JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Чтобы проверить влияние хемокина на набор макрофагов in vivo, для обнаружения эктопического выражения хемокина использовалась вся монтация на макрофаг. Для наблюдения макрофагов в режиме реального времени использовалась живая визуализация.

Аннотация

Зебрафиш широко используется в фундаментальных и биомедицинских исследованиях. Многие трансгенные линии зебры в настоящее время доступны для обозначения различных типов клеток. Благодаря прозрачному эмбриональному телу зебры, нам удобно изучать влияние одного хемокина на поведение определенного типа клеток in vivo. Здесь мы предоставили рабочий процесс для изучения функции хемокина по миграции макрофагов in vivo. Мы построили ткани конкретных переэкспрессии плазмид для переэкспресса IL-34 и вводили плазмид в одной-клеточной стадии трансгенных эмбрионов рыб, макрофаги которых были специально помечены флуоресцентным белком. Затем мы использовали целые флуоресцентные установки на месте гибридизации и иммуно-стинеризм для обнаружения картины экспрессии хемокина и количество или расположение макрофагов. Инъекционные эмбрионы WT были подняты для создания стабильной трансгенной линии. Наконец, мы использовали конфокальные живые изображения, чтобы непосредственно наблюдать за поведением макрофагов в стабильных трансгенных рыб для изучения функции IL-34 на макрофагах in vivo.

Введение

Зебрафиш — небольшая тропическая пресноводная рыба, зародившаяся в Индии. Что касается сохранения генов, зебрафиш имеют сходство 87% с человеком1. Он может дать нам представление о смежных предметах человека, изучая регуляцию генов, функцию белка и поведение клеток, такие как миграция, пролиферация et.al у зебры. Эмбрион зебры может быть использован для наблюдения за развитием ранних эмбрионов на разных стадиях после ингибирования пигмента. Между тем, это занимает всего три месяца для зебры развиваться в половой зрелости, то зебрафиш может производить сотни яиц каждые 4 дня. Мини-размер, простое разведение, сильная репродуктивная способность, эти преимущества делают культуру зебры очень экономной, способствующей крупномасштабной культуре. Традиционная модель мыши млекопитающих имеет более высокие расходы на техническое обслуживание, чем зебрафиш, таким образом, ограничивая масштабы поднятия мыши. В аспекте раннего развития эмбриона, эмбрион мыши трудно наблюдать в живом состоянии из-за характеристик развития эмбриона мыши в утробе матери. Напротив, эмбрионы зебры развиваются внешне и прозрачны, поэтому их легко наблюдать под микроскопом. Кроме того, зебрафиш очень легко построить различные трансгенные линии для связанных исследований функции генов. В настоящее время, различные трансгенные линии зебры доступны для обозначения различных типов клеток. Это очень удобно сейчас, чтобы построить трансгенные линии для переэкспресса хемокинов в конкретных местах и изучить функции хемокинов на поведение клеток у зебры.

Здесь мы предоставили рабочий процесс для использования трансгенной линии зебры для исследования функции IL-34 на поведение макрофагов in vivo2,3,4,5,6,7. Во-первых, мы построили печени конкретных переэкспрессии плазмид гена il34 и вводили плазмид в одноклеточной стадии Tg (mpeg1: GFP) рыбных эмбрионов, которые специально помечены макрофагов флуоресцентным белком GFP. Затем мы использовали целые флуоресцентные установки на месте гибридизации и иммуно-стинеризм для обнаружения картины экспрессии il34 и числа или расположения макрофагов. Инъекционные эмбрионы WT были подняты для создания стабильной трансгенной линии. В этих шагах мы установили и проверили линию производства цитокинов и визуально оценили эффекты, которые можно увидеть на распределении макрофагов. Наконец, для изучения поведения макрофагов в ответ на цитокин, мы использовали конфокальные живые изображения, чтобы непосредственно наблюдать миграцию макрофагов, чтобы подтвердить функцию il34 на миграции макрофагов in vivo.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы были обработаны фенилтиуреа (PTU) яичной воды для ингибирования пигмента.

