כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

Summary

כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.

Abstract

זברפיש משמשים רבות במחקר בסיסי וביורפואי. קווים הטרנסגניים רבים הזמינים כעת כדי לתייג סוגים שונים של תאים. בשל הגוף עובריים שקוף של דג zebrafish, זה נוח לנו ללמוד את ההשפעה של כימוקין אחד על ההתנהגות של סוג מסוים של תאים בvivo. כאן סיפקנו זרימת עבודה כדי לחקור את הפונקציה של כימוקין על הגירה מקרופאג ב vivo. בנינו ביטוי מופרז רקמות מוגזם כדי overexpression IL-34 והזריק את הפלבאמצע לתוך השלב תא אחד העוברים דגים מקרופאגים שסומנו במפורש על ידי חלבון פלורסנט. לאחר מכן השתמשנו פלואורסצנט הר שלם ב היברידיזציה באתרו ו חיסוני כדי לזהות את התבנית של הביטוי כימוקין ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בסופו של דבר, השתמשנו קונפוקלית וקד חי הדמיה כדי להתבונן ישירות התנהגות מקרופאג בדגים טרנסגניים יציבה כדי ללמוד את הפונקציה של IL-34 על מקרופאגים ב vivo.

Introduction

Zebrafish הוא קטן טרופי קשה עצמות מתוקים דגים מקורו בהודו. בנוגע לשימור הגנים, יש דמיון של 87% לאדם¹. זה יכול לספק לנו תובנות על נושאים קשורים של בני אדם על ידי לימוד רגולציה גנים, חלבון תפקוד והתנהגות התא כגון הגירה, הפצת et.al ב zebrafish. העובר מדגים ניתן להשתמש כדי להתבונן התפתחות של עוברים מוקדם בשלבים שונים לאחר פיגמנט מעכב. בינתיים, זה לוקח רק שלושה חודשים כדי להתפתח בגרות מינית, אז דג הדגים יכול לייצר מאות ביצים כל 4 ימים. מיני גודל, רבייה פשוטה, קיבולת הרבייה חזקה, יתרונות אלה להפוך תרבות דג זברה מאוד חיסכון בחלל, תורם לתרבות בקנה מידה גדול. העכבר מודל היונקים המסורתי יש עלויות תחזוקה גבוהה יותר מאשר zebrafish, ולכן הגבלת היקף העלאת העכבר. בהיבט של התפתחות העובר המוקדם, העובר העכבר קשה להתבונן במצב חי בשל מאפייני התפתחות העובר העכבר ברחם האם. להיפך, עוברי דג מפתחים מבחוץ ושקופים, לכן קל להתבונן מתחת למיקרוסקופ. יתר על כן, דג זברה הוא קל מאוד לבנות מגוון של קווים טרנסגניים למחקר הקשורים לפונקציות גן. כיום, קווים טרנסגניים שונים הניתנים להוספת תוויות לסוגים שונים של תאים. זה מאוד נוח עכשיו לבנות קווים טרנסגניים כדי overexpress נוגדנים במיקומים ספציפיים וללמוד את הפונקציה נוגדנים על התנהגות התא ב-zebrafish.

כאן, סיפקנו זרימת עבודה כדי להשתמש בשורה הטרנסגניים של הדגים כדי לחקור את הפונקציה של IL-34 על התנהגות מקרופאג ב vivo^2,3,4,5,6,7. ראשית, אנו בנינו ביטוי מופרז של הכבד היתר פלבאמצע של הגן il34 והזריק את הפלבאמצע לשלב של תא אחד Tg (MPEG1: gfp) עוברי דגים אשר במפורש מתויג מקרופאגים על ידי חלבון פלורסנט gfp. אז, השתמשנו פלורסנט כל הר באתרו היברידיזציה החיסונית כדי לזהות את התבנית של הביטוי il34 ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בשלבים אלה, הקמנו ובנו אימות של קו הייצור cytokine ויזואלית העריכו את ההשפעות שניתן לראות על התפלגות מקרופאג. לבסוף, כדי לחקור התנהגות מקרופאג בתגובה cytokine, השתמשנו הדמיה חיה קונפוקלית וקד להתבונן ישירות מקרופאג הגירה כדי לאשר את הפונקציה של il34 על הגירה מקרופאג בvivo.

