreening und Genotypisierung¹³. HRM wurde bereits weit verbreitet in der Pflanzenforschung einschließlich HRM-basierteTILLING (HRM-TILLING) für das Screening von SBS-Mutationen durch EMS-Mutagenese¹⁴induziert. Hier präsentierten wir detaillierte HRM-TILLING-Protokolle zum Screening von Mutationen (sowohl Indel als auch SBS), die durch Gamma-Strahlen im Reis induziert werden.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Entwicklung von mutagenisierten Populationen
   1. Behandeln Sie ca. 20.000 getrocknete Reissamen (mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 14%) einer Japonica-Reislinie (z.B. DS552) mit ¹³⁷Cs Gammastrahlen bei 100 Gy (1 Gy/min) in einer Bestrahlungsanlage (z.B. Gammazelle).
      ANMERKUNG: Saatgut, das zur Behandlung verwendet wird, sollte eine hohe Lebensfähigkeit haben (z. B. mit einer Keimrate von >85 %). Die Bestrahlungsdosis für Indica-Reis konnte auf 150 Gy erhöht werden.
   2. Die bestrahlten Samen nach der Keimung auf einem Sämlingsbeet säen und Sämlinge einzeln auf ein Reisfeld verpflanzen und in die M 1-Population hineinwachsen.
      ANMERKUNG: Die direkte Aussaat von M 1-Pflanzen könnte auch nur spärlich angewendet werden, um Arbeitskosten zu sparen. Verhindern Sie das Überqueren von M 1-Pflanzen mit anderen Reissorten mit physikalischen oder biologischen Isolationsmitteln.
   3. Bulk-Harvest M₂ Samen aus den M 1-Pflanzen, mit 1-2 Samen aus jeder M₁ Panik, um eine M_2-Population zu bilden.
      HINWEIS: In der Praxis und der Einfachheit, ernten Sie alle Samen von M₁ Pflanzen und nach dem vollständigen Mischen wird eine Portion zu einer M 2-Population beprobt.
   4. Etwa 5.000_M2 Samen in Wasser für 24 (Indica-Reis)-36 (Japonica-Reis) h bei Raumtemperatur einweichen. Dann lassen Sie die Samen bei 37 °C für 2 Tage auf feuchtem Filterpapier in Petrischalen keimen.
      HINWEIS: Mehr M₂ Samen können für die Analyse gekeimt werden, um die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung von Mutanten zu erhöhen.
   5. Die gekeimten Samen mit kleinen Löchern auf Saatplatten legen und 3-4 Wochen hydroponisch in einer kulturbasierten Lösung anbauen, die von Yoshida et al.¹⁵ in einem Gewächshaus mit einer 12 h Photoperiode [tagsüber (30-2) °C und Nacht (24 -2) °C] modifiziert wurde.
2. Probenahme von Blattgeweben: Schneiden Sie eine Scheibe (ca. 2 mm) aus dem vollständig verlängerten Blatt jeder Aussaat an der gleichen Position mit einem Locher.
3. Vorbereitung von DNA-Extraktionslösungen
   1. Puffer A: Fügen Sie 2 ml von 5 M NaOH und 10 ml von 20% Tween 20 hinzu, um das Endvolumen von 50 ml zu erreichen. Puffer A vor der DNA-Extraktion frisch vorbereiten.
   2. Puffer B: Fügen Sie 20 ml von 1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 80 l mit 0,5 M EDTA hinzu, um ein Endvolumen von 100 ml zu erreichen.
4. PCR-Grundierungen
   1. Primer für die HRM-Analyse: Design-Primer zur Verstärkung der Zielsequenz mit Software (z.B. Primer Premier5) und Synthetisierung durch ein kommerzielles Unternehmen.
      ANMERKUNG: Da HRM weniger auf die Analyse von langen Fragmenten anwendbar ist und daher die Amplicons weniger als 400 bp betragen sollten. Fragmente mit zu hohen (>75%) oder zu niedrig (<25%) GC-Inhalte sind auch nicht gut für die HRM-Analyse.
   2. Primer zur Qualitätskontrolle: Verwenden Sie die 24 SSR-Marker, die auf den 12 Reischromosomen von Peng et al.¹⁶verteilt sind.