1. Поколение Tg (fabp10a:il34) Трансгенные конструкции и инъекции рыбы

  1. Клон 2,8 кб fabp10a промоутер8 и Ил-34 кодирования регионов (ENSDART00000126460.3) зебры в вектор pTol2 для создания fabp10a-il34 конструкции. Впрысните конструкции в одноклеточную стадию Tg (mpeg1: GFP)и WT эмбрионы рыб вместе с транспозазом мРНК. Поднимите fabp10a-il34 вводили эмбрионы WT взрослым9 и определите трансгенного основателя по гибридизации на месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция конструкции Tol2 непосредственно в другой трансгенной может быть проблематичной, если другая трансгенная линия производится с той же транспозонной системой. Общая практика будет заключаться в том, чтобы сделать независимую трансгенную линию и впоследствии пересечь новую линию с другой линией репортера. Это гарантирует, что не будет никакого влияния нового трансгенеза на ранее вставленный трансген.

2. Флуоресцентная целая гора на ситу Гибридизация (WISH) В сочетании с иммуностоингом

  1. Фиксация образцов
    1. Сбор эмбрионов переходной инъекции или стабильной трансгенной линии IL-34, которая пересекалась с Tg (mpeg1: GFP) на желаемых стадиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого случая эмбрионы были собраны при 4 d после оплодотворении (dpf). (При необходимости) удалите хор шприц шприцем.
    2. Исправить эмбрионы с 4% параформальдегида (PFA) на ночь при температуре 4 кв или 2 ч при комнатной температуре (RT) (около 25 градусов по Цельсию).
    3. Вымойте эмбрионы с фосфатами буферного солья плюс Tween 20 (PBST) 3x 5 мин.
    4. Обезвоживать эмбрионы отдельно с 50% метанола в PBST (50% метанол / PBST) и 100% метанола, 1x 5 мин каждый. Затем переоденьте на свежий 100% метанол и храните при -20 градусов по Цельсию (не менее 2 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
  2. Гибридизация зонда (День I)
    1. Увлажните эмбрионы в предыдущих шагах с 50% метанолом в PBST (50% метанол / PBST), затем мыть с PBST 3x 5 мин.
    2. Дайджест эмбрионов с протеиназа K в PBST на RT (окончательная концентрация: 10 мкг/мл; 1:2000 в PBST).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время пищеварения зависит от стадии эмбрионов: менее 36 ч после оплодотворения (hpf), нет необходимости; 36 л.с. 2 dpf эмбриона, 3-5 мин; 2-3 dpf эмбриона, 10 мин; 3-4 dpf эмбриона, 15 мин; 4-5 dpf эмбриона, 15-20 мин; 5-6 dpf эмбриона, 20-27 мин; 6 dpf эмбриона, 25-30 мин на RT (около 25 градусов по Цельсию).
    3. Откажитесь от раствора пищеварения и выполнить фиксацию снова с 4% PFA, в течение 20 минут на RT.
    4. Вымойте эмбрионы с PBST 2x 10 мин.
    5. Откажитесь от PBST, выполните предварительную гибридизацию с нагретым буфером гибридизации (HB буфер) при 65 градусах По Цельсия в течение 5 минут, утилизировать буфер HB в исходную трубку.