Protocol

הערה: כל הדגימות טופלו על ידי פנילטימאוראה (PTU) מי ביצים כדי לעכב פיגמנט.

1. יצירת מבנים Tg (fabp10a: il34) והזרקת דגים

1. לשכפל את 2.8 kb fabp10a יזם⁸ ו-IL-34 באזורי הקידוד (ensdart 00000126460.3) של דג דג זברה לתוך וקטור pTol2 כדי ליצור את fabp10a il34 בניית. הכנס את המבנה לשלב האחד של התאים Tg (mpeg1: gfp) ו WT של העוברים והדגים יחד עם הטרנספזדאז mrna. העלה את fabp10a-il34 הזריק העוברים WT למבוגר⁹ ולזהות את המייסד הטרנסגניים על ידי היברידיזציה באתרו.
   הערה: ההזרקה של Tol2 לבנות ישירות לתוך טרנסגניים אחרת יכול להיות בעייתי אם הקו השני הטרנסגניים נעשה עם אותו מערכת טרנספסון. תרגול כללי יהיה ליצור קו טרנסגניים בלתי תלוי ולאחר מכן לחצות את הקו החדש עם קו אחר של כתב. דבר זה מבטיח שלא יהיו השפעות של הטרנסגנזה החדשה על-ידי העברה שנוספה בעבר.

