Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

Resumo

Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.

Resumo

Zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa básica e biomédica. Muitas linhas transgênicas de zebrafish estão atualmente disponíveis para rotular vários tipos de células. Devido ao corpo embrionário transparente de zebrafish, é conveniente para nós estudar o efeito de uma quimiocina sobre o comportamento de um determinado tipo de células in vivo. Aqui nós fornecemos um fluxo de trabalho para investigar a função de uma quimiocina na migração de macrófago in vivo. Nós construímos um plasmídeo tecido-específico do superexpressão para sobre-expressão Il-34 e injetamos o plasmídeo em embriões transgênicas da fase da um-pilha dos peixes cujos os macrófagos foram etiquetados especificamente por uma proteína fluorescente. Nós usamos então a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão do quimiocina e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Por fim, utilizou-se a imagem latente ao vivo confocal para observar diretamente o comportamento dos macrófagos no peixe transgênico estável para estudar a função da IL-34 sobre o macrófago in vivo.

Introdução

O zebrafish é um pequeno peixe tropical de água doce de ossos duros originado na Índia. A respeito da conservação genética, o zebrafish tem uma similaridade de 87% ao ser humano¹. Pode fornecer-nos introspecções em assuntos relacionados do ser humano estudando o Regulamento do gene, a função da proteína e o comportamento da pilha tais como a migração, proliferação et.al no zebrafish. O embrião de zebrafish pode ser usado para observar o desenvolvimento de embriões adiantados em estágios diferentes após ter inibindo o pigmento. Enquanto isso, leva apenas três meses para que o zebrafish se desenvolva em maturidade sexual, então o zebrafish pode produzir centenas de ovos a cada 4 dias. O mini-tamanho, melhoramento simples, capacidade reprodutiva forte, estas vantagens faz a cultura do zebrafish muito espaço-economia, conducente à cultura em grande escala. O rato modelo tradicional de mamíferos tem um custo de manutenção mais elevado do que o zebrafish, limitando conseqüentemente a escala da elevação do rato. No aspecto do desenvolvimento embrionário precoce, o embrião de camundongo é difícil de observar em condições de viver devido às características do desenvolvimento embrionário do camundongo no útero materno. Pelo contrário, os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente e são transparentes, por isso são fáceis de observar um microscópio. Além disso, o zebrafish é muito fácil construir uma variedade de linhas transgênicas para a pesquisa relacionada da função do gene. Atualmente, várias linhas de zebrafish transgênicos estão disponíveis para rotular diferentes tipos de células. É muito conveniente agora para construir linhas transgênicas para sobre-expressão quimiocinas em locais específicos e estudar a função de quimiocinas no comportamento celular em zebrafish.

Aqui, fornecemos um fluxo de trabalho para a utilização da linha de zebrafish transgênica para investigar a função do Il-34 no comportamento dos macrófago in vivo^2,3,4,5,6,7. Primeiramente, nós construímos um plasmídeo de superexpressão fígado-específico do gene il34 e injetamos o plasmídeo em embriões de peixes do estágio TG da um-pilha (MPEG1: GFP) que etiquetaram especificamente os macrófagos pela proteína fluorescente GFP. Então, nós usamos a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão il34 e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Nessas etapas, estabelecemos e validamos a linha produtora de citocinas e avaliamos visualmente os efeitos que podem ser observados na distribuição de macrófago. Por fim, para investigar o comportamento dos macrófago em resposta à citocina, utilizou-se a imagem viva confocal para observar diretamente a migração de macrófago para confirmar a função de il34 na migração de macrófago in vivo.

Protocolo

Nota: Todas as amostras foram tratadas pela água do ovo de phenylthiourea (PTU) para inibir o pigmento.

1. geração de TG (fabp10a: il34) construções transgênicas e injeção de peixe

1. Clone o 2,8 KB fabp10a promotor⁸ e as regiões de codificação Il-34 (ensdart 00000126460.3) de zebrafish no vetor pTol2 para gerar a construção fabp10a-il34. Injete os constructos em um estádio de células TG (MPEG1: GFP) e em embriões de peixes WT juntamente com a peptídeo mRNA. Levante os embriões injetados fabp10a-il34 do WT ao adulto⁹ e identifique o founder transgênicas pela hibridação in situ.
   Nota: A injeção do construto Tol2 diretamente em outro transgênico pode ser problemática se a outra linha transgênica for feita com o mesmo sistema de Transposon. Uma prática geral seria fazer uma linha transgênica independente e, posteriormente, cruzar a nova linha com outra linha de repórter. Isso garante que não haverá efeitos da nova transgênese em um transgene previamente inserido.

2. fluorescente toda a montagem in situ hibridação (WISH) combinar com imunocoloração

1. Fixação da amostra
   1. Colete embriões de injeção transitória ou linha transgênica estável IL-34 que cruzou com TG (MPEG1: GFP) em estágios desejados.
      Nota: Para este caso, os embriões foram coletados em 4 d pós-fertilização (DPF). (Se necessário) Retire o Chorion por seringa.
   2. Fixar os embriões com paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite a 4 ° c ou 2 h à temperatura ambiente (RT) (cerca de 25 ° c).
   3. Lave os embriões com tampão fosfato salina mais Tween 20 (PBST) 3x 5 min.
   4. Desidrata os embriões separadamente com 50% de metanol em PBST (50% metanol/PBST) e 100% de metanol, 1x 5 min cada. Em seguida, mude para o metanol 100% fresco e armazene a-20 ° c (pelo menos 2 h).
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Hibridação da sonda (dia I)
   1. Rehidratar os embriões nas etapas anteriores com 50% de metanol em PBST (50% metanol/PBST), em seguida, lave com PBST 3x 5 min.
   2. Digerir os embriões com proteinase K em PBST em RT (concentração final: 10 μg/mL; 1:2000 em PBST).
      Nota: O tempo da digestão depende do estágio dos embriões: menos do que a fertilização do borne de 36 h (HPF), nenhuma necessidade; 36 HPF-2 DPF embrião, 3-5 min; 2-3 DPF embrião, 10 min; 3-4 DPF embrião, 15 min; 4-5 DPF embrião, 15-20 min; 5-6 DPF embrião, 20-27 min; > 6 DPF embrião, 25-30 min em RT (cerca de 25 ° c).
   3. Descarte a solução de digestão e realize a fixação novamente com 4% de PFA, por 20 min em RT.
   4. Lave os embriões com PBST 2x 10 min.
   5. Descarte o PBST, realize a pré-hibridação com amortecedor aquecido da hibridação (amortecedor do HB) em 65 ° c por 5 minutos, recicl o amortecedor do HB no tubo original.
   6. Realize a pré-hibridação com um novo tampão de HB aquecido a 65 ° c, pelo menos, 1 h.
   7. Pré-aqueça a sonda⁹ (para este caso foi uma sonda il34 , 1 ng/ml) a 65 ° c, pelo menos, 10 min. Em seguida, recicle o tampão HB no tubo original. Realize a hibridação com a sonda pré-aquecida a 65 ° c durante a noite.
3. Tratamento de anticorpos (dia II)
   1. Pré-aqueça o 50% formamide/2x citrato de sódio fisiológico mais Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0,2 x SSCT a 65 ° c.
   2. Recicle a sonda no tubo original e guarde a sonda a-20 ° c.
   3. Lave os embriões separadamente com 50% de formamida/2x SSCT; 2x SSCT; 0.2 x SSCT, 3x 20 min ou 2x 30 min cada a 65 ° c.
   4. Lave os embriões com PBST 3x 5 min.
   5. Bloqueie as amostras com 600 μL de tampão de bloqueio (5% de soro bovino fetal filtrado (FBS) em PBST) durante 1 h na RT.
   6. Adicionar 400 μL de solução de anticorpos anti-Digoxigenina-HRP (1:1.000-1:2000 em tampão de bloqueio) e incubar os embriões a 4 ° c durante a noite. Se os sinais são fracos, use 1:500 diluição do anticorpo.
4. Coloração e anticorpo primário incubador (dia III)
   1. Retire o anticorpo; Lave os embriões com PBST, 6x 20 min em RT.
   2. Enxague a amostra com 30 μL de diluente de amplificação 1x Plus durante 5 min em RT.
   3. Descarte o diluente introduzindo a pipetagem; diluir a solução de Fluorophore Tyramide (cyanine 3 Plus reagente de amplificação (Cy3) ou o reagente de amplificação de cyanine 5 Plus (Cy5), para este caso Cy3 foi utilizado) 1:50 em 1x Plus diluente de amplificação para fazer a Fluorophore Tyramide solução de trabalho. Prepare 50-100 μL de solução de trabalho para cada amostra.
   4. Incubar a amostra no Fluorophore Tyramide solução de trabalho para 5-15 min no escuro em RT. Se os sinais são fracos, estender o tempo de incubação para 30 min.
   5. Pare a reacção alterando a solução de trabalho com PBST e examine os sinais.
   6. Lave os embriões com PBST 3x 10 min em RT.
   7. Incubar a amostra com anticorpo primário a 4 ° c durante a noite. Para este caso, use o anticorpo goat-anti-GFP como o anticorpo preliminar.
5. Coloração do anticorpo secundário (dia IV)
   1. Lave os embriões com PBST por 4x 30 min.
   2. Incubar os embriões com anticorpo secundário a 4 ° c durante a noite. Para este caso, use o anticorpo de Alexa 488-anti-cabra como o anticorpo secundário.
6. Tirar fotos (dia V)
   1. Lave os embriões com PBST 3x 10 min em RT.
   2. Armazene os embriões em 70% de glicerol em escuro a 4 ° c durante a noite ou-20 ° c por mais tempo.