    6. Выполните предварительную гибридизацию с новым нагретым буфером HB при уровне 65 градусов по Цельсию по крайней мере 1 ч.
    7. Предварительно нагреть зонд9 (для этого случая был зонд il34, 1 ng/mL) на 65 c по крайней мере 10 min. Затем переработать буфер HB в исходную трубку. Выполните гибридизацию с предварительно нагретым зондом при 65 градусах Цельсия в одночасье.
  3. Лечение антителами (День II)
    1. Предварительно нагреть 50% формамид/2x солен натрия цитрат плюс Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0.2x SSCT при 65 градусах По Цельсия.
    2. Утилизировать зонд в исходную трубку и хранить зонд при -20 градусов по Цельсию.
    3. Вымойте эмбрионы отдельно с 50% формамида/2x SSCT; 2x SSCT; 0.2x SSCT, 3x 20 мин или 2x 30 мин каждый при 65 градусах По Цельсию.
    4. Вымойте эмбрионы с PBST 3x 5 мин.
    5. Блокируйте образцы с 600 злителком блокирующего буфера (5% фильтрованную сыворотку крупного рогатого скота плода (FBS) в PBST) на 1 ч на RT.
    6. Добавьте 400 зл антител Anti-digoxigenin-HRP (1:1,000-1:2,000 в блокирующий буфер) и инкубировать эмбрионы при 4 градусах Цельсия за одну ночь. Если сигналы слабы, используйте 1:500 разбавления антител.
  4. Окраска и первичное инкубирование антител (День III)
    1. Удалите антитела; мыть эмбрионы с PBST, 6x 20 мин на RT.
    2. Промыть образец с 30 зл 1x Плюс Усиление Разбавитель в течение 5 минут на RT.
    3. Отбросьте разбавив разбавив трубацией; разбавлять флюорофор тирамид ный запас решение (Cyanine 3 Плюс усиление реагент (Cy3) или Cyanine 5 Плюс усиление реагент (Cy5), для этого случая Cy3 был использован) 1:50 в 1x Plus Усиление Диалюент, чтобы сделать флюорофор тирамид Рабочее решение. Подготовьте 50-100 л рабочего раствора для каждого образца.
    4. Инкубировать образец в флюорофоре Тирамид Рабочее решение в течение 5-15 мин в темноте на RT. Если сигналы слабы, утяните время инкубации до 30 мин.
    5. Остановите реакцию, изменив рабочее решение с помощью PBST и изучите сигналы.
    6. Вымойте эмбрионы с PBST 3x 10 мин на RT.
    7. Инкубировать образец с первичными антителами при 4 градусах Цельсия в одночасье. В этом случае используйте антитела Коза-Анти-GFP в качестве основного антитела.
  5. Вторичное окрашивание антител (День IV)
    1. Вымойте эмбрионы с PBST в течение 4x 30 мин.
    2. Инкубировать эмбрионы вторичными антителами при 4 градусах Цельсия в течение ночи. Для этого случая используйте антитела Alexa 488-Anti-Goat в качестве вторичного антитела.
  6. Сфотографируйте (День V)
    1. Вымойте эмбрионы с PBST 3x 10 мин на RT.
    2. Храните эмбрионы в 70% глицерола в темноте при 4 градусах Цельсия на ночь или -20 градусов по Цельсию дольше.