2. הר פלורסנט שלם באתרו היברידיזציה (מאחל) לשלב עם כתמים חיסוני

1. קיבוע דגימה
   1. לאסוף עוברים של הזרקה ארעית או יציבה IL-34 העברת קו שחצה עם Tg (mpeg1: GFP) בשלבים הרצויים.
      הערה: עבור מקרה זה, העוברים נאספו ב 4 הפריה פוסט מימדית (dpf). (אם יש צורך) להסיר את chorion על ידי מזרק.
   2. לתקן את העוברים עם 4% פאראפורמלדהיד (בכיתה) ב -4 ° צ' או 2 h בטמפרטורת החדר (RT) (כ-25 ° c).
   3. לשטוף את העוברים עם מלוחים באגירה פוספט בתוספת רצף 20 (PBST) 3x 5 דקות.
   4. הדהים את העוברים בנפרד עם 50% מתנול ב-PBST (50% מתנול/PBST) ו 100% מתנול, 1x 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, לשנות את 100 טרי% המתנול ו לאחסן ב-20 ° צ' (לפחות 2 h).
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
2. הכלאה בדיקה (יום I)
   1. העברה מחדש של העוברים בשלבים הקודמים עם 50% מתנול ב PBST (50% מתנול/PBST), ולאחר מכן לשטוף עם PBST 3x 5 דקות.
   2. לעכל את העוברים עם פרוטאינאז K ב PBST at RT (ריכוז סופי: 10 μg/mL; 1:2000 ב PBST).
      הערה: זמן העיכול תלוי בשלב העוברים: פחות מ 36 h לאחר הפריה (hpf), אין צורך; 36 hpf-2 dpf העובר, 3-5 דקות; 2-3 dpf העובר, 10 דקות; 3-4 dpf העובר, 15 דקות; 4-5 dpf העובר, 15-20 דקות; 5-6 dpf העובר, 20-27 דקות; > 6 dpf העובר, 25-30 דקות at RT (כ 25 ° c).
   3. התעלם מפתרון העיכול ובצע את הקיבעון שוב עם 4% לפחות, עבור 20 דקות ב-RT.
   4. לשטוף את העוברים עם PBST 2x 10 דקות.
   5. להיפטר PBST, לבצע טרום היברידיזציה עם מאגר היברידיזציה מחומם (HB מאגר) ב 65 ° c עבור 5 דקות, למחזר את מאגר HB לתוך השפופרת המקורית.
   6. בצע טרום היברידיזציה עם מאגר HB מחומם חדש ב 65 ° c לפחות 1 h.
   7. לפני החום החללית⁹ (עבור המקרה הזה היה il34 בדיקה, 1 ng/ML) ב 65 ° c לפחות 10 דקות. לאחר מכן מחזר את מאגר ה-HB לתוך השפופרת המקורית. לבצע הכלאה עם המקדח מחומם מראש ב 65 ° c בלילה.
3. נוגדן טיפול (יום II)
   1. מחממים את 50% בתוספת העירוי/2x מלוחים נתרן ציטראט ועוד רצף 20 (SSCT), 2x SSCT, 0.2 x SSCT ב 65 ° c.
   2. למחזר את המקדח לתוך הצינור המקורי ולאחסן את הגשוש ב-20 ° c.
   3. שטוף את העוברים בנפרד עם 50% טופסSSCT; 2x SSCT; 0.2 x SSCT, 3x 20 דקות או 2 x 30 דקות כל אחד ב 65 ° c.
   4. לשטוף את העוברים עם PBST 3x 5 דקות.
   5. לחסום את הדגימות עם 600 μL של חסימת מאגר (5% סרום העובר מסוננים (FBS) ב PBST) עבור 1 h ב RT.
   6. להוסיף 400 μL של אנטי digoxigenin-HRP הפתרון הנוגדן (1:1000-1:2000 במאגר חסימת) ו הדגירה של העוברים ב 4 ° c לילה. אם אותות חלשים, להשתמש 1:500 דילול של נוגדן.
4. צביעה ונוגדן ראשי הדגירה (יום III)
   1. להסיר את הנוגדן; לשטוף את העוברים עם PBST, 6x 20 דקות ב RT.
   2. לשטוף את המדגם עם 30 μL של 1x פלוס הגברה דילול עבור 5 דקות ב RT.
   3. להיפטר הדילול על ידי ליטוף; לדלל את Fluorophore מניות הפתרון המלאי (Cyanine 3 פלוס מגיב הגברה (Cy3) או Cyanine 5 פלוס הגברה מגיב (Cy5), עבור מקרה זה Cy3 שימש) 1:50 ב 1x פלוס הגברה מדלל לעשות את Fluorophore הפתרון העבודה. הכינו 50-100 μL של פתרון עבודה עבור כל דוגמה.
   4. מודטה את המדגם של הפתרון העובד Fluorophore טירמידה עבור 5-15 דקות בחושך ב-RT. אם האותות חלשים, הארך את זמן הדגירה ל-30 דקות.
   5. עצור את התגובה על ידי שינוי פתרון העבודה עם PBST ובדוק את האותות.
   6. לשטוף את העוברים עם PBST 3x 10 דקות ב RT.
   7. מודאת המדגם עם הנוגדן העיקרי ב 4 ° c לילה. במקרה זה, השתמש נוגדן אנטי GFP כמו הנוגדן העיקרי.
5. מכתים נוגדן משני (יום IV)
   1. לשטוף את העוברים עם PBST עבור 4x 30 דקות.
   2. מודיית את העוברים עם נוגדן משני ב 4 ° c לילה. במקרה זה, להשתמש באלקסה 488-נוגדן נגד עז כמו הנוגדן המשני.
6. צלם תמונות (יום חמישי)
   1. לשטוף את העוברים עם PBST 3x 10 דקות ב RT.
   2. לאחסן את העוברים ב 70% גליצרול בחשיכה ב -4 ° c ללילה או-20 ° צ' למשך זמן רב יותר.

