Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Özet

Bir kemokinin in vivo makrofaj alımı üzerindeki etkisini test etmek için, yerinde hibridizasyondaki tüm montaj, kemokinin ektopik ekspresyonunu saptamak için kullanıldı ve makrofajları etiketlemek için immünboyama kullanıldı. Makrofaj göçünün gerçek zamanlı gözlemi için canlı görüntüleme kullanıldı.

Özet

Zebra balıkları temel ve biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Birçok zebra balığı transgenik hatları şu anda hücrelerin çeşitli etiketlemek için kullanılabilir. Zebra balığının saydam embriyonik gövdesi sayesinde, bir kemokinin in vivo hücrelerinin belirli bir türünün davranışı üzerindeki etkisini incelemek bizim için uygundur. Burada in vivo makrofaj göçü üzerine bir kemokin işlevini araştırmak için bir iş akışı sağladı. IL-34'ü aşırı ekspresye etmek için dokuya özgü aşırı ekspresyon plazmidi yaptık ve plazmidi makrofajları özellikle floresan proteinle etiketlenmiş tek hücreli transgenik balık embriyolarına enjekte ettik. Daha sonra keokin ekspresyonu paterni ve makrofajların sayısını veya yerini saptamak için yerinde hibridizasyon ve immünboyama tüm montaj floresan kullanılır. Enjekte edilen WT embriyoları kararlı bir transgenik çizgi oluşturmak için yetiştirildi. Son olarak, in vivo makrofajlar üzerinde IL-34 işlevini incelemek için doğrudan kararlı transgenik balık makrofaj davranışı gözlemlemek için konfokal canlı görüntüleme kullanılır.

Giriş

Zebra balığı Hindistan kökenli küçük bir tropikal sert kemikli tatlı su balığıdır. Gen koruma ile ilgili olarak, zebra balıkları insan^1%87 benzerlik var. Zebra balıklarında gen regülasyonu, protein fonksiyonu ve hücre davranışı, et.al gibi hücre davranışlarını inceleyerek bize insanla ilgili konular hakkında bilgi verebilir. Zebrabalığı embriyosu pigmentini inhibe ettikten sonra farklı evrelerde erken embriyoların gelişimini gözlemlemek için kullanılabilir. Bu arada, zebra balıklarının cinsel olgunluğa dönüşmesi sadece üç ay sürer, o zaman zebra balığı her 4 günde bir yüzlerce yumurta üretebilir. Mini boyutlu, basit üreme, güçlü üreme kapasitesi, bu avantajlar zebra balığı kültürünü çok yer tasarrufu sağlar, büyük ölçekli kültüre elverişli dir. Geleneksel memeli model fare zebra balığıdaha yüksek bakım maliyetleri vardır, bu nedenle fare yetiştirme ölçeğini sınırlayan. Erken embriyo gelişimi açısından, fare embriyosu anne rahminde fare embriyo gelişiminin özellikleri nedeniyle canlı durumda gözlemlemek zordur. Aksine, zebra balığı embriyoları dışarıdan gelişir ve saydamdır, bu nedenle mikroskop altında gözlemlemek kolaydır. Ayrıca, zebra balığı ilgili gen fonksiyonu araştırma için transgenik çizgiler çeşitli inşa etmek çok kolaydır. Şu anda, çeşitli zebra balığı transgenik hatları hücrelerin farklı etiket mevcuttur. Kemokinleri belirli yerlerde aşırı eksprese etmek ve keokinlerin zebra balıklarındaki hücre davranışı üzerine çalışmasını incelemek için transgenik çizgiler oluşturmak artık çok uygundur.

Burada, il-34'ün in vivo^2,3,⁴,^5,6,7makrofaj davranışı üzerindeki işlevini araştırmak için zebra balığı transgenik hattını kullanmak için bir iş akışı sağladık. İlk olarak, il34 geninin karaciğere özgü aşırı ekspresyon plazmidini inşa ettik ve plazmidi tek hücreli evre Tg'ye (mpeg1: GFP) enjekte ettik ve bu da makrofajları özellikle floresan protein GFP ile etiketledi. Daha sonra, il34 ekspresyonunun desenini ve makrofajların sayısını veya yerini tespit etmek için yerinde hibridizasyon ve immünboyamada tüm montaj floresanını kullandık. Enjekte edilen WT embriyoları kararlı bir transgenik çizgi oluşturmak için yetiştirildi. Bu adımlarda sitokin üreten çizgiyi oluşturduk ve doğruladık ve makrofaj dağılımında görülebilecek etkileri görsel olarak değerlendirdik. Son olarak, sitokine yanıt olarak makrofaj davranışını araştırmak için, in vivo makrofaj göçünde il34'ün işlevini doğrulamak için makrofaj göçüne doğrudan gözlemlemek için konfokal canlı görüntüleme kullandık.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Tüm örnekler pigmentini inhibe etmek için fenilthiourea (PTU) yumurta suyu ile tedavi edildi.

