Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo

Resumen

Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.

Resumen

Los peces cebra son ampliamente utilizados en la investigación básica y biomédica. Muchas líneas transgénicas de pez cebra están actualmente disponibles para etiquetar varios tipos de células. Debido al cuerpo embrionario transparente del pez cebra, es conveniente para nosotros estudiar el efecto de una quimiocina en el comportamiento de un cierto tipo de células in vivo. Aquí proporcionamos un flujo de trabajo para investigar la función de una quimiocina en la migración de macrófagos in vivo. Construimos un plásmido de sobreexpresión específico del tejido para sobreexpresar IL-34 e inyectamos el plásmido en embriones de peces transgénicos de una célula cuyos macrófagos fueron etiquetados específicamente por una proteína fluorescente. A continuación, utilizamos hibridación fluorescente in situ de montaje completo e inmunomancha para detectar el patrón de la expresión de quimiocina y el número o ubicación de los macrófagos. Los embriones WT inyectados fueron levantados para generar una línea transgénica estable. Finalmente, utilizamos imágenes en vivo confocales para observar directamente el comportamiento de los macrófagos en los peces transgénicos estables para estudiar la función de IL-34 en los macrófagos in vivo.

Introducción

Zebrafish es un pequeño pez tropical de agua dulce de huesos duros originario de la India. En cuanto a la conservación del gen, el pez cebra tiene una similitud del 87% con el humano¹. Puede proporcionarnos información sobre temas relacionados con el ser humano mediante el estudio de la regulación genética, la función proteica y el comportamiento celular, como la migración, la proliferación et.al en el pez cebra. El embrión zebrafish se puede utilizar para observar el desarrollo de embriones tempranos en diferentes etapas después de inhibir el pigmento. Mientras tanto, el pez cebra tarda sólo tres meses en convertirse en madurez sexual, entonces el pez cebra puede producir cientos de huevos cada 4 días. Mini-tamaño, simple cría, fuerte capacidad reproductiva, estas ventajas hacen que el cultivo de peces cebra muy ahorro de espacio, propicio para el cultivo a gran escala. El ratón modelo de mamífero tradicional tiene costos de mantenimiento más altos que el pez cebra, lo que limita la escala de la elevación del ratón. En el aspecto del desarrollo temprano del embrión, el embrión de ratón es difícil de observar en estado vivo debido a las características del desarrollo del embrión de ratón en el útero materno. Por el contrario, los embriones de pez cebra se desarrollan externamente y son transparentes, por lo que son fáciles de observar bajo un microscopio. Además, el pez cebra es muy fácil de construir una variedad de líneas transgénicas para la investigación de la función génica relacionada. Actualmente, varias líneas transgénicas de pez cebra están disponibles para etiquetar diferentes tipos de células. Es muy conveniente ahora construir líneas transgénicas para sobreexpresar quimiolinas en lugares específicos y estudiar la función de las quimiolinas en el comportamiento celular en el pez cebra.

Aquí, proporcionamos un flujo de trabajo para utilizar la línea transgénica de pez cebra para investigar la función de IL-34 sobre el comportamiento de los macrófagos in vivo^2,3,4,5,6,7. En primer lugar, construimos un plásmido de sobreexpresión específico del hígado del gen il34 e inyectamos el plásmido en embriones de peces Tg (mpeg1: GFP) de una célula que etiquetaron específicamente los macrófagos por proteína fluorescente GFP. Luego, utilizamos hibridación fluorescente in situ de montaje completo e inmunomancha para detectar el patrón de la expresión il34 y el número o ubicación de los macrófagos. Los embriones WT inyectados fueron levantados para generar una línea transgénica estable. En estos pasos, establecimos y validamos la línea productora de citoquinas y evaluamos visualmente los efectos que se pueden ver en la distribución de los macrófagos. Por último, para investigar el comportamiento de los macrófagos en respuesta a la citoquina, utilizamos imágenes en vivo confocales para observar directamente la migración de macrófagos para confirmar la función de il34 en la migración de macrófagos in vivo.

Protocolo

NOTA: Todas las muestras fueron tratadas con agua de huevo de feniltiourea (PTU) para inhibir el pigmento.

1. Generación de Tg (fabp10a:il34) Construcciones transgénicas e inyección de pescado

1. Clonar el promotor fabp10a ⁸ de 2,8 kb y las regiones de codificación IL-34 (ENSDART00000126460.3) del pez cebra en el vector pTol2 para generar la construcción fabp10a-il34. Inyectar las construcciones en la etapa de una célula Tg (mpeg1: GFP) y WT embriones de peces junto con el ARNm transposasa. Elevar los embriones WT inyectados en fabp10a-il34 a^{adultos 9} e identificar al fundador transgénico mediante la hibridación in situ.
   NOTA: La inyección de la construcción Tol2 directamente en otro transgénico podría ser problemática si la otra línea transgénica se hace con el mismo sistema de transposon. Una práctica general sería hacer una línea transgénica independiente y posteriormente cruzar la nueva línea con otra línea de reportero. Esto garantiza que no habrá efectos de la nueva transgénesis en un transgén insertado previamente.

2. Montaje entero fluorescente in Situ Hybridization (WISH) Combinar con inmunostaining

1. Fijación de muestras
   1. Recoger embriones de inyección transitoria o línea transgénica IL-34 estable que se cruzó con Tg (mpeg1: GFP) en las etapas deseadas.
      NOTA: Para este caso, los embriones fueron recogidos a 4 d después de la fertilización (dpf). (Si es necesario) retire el coro con jeringa.
   2. Fijar los embriones con 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 oC o 2 h a temperatura ambiente (RT) (alrededor de 25 oC).
   3. Lavar los embriones con solución salina tamponada de fosfato más Tween 20 (PBST) 3x 5 min.
   4. Deshidratar los embriones por separado con 50% de metanol en PBST (50% metanol/PBST) y 100% metanol, 1x 5 min cada uno. A continuación, cambiar a metanol fresco 100% y almacenar a -20 oC (al menos 2 h).
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
2. Hibridación de sondas (Día I)
   1. Rehidratar los embriones en los pasos anteriores con 50% de metanol en PBST (50% Metanol/PBST), luego lavar con PBST 3x 5 min.
   2. Digerir los embriones con proteinasa K en PBST a RT (concentración final: 10 g/ml; 1:2000 en PBST).
      NOTA: El tiempo de digestión depende de la etapa de los embriones: Menos de 36 h después de la fertilización (hpf), sin necesidad; 36 hpf-2 dpf embrión, 3-5 min; 2-3 dpf embrión, 10 min; 3-4 dpf embrión, 15 min; 4-5 dpf embrión, 15-20 min; 5-6 dpf embrión, 20-27 min; >6 dpf embrión, 25-30 min a RT (alrededor de 25oC).
   3. Deseche la solución de digestión y vuelva a realizar la fijación con 4% de PFA, durante 20 min a RT.
   4. Lavar los embriones con PBST 2x 10 min.
   5. Deseche el PBST, realice la prehibridación con búfer de hibridación calentado (buffer HB) a 65 oC durante 5 min, recicle el búfer HB en el tubo original.
   6. Realizar la pre-hibridación con el nuevo búfer HB calentado a 65 oC al menos 1 h.
   7. Precalentar la sonda⁹ (para este caso era una sonda il34, 1 ng/mL) a 65 oC al menos 10 min. A continuación, recicle el búfer HB en el tubo original. Realice la hibridación con la sonda precalentada a 65 oC durante la noche.
3. Tratamiento de anticuerpos (Día II)
   1. Precalienta el 50% de formamida/2x citrato de sodio salino más Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0.2x SSCT a 65oC.
   2. Recicle la sonda en el tubo original y almacene la sonda a -20 oC.
   3. Lavar los embriones por separado con 50% de formamida/2x SSCT; 2x SSCT; 0,2x SSCT, 3x 20 min o 2x 30 min cada uno a 65oC.
   4. Lavar los embriones con PBST 3x 5 min.
   5. Bloquear las muestras con 600 l de tampón de bloqueo (5% de suero bovino fetal filtrado (FBS) en PBST) durante 1 h a RT.
   6. Añadir 400 l de solución de anticuerpos antidigoxigenina-HRP (1:1.000-1:2.000 en tampón de bloqueo) e incubar los embriones a 4 oC durante la noche. Si las señales son débiles, utilice 1:500 dilución de anticuerpos.
4. Incubación de anticuerpos primarios y colorantes (Día III)
   1. Retire el anticuerpo; lavar los embriones con PBST, 6x 20 min a RT.
   2. Enjuague la muestra con 30 s l de diluyente de amplificación 1x Plus durante 5 min a RT.
   3. Deseche el diluyente pipeteando; Diluir fluorofore Tyramid stock Solution (Cyanine 3 Plus Amplification Reagent (Cy3) o Cyanine 5 Plus Amplification Reagent (Cy5), para este caso se utilizó Cy3) 1:50 en 1x Plus Amplification Diluent para hacer la solución de trabajo de tiramida de fluoróforo. Prepare 50-100 l de solución de trabajo para cada muestra.
   4. Incubar la muestra en la solución de trabajo de tiramida de fluoróforo durante 5-15 minutos en la oscuridad a RT. Si las señales son débiles, amplíe el tiempo de incubación a 30 min.
   5. Detenga la reacción cambiando la solución de trabajo con PBST y examine las señales.
   6. Lavar los embriones con PBST 3x 10 min a RT.
   7. Incubar la muestra con anticuerpoprimario a 4oC durante la noche. Para este caso, utilice el anticuerpo Goat-Anti-GFP como anticuerpo primario.
5. Tinción secundaria de anticuerpos (Día IV)
   1. Lavar los embriones con PBST durante 4x 30 min.
   2. Incubar los embriones con anticuerposecundario a 4oC durante la noche. Para este caso, utilice el anticuerpo Alexa 488-Anti-Goat como anticuerpo secundario.
6. Tomar fotos (Día V)
   1. Lavar los embriones con PBST 3x 10 min a RT.
   2. Almacenar los embriones en 70% glicerol en la oscuridad a 4 oC durante la noche o -20 oC durante más tiempo.