3. הדמיה חיה

1. בחירת דוגמה
   הערה: השתמש בתמונה חיה כדי להתבונן ישירות אם מקרופאגים של Tg (fabp10a: Il34; fabp10a: dsred; mpeg1: gfp) דג היה להגר לתוך הכבד תחת IL-34 אינדוקציה במהלך 3-3.5 dpf. כאן קו הטרנסגניים Tg (Fabp10a-dsred) משמש כדי לתייג את אזור הכבד ולהפוך אותו לגלוי, כדי להקל על לוקליזציה של הכבד כדי לקבוע אם מקרופאגים להגר לתוך הכבד. לפני הדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לבחור את ה-DsRed ו-GFP כפול עוברים חיוביים.
2. הרכבה על דגים
   1. השתמש באמבט מתכת כדי לחמם 1 מ ל של 1% ההיתוך נמוך התכה עד מעל 90 ° צ' כדי להמיס לחלוטין את זה.
   2. לאחר המסת ההיתוך נמוכה הוא מקורר טמפרטורת הגוף, להוסיף 50 μL של 0.2% tricaine, ו לערבב אחיד tricaine עם agarose.
   3. הזיזו את העוברים הכהקטנים לצלוחית קטנה שנטענה עם שקופית כיסוי בתחתית, הסירו את המים שמסביב, הורידו לאט את האגקם הנמוך הנמס על העוברים, הציבו בזהירות את מיקום הדג לפני שהאגקם מתחזק, שמרו על אזור הכבד קרוב ל שקופית הכיסוי בתחתית המנה.
   4. לאחר המסת ההיתוך נמוך הוא מתחזק, בזהירות לכסות את זה עם שכבה נוספת של agarose כדי לחזק אותו.
   5. מניחים את המנה על השולחן המוביל במיקרוסקופ, כיסו את הדג בפתרון E2¹⁰ עם tricaine והתחלת הדמיה.
3. הפעלת תוכנה של המיקרוסקופ הקונקלית
   1. פתח את התוכנה זן שחור 2.3 , להתקין את העבודה התא חי על הטבלה נושאת המיקרוסקופ.
   2. לחץ על אתר | דגירה | טמפרטורה לקביעת טמפרטורה 29 ° c.
   3. מניחים את המנה במרכז העבודה של התא החי, כיסו את הדג בפתרון E2¹⁰ עם טריקיין.
   4. לחצו על תפריט הרכישה , בחרו במצב הסריקה הנדרש ולייזרים בתפריט ' הגדרה חכמה ', ולאחר מכן בחרו Z-מחסנית ומיקום.
   5. לחץ על תפריט מעצב הניסוי , בחר באפשרות הפעל ניסוי בלוק מרובה, בבלוק הראשון, כדי למצוא את המדגם תחת ההגדלה הנמוכה, ולאחר מכן עבור להגדלה הגבוהה, הנח לאזור הנצפה במרכז השדה החזותי.
   6. הגדר את מידע המיקום וערימת ה-Z, בחר את עוצמת הלייזר המתאימה, סריקת שכבות ומהירות הדמיה.
   7. צור בלוק חדש וחזור על השלבים שלעיל. לאחר הגדרת כל הבלוקים, להגדיר את המספר המתאים של לולאות ולהתחיל הקלטה (איור 1).

תוצאות

השלבים המעורבים בפרוטוקול הדגים מאוירים באיור 2. ראשית, יצרנו את pBLK-fabp10a-il34-sv40 המבנה שבו il34 היה מונע על ידי היזם fabp10a (איור 2). המבנה היה microinjected לתוך תא אחד בשלב Tg (mpeg1: gfp) דג זברה עוברים אשר יכול לתייג מקרופאגים עם עוברי gfp ו W...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין על ההתנהגות של macrophagein vivo וההליך דורש מומחיות טכנית מסוימת. לסיכום, ישנם מספר שלבים קריטיים כדי למנוע סיבוכים בפרוטוקול: 1) לבחור קו טרנסגניים מתאים אשר מציג אות הטרנסגניים ספציפיים וחזקים כדי לתייג את תא הריבית; 2) לבחור את הרקמה ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody	Invitrogen	A11055
Anti-Digoxigenin-HRP	perkinelmer	NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody	Abcam	ab6658
Reagent
CaCl2· 2H2O	Sigma	21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent	perkinelmer	NEL745001KT
E2 solution			15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life	10099-133
Formamide	Diamond	A100314
Glycerol	Sigma	V900860
Heparin sodium	Sigma	H3149
Hybridization buffer(HB)			50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Low melting agarose	Sigma	A9414
Methanol	GHTECH	1.17112.023
Methylene blue	Sigma	M9140
MgSO4	Sigma	M2643
Na2HPO4	Sigma	S5136
NaCl	Sigma	S5886
NaHCO3	Sigma	S5761
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS			14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
1×Plus Amplification Diluent	perkinelmer	NEL745001KT
Proteinase K	Fermentas	E00492
20×Saline sodium citrate(SSC)			175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
Sodium citrate	Sigma	A5040
Tricaine	Sigma	E10521
tRNA	Sigma	R6625
Tween20	Sigma	P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40			For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34			For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP)			Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed)			Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34)			Over-expression IL-34 in liver cells