1. Tg Üretimi (fabp10a:il34) Transgenik Yapılar ve Balık Enjeksiyonu

1. Clone 2.8 kb fabp10a organizatörü⁸ ve IL-34 kodlama bölgeleri (ENSDART00000126460.3) pTol2 vektör içine fabp10a-il34 inşa oluşturmak için zebra balığı. Yapıları transposase mRNA ile birlikte tek hücreli evre Tg (mpeg1: GFP)ve WT balık embriyolarına enjekte edin. Fabp10a-il34 enjekte wt embriyoları yetişkin⁹ yükseltmek ve in situ hibridizasyon tarafından transgenik kurucusu belirlemek.
   NOT: Diğer transgenik hat aynı transpozon sistemi ile yapılırsa Tol2 yapısının doğrudan başka bir transgenik içine enjeksiyonu sorunlu olabilir. Genel bir uygulama bağımsız bir transgenik çizgi yapmak ve daha sonra başka bir muhabir hattı ile yeni çizgiyi geçmek olacaktır. Bu, yeni transgenezin daha önce eklenmiş bir transgen üzerinde hiçbir etkisi olmamasını sağlar.

2. Floresan Tüm Mount In Situ Hibridizasyon (WISH) Immunostaining ile birleştirin

1. Örnek fiksasyon
   1. İstenilen aşamalarda Tg (mpeg1: GFP) ile geçen geçici enjeksiyon veya kararlı IL-34 transgenik hattının embriyolarını toplayın.
      NOT: Bu durumda embriyolar 4 döl sonrası döllenme (dpf) olarak toplandı. (Gerekirse) şırınga ile chorion çıkarın.
   2. Embriyoları gece boyunca 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) veya oda sıcaklığında (RT) (yaklaşık 25 °C) 2 saat olarak düzeltin.
   3. Embriyoları fosfat tamponlu tuzlu artı Ara 20 (PBST) 3x 5 dk ile yıkayın.
   4. PBST%50 metanol (%50 Metanol/PBST) ve %100 metanol, her biri 1x 5 dk ile embriyoları ayrı ayrı kurutun. Daha sonra taze %100 metanol'e değiştirin ve -20 °C'de (en az 2 saat) saklayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
2. Sonda hibridizasyonu (Gün I)
   1. PBST% 50 metanol ile önceki adımlarda embriyolar rehydrate (%50 Metanol / PBST), sonra PBST 3x 5 dk ile yıkayın.
   2. RT'de PBST'de Proteinaz K ile embriyoları sindirin (son konsantrasyon: 10 μg/mL; PBST'de 1:2000).
      NOT: Sindirim süresi embriyoların evreye bağlıdır: Az 36 h sonrası döllenme (hpf), gerek yok; 36 hpf-2 dpf embriyo, 3-5 dk; 2-3 dpf embriyo, 10 dk; 3-4 dpf embriyo, 15 dk; 4-5 dpf embriyo, 15-20 dk; 5-6 dpf embriyo, 20-27 dk; >6 dpf embriyo, RT'de 25-30 dk (yaklaşık 25 °C).
   3. Sindirim çözeltisini atın ve RT'de 20 dk boyunca %4 PFA ile fiksasyon yapın.
   4. Embriyoları PBST 2x 10 dk ile yıkayın.
   5. PBST atın, ısıtmalı hibridizasyon tamponu ile ön hibridizasyon gerçekleştirmek (HB tampon) 65 °C için 5 dakika, orijinal tüp içine HB tampon geri dönüşüm.