3. imagens ao vivo

1. Seleção de amostra
   Nota: use a imagem ao vivo para observar diretamente se os macrófagos de TG (fabp10a: Il34; fabp10a: DSRED; MPEG1: GFP) peixes migrariam para o fígado a indução de Il-34 durante 3-3,5 DPF. Aqui a linha transgênica TG (Fabp10a-dsred) é usada para rotular a região hepática e torná-la visível, para facilitar a localização do fígado e para determinar se os macrófagos migram para o fígado. Antes da imagem latente, use um microscópio de fluorescência para selecionar os embriões positivos dobro de DsRed e de GFP.
2. Montagem dos peixes
   1. Use um banho do metal para aquecer 1 mL do agarose de derretimento baixo de 1% a acima de 90 ° c para derretê-la completamente.
   2. Depois que o baixo agarose de derretimento é refrigerado à temperatura de corpo, adicione 50 μL do tricaine de 0,2%, e misture uniformemente o tricaine com o agarose.
   3. Mova os embriões anestesiados para um pequeno prato montado com um slide de cobertura na parte inferior, retire a água circundante, solte lentamente o baixo agarose de fusão sobre os embriões, cuidadosamente definir a posição do peixe antes que o agarose é solidificada, manter a área do fígado perto de a corrediça da tampa na parte inferior do prato.
   4. Depois que o baixo agarose de derretimento solidified, cubra-o com cuidado com uma outra camada de agarose para reforçá-la.
   5. Coloc o prato na tabela confocal do portador do microscópio, cubra os peixes com a solução E2¹⁰ com tricaine e comece a imagem latente.
3. Operação do software do microscópio confocal
   1. Abra o software do preto 2,3 do Zen , instale a bancada viva da pilha na tabela do portador do microscópio.
   2. Clique em Localizar | Incubação | Temperatura para ajustar a temperatura a 29 ° c.
   3. Coloque o prato no centro da bancada de célula viva, cubra o peixe com a solução E2¹⁰ com tricaína.
   4. Clique no menu aquisição , selecione o modo de digitalização e os lasers necessários no menu configuração inteligente e, em seguida, selecione Z-Stack e Position.
   5. Clique no menu Designer de experimento , selecione habilitar experimento de vários blocos, no primeiro bloco, para localizar a amostra a baixa ampliação e, em seguida, alterne para a alta ampliação, deixe a área observada no centro do campo visual.
   6. Ajuste a posição e a informação da Z-pilha, selecione a intensidade apropriada do laser, as camadas da exploração e a velocidade da imagem latente.
   7. Crie um novo bloco e repita os passos acima. Depois de configurar todos os blocos, defina o número apropriado de loops e inicie a gravação (Figura 1).

Resultados

As etapas envolvidas no protocolo de zebrafish são ilustradas na Figura 2. Em primeiro lugar, geramos o construto pBLK-fabp10a-il34-SV40 no qual il34 foi conduzido pelo promotor fabp10a (Figura 2). O construto foi microinjetado em embriões de zebrafish de fase TG (MPEG1: GFP) de uma célula que pode rotular macrófagos com embriões de GFP e WT que foram levantados para adultos para gerar lin...

Discussão

O protocolo descrito aqui nos permite investigar a função de uma quimiocina sobre o comportamento do macróagein vivo e o procedimento requer algum conhecimento técnico. Em síntese, existem várias etapas críticas para evitar complicações no protocolo: 1) selecionar uma linha transgênica adequada que mostre um sinal transgênico específico e forte para rotular a célula de interesse; 2) selecionar um tecido apropriado que seja acessível para a imagem latente e o overexpression do gene transgênicas; 3) faça um...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody	Invitrogen	A11055
Anti-Digoxigenin-HRP	perkinelmer	NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody	Abcam	ab6658
Reagent
CaCl2· 2H2O	Sigma	21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent	perkinelmer	NEL745001KT
E2 solution			15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life	10099-133
Formamide	Diamond	A100314
Glycerol	Sigma	V900860
Heparin sodium	Sigma	H3149
Hybridization buffer(HB)			50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Low melting agarose	Sigma	A9414
Methanol	GHTECH	1.17112.023
Methylene blue	Sigma	M9140
MgSO4	Sigma	M2643
Na2HPO4	Sigma	S5136
NaCl	Sigma	S5886
NaHCO3	Sigma	S5761
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS			14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
1×Plus Amplification Diluent	perkinelmer	NEL745001KT
Proteinase K	Fermentas	E00492
20×Saline sodium citrate(SSC)			175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
Sodium citrate	Sigma	A5040
Tricaine	Sigma	E10521
tRNA	Sigma	R6625
Tween20	Sigma	P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40			For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34			For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP)			Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed)			Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34)			Over-expression IL-34 in liver cells