2. DNA-Extraktion

1. Legen Sie 4 Blattscheiben in jeden Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte, fügen Sie Puffer A Lösung (50 ml/well). Einfrieren der Platte in einem -80 °C Gefrierschrank für 10 min.
2. Die Platte bei Raumtemperatur einfrieren und dann 10 min bei 95 °C inkubieren.
3. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l Puffer B hinzu und mischen Sie sie gut durch Wirbeln.
4. Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 1.500 x g. Der Überstand ist bereit für PCR.

3. PCR-Verstärkung

1. PCR-Optimierung
   1. Fügen Sie jedem PCR-Brunnen folgende Reagenzien hinzu: 1 L DNA (der Überstand in Schritt 2,4), 5 l 2x Master Mix (enthält 2x PCR-Puffer, 4 mmol/L MgCl₂, 0,4 mmol/L 2'-Deoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs) und 50 U/mL Taq DNA-Polymerase, 0,2 und machen Sie ein Endvolumen von bis zu 10 l mit nukleasefreiem Wasser.
   2. Verwenden Sie einen gradientenfähigen Wärmeblock, um die optimale Glühtemperatur für jedes Zielfragment mit dem folgenden PCR-Programm zu bestimmen: 5 min bei 94 °C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 52-62 °C (Gradiententemperatur) und 30 s bei 72 °C , mit einer Endverlängerung bei 72 °C für 8 min und einem Haltegriff bei 16 °C.
   3. Untersuchen Sie Amplicons auf 1% Agarose-Gels zur Bestimmung der optimalen Glühtemperatur.
      ANMERKUNG: Eine optimale Glühtemperatur sollte eine spezifische Verstärkung des Zielfragments ohne unspezifische Amplifikation und Primerdimerisierung ermöglichen.
2. PCR für HRM-Analyse
   HINWEIS: HRM-kompatible Platten und DNA von M 2-Sämlingen, die gemäß Schritt 2.4 extrahiert wurden, werden für PCR verwendet.
   1. Führen Sie PCRs in einem Endvolumen von 10 l, mit 1 l DNA (Überstand), 5 l 2x Master Mix, 0,2 l mit jeweils 10 Mol/L-Primern und 1 l 10-fachen Fluoreszenzfarbstoff. In jeder Platte enthalten eine wild Typ (WT) elternte Probe und eine negative (ohne DNA) Kontrolle.
   2. Fügen Sie jedem Brunnen einen Tropfen Mineralöl hinzu, um Verdunstung zu verhindern.
   3. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und Zentrifuge bei 1.000 x g für 1 min.
   4. Führen Sie die PCR mit der optimierten Glühtemperatur aus.
      ANMERKUNG: In einigen Fällen kann Fluoreszenzfarbstoff die PCR-Verstärkung beeinflussen, daher wird der Farbstoff nach Abschluss der PCR hinzugefügt. In solchen Fällen wird der Farbstoff durch Nach-PCR-Denaturierung und Glühen in DNA-Stränge eingearbeitet.

4. HRM-Scanning und Mutationsbestätigung

1. Entfernen Sie die Klebefolie von der Platte und legen Sie sie in eine HRM-Maschine ein.
2. Wählen Sie Neue Ausführung aus dem Dateimenü oder drücken Sie die Run-Taste am oberen Bildschirmrand.
3. Geben Sie die Anfangs- und Endtemperaturen für die Schmelze von 55 °C bis 95 °C an.
   ANMERKUNG: Nach dem ersten Durchlauf kann der Schmelztemperaturbereich für ein bestimmtes Fragment bestimmt werden; Daher kann die Schmelztemperatur für die nachfolgende Analyse desselben Fragments eingestellt werden, um Zeit zu sparen.
4. Wählen Sie Proben für eine hochauflösende Schmelzanalyse aus, schließen Sie Proben aus, die dem Negativkontroll ähneln.
5. Normalisieren Sie die Schmelzkurven, um die gleiche Anfangs- und Endfluoreszenz zu haben. Bestätigen Sie visuell, dass sich die Temperaturcursor unterm Min und Unterhöchstwert in einem Bereich der Kurven befinden.
6. Halten Sie die Pegelstufe "F" (Differenz der Fluoreszenz) bei der Standardeinstellung 0,05.
7. Wählen Sie die Option "Gemeinsam im Vergleich zur Variante" aus der Auswahlliste Standards aus, und wählen Sie die Empfindlichkeit "Normal".
8. Verwenden Sie den WT als Steuerelement; Proben mit einem F-Wert von 0,05 € von WT werden als mutierte Pflanze betrachtet.
9. Identifizierung und Bestätigung von mutierten Pflanzen.
   1. Identifizieren Sie die vier Pflanzen, aus denen jeder mutierte Pool gemacht wurde.
   2. Extrahieren Sie DNA aus jeder dieser Pflanzen mit einer CTAB-Methode nach Allen et al.¹⁷ mit einigen Modifikationen.
      HINWEIS: DNase-freie RNase und NaAc werden bei der Dna-Extraktion mit der von Allen et al.¹⁷beschriebenen CTAB-Methode nicht verwendet, da die DNA-Qualität für eine weitere PCR-Verstärkung ausreichend ist. Passen Sie die DNA nach der Quantifizierung mit einem Spektralphotometer auf eine Endkonzentration von 25 ng/L an.
   3. Verstärken Sie das Zielfragment mit PCR-Primern und programmieren Sie das gleiche wie für die HRM-Analyse.
   4. Identifizieren Sie spezifische molekulare Läsionen durch Sanger-Sequenzierung der Amplicons.
      HINWEIS: Nach Abschluss der PCR-Verstärkung, senden Sie die Amplicons an ein Unternehmen für Sanger-Sequenzierung. Die molekulare Läsion kann durch vergleicht der Sequenzen zwischen der M2-Pflanze und der WT identifiziert werden.