   6. 65 °C'de yeni ısıtmalı HB tamponu ile en az 1 saat önceden hibridizasyon gerçekleştirin.
   7. Probu önceden ısıtın⁹ (bu durumda bir il34 prob, 1 ng/mL) 65 °C'de en az 10 dk. Sonra HB tamponorijinal tüp içine geri dönüşüm. Bir gecede 65 °C'de önceden ısıtılmış sonda ile hibridizasyon yapın.
3. Antikor tedavisi (Gün II)
   1. %50 formamid/2x tuzlu sodyum sitrat artı Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0.2x SSCT'yi 65 °C'de Önceden ısıtın.
   2. Sondayı orijinal tüpe geri dönüştürün ve sondayı -20 °C'de saklayın.
   3. Embriyoları %50 formamid/2x SSCT ile ayrı ayrı yıkayın; 2x SSCT; 0.2x SSCT, 3x 20 dk veya 2x 30 dk her biri 65 °C'de.
   4. Embriyoları PBST 3x 5 dk ile yıkayın.
   5. 600 μL bloke tampon (PBST'de %5 filtrelenmiş fetal sığır serumu (FBS) ile) numuneleri RT'de 1 saat boyunca bloke edin.
   6. 400 μL Anti-digoksigenin-HRP antikor çözeltisi ekleyin (1:1,000-1:2,000 bloke tampon) ve embriyoları bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Sinyaller zayıfsa, 1:500'lük antikor seyreltme kullanın.
4. Boyama ve primer antikor kuluçka (Gün III)
   1. Antikor çıkarın; Embriyoları PBST ile yıkayın, RT'de 6x 20 dk.
   2. Numuneyi RT'de 5 dakika boyunca 30 μL 1x Plus Amplifikasyon Dilüent ile durula.
   3. Dışarı boru çekerek dilüent atın; seyreltik Florofor Tyramide Stok Solüsyonu (Siyanin 3 Plus Amplifikasyon Reaktifi (Cy3) veya Siyanin 5 Artı Amplifikasyon Reaktifi (Cy5), Bu durumda Cy3 kullanılmıştır) 1:50 1x Plus Amplifikasyon Diluent Florofor Tyramide Çalışma Çözümü yapmak için. Her numune için 50-100 μL çalışma çözeltisi hazırlayın.
   4. Rt karanlıkta 5-15 dakika florofor Tyramide Çalışma Solüsyonu örnek kuluçka. Sinyaller zayıfsa, kuluçka süresini 30 dakikaya kadar uzatın.
   5. PBST ile çalışma çözümlerini değiştirerek reaksiyonu durdurun ve sinyalleri inceleyin.
   6. Rt'de Embriyoları PBST 3x 10 dk ile yıkayın.
   7. Numuneyi bir gecede 4 °C'de birincil antikorla kuluçkaya yatırın. Bu durumda, birincil antikor olarak Keçi-Anti-GFP antikor kullanın.
5. Sekonder antikor boyama (Gün IV)
   1. 4x 30 dk için PBST ile embriyoları yıkayın.
   2. Embriyoları bir gecede 4 °C'de ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Bu durumda, ikincil antikor olarak Alexa 488-Anti-Keçi antikor kullanın.
6. Fotoğraf çekme (Gün V)
   1. Rt'de Embriyoları PBST 3x 10 dk ile yıkayın.
   2. Embriyoları bir gecede 4 °C veya -20 °C'de %70 gliserol de karanlıkta saklayın.