3. Imágenes en vivo

1. Selección de muestras
   NOTA: Utilice la imagen en vivo para observar directamente si los macrófagos de Tg (fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP) peces migrarían al hígado bajo IL-34 inducción durante 3-3.5 dpf. Aquí la línea transgénica Tg (fabp10a-DsRed) se utiliza para etiquetar la región hepática y hacerla visible, para facilitar la localización del hígado y para determinar si los macrófagos migran al hígado. Antes de tomar imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia para seleccionar los embriones dobles positivos DsRed y GFP.
2. Montaje de peces
   1. Utilice un baño de metal para calentar 1 ml de agarosa de fusión baja al 1% a más de 90 oC para derretirla por completo.
   2. Después de que la baja agarosa de fusión se enfríe a la temperatura corporal, agregue 50 ml de tricaína al 0,2% y mezcle uniformemente la tricaína con la agarosa.
   3. Mover los embriones anestesiados a un pequeño plato montado con un tobogán de cubierta en la parte inferior, quitar el agua circundante, soltar lentamente la baja agarosa de fusión en los embriones, establecer cuidadosamente la posición del pez antes de que la agarosa se solidifica, mantener el área del hígado cerca de la cubierta se desliza en la parte inferior del plato.
   4. Después de que la baja agarosa de fusión se solidifica, cúbrala cuidadosamente con otra capa de agarosa para reforzarla.
   5. Coloque el plato en la mesa portadora del microscopio confocal, cubra el pescado con la solución E2¹⁰ con tricaína y comience la toma de imágenes.
3. Funcionamiento del software del microscopio confocal
   1. Abra el software ZEN black 2.3, instale el banco de trabajo de células vivas en la mesa portadora del microscopio.
   2. Haga clic en Localizar (Localizar) Incubación ? Temperatura para ajustar la temperatura a 29oC.
   3. Coloque el plato en el centro de la mesa de trabajo de la célula viva, cubra el pescado con la solución E2¹⁰ con tricaína.
   4. Haga clic en el menú Adquisición, seleccione el modo de escaneado y los láseres necesarios en el menú Configuración inteligente y, a continuación, seleccione Z-Stack y Posición.
   5. Haga clic en el menú Diseñador de experimentos, seleccione Habilitar experimentode bloque múltiple , en el primer bloque, para encontrar la muestra bajo la ampliación baja y, a continuación, cambie a la ampliación alta y, a continuación, deje que el área observada en el centro del campo visual.
   6. Establezca la posición y la información de Z-Stack, seleccione la intensidad láser adecuada, las capas de escaneo y la velocidad de imagen.
   7. Cree un nuevo bloque y repita los pasos anteriores. Después de configurar todos los bloques, establezca el número adecuado de bucles y comience a grabar(Figura 1).

Resultados

Los pasos involucrados en el protocolo de pez cebra se ilustran en la Figura 2. En primer lugar, generamos la construcción pBLK-fabp10a-il34-sv40 en la que il34 fue impulsado por el promotor fabp10a (Figura 2). La construcción fue microinyectada en la etapa unicelular Tg (mpeg1: GFP) embriones de pez cebra que pueden etiquetar macrófagos con embriones GFP y WT que fueron elevados a adultos p...

Discusión

El protocolo descrito aquí nos permite investigar la función de una quimiocina sobre el comportamiento de los macrofagoin vivo y el procedimiento requiere cierta experiencia técnica. En resumen, hay varios pasos críticos para evitar complicaciones en el protocolo: 1) seleccionar una línea transgénica adecuada que muestre una señal transgénica específica y fuerte para etiquetar la célula de interés; 2) seleccionar un tejido apropiado al que se pueda acceder a imágenes y sobreexpresión de genes transgénicos; ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody	Invitrogen	A11055
Anti-Digoxigenin-HRP	perkinelmer	NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody	Abcam	ab6658
Reagent
CaCl2· 2H2O	Sigma	21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent	perkinelmer	NEL745001KT
E2 solution			15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life	10099-133
Formamide	Diamond	A100314
Glycerol	Sigma	V900860
Heparin sodium	Sigma	H3149
Hybridization buffer(HB)			50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Low melting agarose	Sigma	A9414
Methanol	GHTECH	1.17112.023
Methylene blue	Sigma	M9140
MgSO4	Sigma	M2643
Na2HPO4	Sigma	S5136
NaCl	Sigma	S5886
NaHCO3	Sigma	S5761
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS			14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
1×Plus Amplification Diluent	perkinelmer	NEL745001KT
Proteinase K	Fermentas	E00492
20×Saline sodium citrate(SSC)			175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
Sodium citrate	Sigma	A5040
Tricaine	Sigma	E10521
tRNA	Sigma	R6625
Tween20	Sigma	P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40			For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34			For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP)			Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed)			Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34)			Over-expression IL-34 in liver cells