5. Qualitätskontrolle ausgewählter Mutanten mit molekularen Markern

1. Führen Sie PCR für die 24 SSR-Marker in einem Endvolumen von 10 l mit 25 ng genomischer DNA (extrahiert mit dem CTAB-Protokoll), 5 l 2x Master-Mix, 0,2 l von jeweils 10 SSR-Primern durch.
2. PCR mit folgendem Programm ausführen: 5 min bei 94 °C, gefolgt von 30 Zyklen 30 s bei 94 °C, 30 s bei 55 °C und 30 s bei 72 °C, mit einer Endverlängerung bei 72 °C für 7 min.
3. Trennen Sie die Amplicons auf 8% Polyacrylamid-Gelen und offenbaren Polymorphismus von verstärkten Fragmenten durch Silberfärbung¹⁸.
4. Vergleichen Sie die SSR-Haplotypen ausgewählter Varianten und die WT.
   ANMERKUNG: Induzierte Mutanten haben oft SSR-Haplotypen, die mit ihrem WT identisch sind, wenn mehr als ein SSR-Marker zwischen einer Variante und der WT unterschiedlich ist, ist die Variante hochwahrscheinlich als genetischer Kontaminant (z. B. eine Mischung oder überkreuzte Pflanze) und nicht als induzierte mutant¹⁸.

Ergebnisse

HRM Scanning und Analyse

Insgesamt wurden 1.140 gepoolte DNA-Proben aus 4.560 M2-Sämlingen hergestellt und einer PCR-Verstärkung unterzogen. Zwei Fragmente mit der Größe von 195 bp und 259 bp wurden für OsLCT1 bzw. SPDT(Tabelle 2) verstärkt. Die meisten Proben hatten Schmelzkurven, die sich nicht wesentlich von der WT unterschieden (F < 0,05). HRM-Kurven, die sich deutlich von der WT unterscheiden (F > 0,05), wurden von der S...

Diskussion

TILLING hat sich als ein leistungsfähiges reverse genetisches Werkzeug zur Identifizierung induzierter Mutationen für die Genfunktionalanalyse und Pflanzenzüchtung erwiesen. Für einige Merkmale, die nicht leicht beobachtet oder bestimmt werden können, kann TILLING mit PCR-basierter Mutationsdetektion mit hohem Durchsatz eine nützliche Methode sein, um Mutanten für verschiedene Gene zu erhalten. Die HRM-TILLING-Methode wurde in EMS-mutagenisierten Populationen von Tomaten^12,Weizen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2× Taq plus PCR Master Mix	Tiangen, China	KT201	PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate	Bio-rad, America	MSP-9651	Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus	Eppendorf, German	6333000073	PCR amplification
LightScanner	Idaho Technology, USA	LCSN-ASY-0011	For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0	Idaho Technology, USA		For analysis of the fluorescence change
EvaGreen	Biotium, USA	31000-T	Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000	Thermo Scientific, USA	ND2000	For DNA quantification