3. Canlı Görüntüleme

1. Örnek seçme
   NOT: Tg makrofajlarının(fabp10a: il34: fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP)balığının 3-3,5 dpf sırasında IL-34 indüksiyonu altında karaciğere girip girmeyeceğini doğrudan gözlemlemek için canlı görüntüyü kullanın. Burada Tg (fabp10a-DsRed)transgenik hattı karaciğer bölgesini etiketlemek ve görünür hale getirmek, karaciğerin lokalizasyonunu kolaylaştırmak ve makrofajların karaciğere göç edip etmediğini belirlemek için kullanılır. Görüntülemeden önce, DsRed ve GFP çift pozitif embriyoları seçmek için floresan mikroskobu kullanın.
2. Balık montajı
   1. 1 mL%1 düşük erime agarose'u 90 °C'nin üzerine çıkarmak için metal banyo kullanın.
   2. Düşük erime agarose vücut sıcaklığına soğutulduktan sonra, 50 μL% 0.2 tricaine ekleyin ve düzgün agarose ile tricaine karıştırın.
   3. Anestezili embriyoları alttabakada bir kapak kaydırağı ile monte edilmiş küçük bir tabağa taşıyın, çevredeki suyu çıkarın, embriyoların üzerinde yavaşça eriyen agarose'u bırakın, agarose katılaşmadan önce balığın konumunu dikkatlice ayarlayın, karaciğer bölgesini yakın tutun yemeğin altındaki kapak slayt.
   4. Düşük erime agarose katılaşmış sonra, dikkatle agarose başka bir tabaka ile kapsayacak şekilde güçlendirmek için.
   5. Kabı konfokal mikroskop taşıyıcı masasına yerleştirin, balığı E2 solüsyonu¹⁰ ile tricaine ile kaplayın ve görüntülemeye başlayın.
3. Konfokal mikroskobun yazılım çalışması
   1. ZEN black 2.3 yazılımını açın, canlı hücre tezgahını mikroskop taşıyıcı tablosuna törleyin.
   2. Bul 'u tıklatın | Kuluçka | Sıcaklığı 29 °C'ye ayarlamak için.
   3. Canlı hücre çalışma tezgahının ortasına çanak yerleştirin, tricaine ile E2 çözeltisi¹⁰ ile balık kapağı.
   4. Edinme menüsüne tıklayın, Akıllı Kurulum menüsünde gerekli tetkik modunu ve lazerleri seçin, ardından Z-Stack ve Pozisyon'useçin.
   5. Deney Tasarımcısı menüsünü tıklatın, ilk blokta Çoklu Blok Deneyi Etkinleştir'iseçin, düşük büyütme altında örneği bulmak için, ardından yüksek büyütmeye geçin, görme alanının merkezindeki gözlemlenen alana izin verin.
   6. Konumu ve Z-Stack bilgilerini ayarlayın, uygun lazer yoğunluğunu, tarama katmanlarını ve görüntüleme hızını seçin.
   7. Yeni bir blok oluşturun ve yukarıdaki adımları yineleyin. Tüm blokları ayarladıktan sonra, uygun döngü sayısını ayarlayın ve kayıt başlatmayı başlatın (Şekil 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Zebra balığı protokolünde yer alan adımlar Şekil 2'degösterilmiştir. İlk olarak, il34'ün fabp10a organizatörü tarafından yönlendirildiği pBLK-fabp10a-il34-sv40 yapısını oluşturduk (Şekil 2). Yapı, transgenik kararlı hat oluşturmak için yetişkinlere yetiştirilen GFP ve WT embriyoları ile makrofajları etiketleyebilen tek hücreli evre Tg (mpeg1: GFP)zebra balığı emb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol bize makrofajin vivo davranışı üzerinde bir kemokin işlevini araştırmak için izin verir ve prosedür bazı teknik uzmanlık gerektirir. Özetle, protokoldeki komplikasyonları önlemek için birkaç kritik adım vardır: 1) ilgi hücresini etiketlemek için spesifik ve güçlü transgenik sinyal gösteren uygun bir transgenik çizgi seçin; 2) görüntüleme ve transgenik gen aşırı ekspresyonu için erişilebilir uygun bir doku seçin; 3) hassas ve spesifik bir RNA probu yapmak; 4) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody	Invitrogen	A11055
Anti-Digoxigenin-HRP	perkinelmer	NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody	Abcam	ab6658
Reagent
CaCl2· 2H2O	Sigma	21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent	perkinelmer	NEL745001KT
E2 solution			15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life	10099-133
Formamide	Diamond	A100314
Glycerol	Sigma	V900860
Heparin sodium	Sigma	H3149
Hybridization buffer(HB)			50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Low melting agarose	Sigma	A9414
Methanol	GHTECH	1.17112.023
Methylene blue	Sigma	M9140
MgSO4	Sigma	M2643
Na2HPO4	Sigma	S5136
NaCl	Sigma	S5886
NaHCO3	Sigma	S5761
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS			14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
1×Plus Amplification Diluent	perkinelmer	NEL745001KT
Proteinase K	Fermentas	E00492
20×Saline sodium citrate(SSC)			175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
Sodium citrate	Sigma	A5040
Tricaine	Sigma	E10521
tRNA	Sigma	R6625
Tween20	Sigma	P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40			For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34			For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP)			Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed)			Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34)			Over-expression IL-34 in liver cells