3. Live Изображений

  1. Выбор примеров
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Используйте живое изображение, чтобы непосредственно наблюдать ли макрофаги Tg (fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP) рыба будет мигрировать в печень под IL-34 индукции в течение 3-3,5 dpf. Здесь Tg (fabp10a-DsRed)трансгенная линия используется для обозначения области печени и сделать ее видимой, чтобы облегчить локализацию печени и определить, мигрируют ли макрофаги в печень. Перед визуализацией используйте флуоресцентный микроскоп для выбора двойных положительных эмбрионов DsRed и GFP.
  2. Установка рыбы
    1. Используйте металлическую ванну для нагрева 1 мл 1% низкой плавления агарозы выше 90 градусов по Цельсию, чтобы полностью расплавить его.
    2. После низкого плавления агарозы охлаждается до температуры тела, добавьте 50 л 0,2% трикаина и равномерно смешать трикаин с агарозой.
    3. Переместите обезболированные эмбрионы в небольшое блюдо, установленное с крышкой слайдна на дне, удалить окружающую воду, медленно падение низкого плавления агарозы на эмбрионы, тщательно установить положение рыбы до агарозы затвердевает, держать область печени близко к крышка слайд на дне блюда.
    4. После низкого плавления агарозы затвердевает, тщательно покрыть его другим слоем агарозы, чтобы укрепить его.
    5. Поместите блюдо на конфокальный микроскоп несущий стол, накройте рыбу раствором E210 с трикаином и начните визуализацию.
  3. Программное обеспечение работы конфокального микроскопа
    1. Откройте программное обеспечение zen black 2.3, установите рабочую скамейку для живых клеток на таблицу носителя микроскопа.
    2. Нажмите Найдите-сайт Инкубация Температура, чтобы установить температуру до 29 градусов по Цельсию.
    3. Поместите блюдо в центр живой рабочей скамейке клетки, накройте рыбу раствором E210 с трикаином.
    4. Нажмите меню Приобретения, выберите необходимый режим сканирования и лазеры в меню Smart Setup, а затем выберите меню «Стек» и «Позиция».
    5. Нажмите меню Experiment Designer, выберите Включить Multi Block Эксперимент, в первом блоке, чтобы найти образец под низким увеличением, а затем переключиться на высокое увеличение, пусть наблюдаемая область в центре поля зрения.
    6. Установите позицию и информацию о Стеке, выберите соответствующую интенсивность лазера, слои сканирования и скорость изображения.
    7. Создайте новый блок и повторите вышеперечисленные шаги. После настройки всех блоков установите соответствующее количество петель и начните запись(рисунок 1).

Результаты

Шаги, участвующие в протоколе зебры, иллюстрируются на рисунке 2. Во-первых, мы создали pBLK-fabp10a-il34-sv40 конструкции, в которой il34 был обусловлен fabp10a промоутер (Рисунок 2). Конструкция была микровведена в одноклеточную стадию Tg ...

Обсуждение

Описанный здесь протокол позволяет исследовать функцию хемокина о поведении макрофагеина vivo и процедура требует некоторых технических знаний. Таким образом, существует несколько важных шагов, чтобы избежать осложнений в протоколе: 1) выбрать подходящую трансгенную линию, которая пок?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Jingrong Пэн для обмена Tg (fabp10a: DsRed) трансгенной линии; Д-р Зилонг Вэнь для обмена Tg (mpeg1: GFP) трансгенных линий; Д-р Коити Каваками за предоставление вектора pTol2. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31771594), проектами научно-технического плана Гуандун (2019A030317001) и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (D2191450).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibodyInvitrogenA11055
Anti-Digoxigenin-HRP perkinelmerNEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibodyAbcamab6658
Reagent
CaCl2· 2H2OSigma21097
Cyanine 3 Plus Amplification ReagentperkinelmerNEL745001KT
E2 solution15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
Fetal Bovine Serum (FBS)Life10099-133
FormamideDiamondA100314
Glycerol SigmaV900860
Heparin sodiumSigmaH3149
Hybridization buffer(HB)50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Low melting agaroseSigmaA9414
MethanolGHTECH1.17112.023
Methylene blue SigmaM9140
MgSO4SigmaM2643
Na2HPO4SigmaS5136
NaClSigmaS5886
NaHCO3 SigmaS5761
Paraformaldehyde (PFA)Sigma158127Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU)SigmaP7629
1×Plus Amplification DiluentperkinelmerNEL745001KT
Proteinase K FermentasE00492
20×Saline sodium citrate(SSC)175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
Sodium citrateSigmaA5040
TricaineSigmaE10521
tRNA SigmaR6625
Tween20SigmaP2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP)Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed)Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34)Over-expression IL-34 in liver cells

Ссылки

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
  4. Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
  5. Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
  6. Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
  7. Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
  8. Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
  9. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  10. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

151IL 34

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены