Modelo porcino del aneurisma aórtico abdominal infrarrenal

Resumen

Este novedoso modelo crea aneurismas aórticos infrarrojos robustos en cerdos utilizando una combinación de angioplastia con balón, perfusión por elastasa/colagenasa, aplicación tópica de elastasa y administración oral de compuestos-aminopropionitrilo, que interfiere con la reticulación de colágeno.

Resumen

Los modelos animales grandes para estudiar aneurismas de la aorta abdominal son escasos. El propósito de este modelo es crear aneurismas aórticos de aorta abdominal infrarrojos reproducibles y clínicamente significativos (AAA) en cerdos. Para lograrlo, utilizamos una combinación de angioplastia con balón, elastasa y colagenasa, y un inhibidor de la lisil oxidasa, llamado -aminopropionitrilo (BAPN), para crear aneurismas aórticos infrarrenales clínicamente significativos, análogos a la enfermedad humana.

Los cerdos machos no castrados son alimentados con BAPN durante 7 días antes de la cirugía para lograr un estado estable en la sangre. Se realiza una laparotomía de línea media y la aorta infrarrenal se disecciona circunferencialmente. Se registra una medición inicial antes de la inducción del aneurisma con una combinación de angioplastia con balón, elastasa (500 unidades)/coltasa (8000 unidades) perfusión y aplicación tópica de elastasa. Los cerdos se alimentan con BAPN diariamente hasta el procedimiento terminal en los días 7, 14 o 28 postoperatorios, momento en el que se mide el aneurisma, y se adquiere tejido. LOS cerdos BAPN + cirugía se comparan con los cerdos que se sometieron a cirugía solo.

Los cerdos tratados con BAPN y la cirugía tenían una dilatación aórtica media del 89,9% al 47,4% en el día 7, del 105,4% al 58,1% en el día 14, y del 113,5% al 30,2% en el día 28. Los cerdos tratados solo con cirugía tenían aneurismas significativamente más pequeños en comparación con los animales de CIRUGÍA BAPN en el día 28 (p < 0.0003). El grupo de cirugía BAPN + tenía evidencia macroscópica e inmunohistoquímica de la enfermedad aneurisma terminal.

La AAA infrarrenal clínicamente significativa se puede inducir mediante angioplastia con balón, perfusión por elastasa/colagenasa y aplicación tópica, complementada con BAPN oral. Este modelo crea AAA grande y clínicamente significativo con señas de identidad de la enfermedad humana. Esto tiene importantes implicaciones para el esclarecimiento de la patogénesis AAA y la prueba de nuevas terapias y dispositivos para el tratamiento de la AAA. Las limitaciones del modelo incluyen la variación en BAPN ingerido por cerdos, la calidad de la perfusión de elastasa y el costo de BAPN.

Introducción

Según el Centro para el Control de Enfermedades (CDC), los aneurismas aórticos (AA) son una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos y representan una carga de morbilidad significativa¹. Un aneurisma aórtico se define como una dilatación de una porción discreta del lumen del recipiente por más del 50%^2. Un subconjunto de AA en el abdomen, conocido como aneurismas de la aorta abdominal (AAA) son una preocupación creciente. AAA permanece clínicamente en silencio hasta la ruptura inminente o disección, con inicio agudo, dolor abdominal intenso generalmente siendo el único síntoma de presentación^3,4. La ruptura de AAA es casi siempre mortal con una tasa de mortalidad del 90%⁵. La cirugía abierta o endovascular es la única opción terapéutica para los pacientes, y puede ser un procedimiento altamente morboso. Es importante destacar que la AAA es una de las pocas enfermedades cardiovasculares sin terapia médica para la cura.

Hasta la fecha, gran parte de la investigación sobre la patogénesis AAA se ha centrado en modelos de roedores, utilizando elastasa, que es una enzima que degrada la elastina que se encuentra en el medio de aórtica, para inducir aneurismas. ^6,7 Sin embargo, la traducibilidad clínica de los modelos animales pequeños a la enfermedad aneurisma humana está restringida, ya que la evaluación de los cambios estructurales en la aorta, y la hemodinámica alterada son limitadas debido al tamaño. Debido a la similitud anatómica y de tamaño, el sistema circulatorio porcino se correlaciona mejor con la biología humana que los roedores^8. Los grandes modelos animales permiten una mayor comprensión de los mecanismos celulares del proceso de la enfermedad, se pueden utilizar desarrollar nuevos tratamientos a dosis terapéuticas para mamíferos grandes, y probar dispositivos de reparación mecánica, que no serían factibles en modelos animales pequeños. Además, la naturaleza aguda de los modelos de roedores no replica la cronicidad y las características patológicas de la enfermedad aneurisma humana.

La combinación de elastasa y un compuesto llamado -aminopropionitrilo (BAPN) ha revolucionado los modelos aAA murinos, mediante la creación de aneurismas que son más grandes y contienen secuencia sórmis de enfermedad aneurisma crónica, incluyendo trombo mural, disección, y ruptura⁹. BAPN es un inhibidor de la lisil oxidasa, que es esencial para la reticulación de colágeno, un componente crucial de la pared aórtica^10,11,12. La actividad de la lisis oxidasa disminuye con el envejecimiento y dada la asociación de la edad y la naturaleza crónica de la AA complicada, BAPN tiene un gran potencial para imitar experimentalmente los efectos del envejecimiento^9,13,14. El uso de BAPN y su capacidad para replicar enfermedades crónicas en un entorno subagudo ofrece una ventaja novedosa sobre los modelos animales grandes alternativos de AAA. En comparación con otros modelos AAA porcinos establecidos, este modelo crea los mayores aneurismas con señas de identidad de la enfermedad terminal, y los resultados se han publicado previamente^8,11,15.

Al mismo tiempo que se confieren ciertas ventajas, se requieren recursos e inversiones importantes para completar con éxito este modelo que puede disuadir a algunos investigadores. Entre estos recursos se incluyen el acceso a quirófanos, cirujanos calificados y proveedores de anestesia, alojamiento de animales y personal veterinario para ayudar con la atención postoperatoria. Además, el costo de BAPN puede ser prohibitivamente caro para algunos laboratorios.

Existen pocos modelos animales grandes para estudiar la fisiopatología compleja de la formación AAA y traducirse en enfermedades humanas. Los grandes modelos animales de AAA son fundamentales para ayudar a evaluar la viabilidad de las nuevas tecnologías y tratamientos para las enfermedades humanas. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue crear un modelo reproducible de AAA infrarrenal en etapa avanzada en cerdos. La razón para el uso del modelo porcino BAPN y elastasa es comprender mejor la fisiopatología de la AAA imitando la naturaleza crónica y la sílade de la enfermedad aneurisma humana en un entorno agudo o subagudo, así como para probar nuevas terapias y dispositivos para AAA Tratamiento.

Protocolo

Los protocolos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia (núm. 3848).

NOTA: Este modelo ha sido publicado previamente por Cullen et al. y es un protocolo modificado descrito por Hynecek et al.^8,15.

1. Animales

1. Utilice cerdos machono no castrados que pesen 20-30 kg para los experimentos.
2. Con el fin de maximizar la proporción de dosis a base de peso de BAPN ingerido, proporcionar a los cerdos con comidas divididas de comida estándar y 0,15 g/kg de BAPN mezclado con yogur natural de leche entera o alimentos para perros húmedos. Iniciar la administración de BAPN 7 días antes de la operación del índice para lograr un estado estable en la sangre, y diariamente durante el curso postoperatorio.
   NOTA: BAPN tiene numerosos efectos secundarios si se ingieres en grandes cantidades. Las precauciones de aislamiento para el personal, incluyendo gorra, batas, guantes y fundas de zapatos deben usarse siempre que interactúen con animales alimentados con BAPN o manipulen BAPN.
3. Haga que los cerdos sean nulos por os (NPO) la noche anterior a la cirugía.

2. Anestesia

1. Inducir la anestesia general (GA) utilizando tiletamina-zolzepam 6 mg/kg, xilazina (2 mg/kg) y sulfato de atropina (0,04 mg/kg) administrados por vía intramuscular.
2. Intubar el cerdo usando un tubo endotraqueal estándar (ETT) y una hoja Miller.
3. Obtenga acceso por vía intravenosa periférica (IV) utilizando un calibre IV de 16 o 18 en una vena del oído y asegúrelo en su lugar con cinta adhesiva.
4. Conecte el ETT a la máquina de anestesia y mantenga GA usando isoflurano inhalado (0,2 mg/kg).
5. Aplique cables de electrocardiograma (EKG) y oximetría de pulso para controlar los signos vitales durante la cirugía. Tome la temperatura oral al principio de la caja. Coloque una almohadilla de electrocauterización en la parte dependiente del cerdo.
6. Asegúrese de que un miembro de su personal esté continuamente monitoreando y registrando regularmente signos vitales para asegurarse de que el cerdo esté adecuadamente sedado, ventilado y oxigenado, así como para identificar e intervenir adecuadamente en cualquier inestabilidad hemodinámica durante el Cirugía.

3. Técnica quirúrgica

1. Realizar la esterilización del área quirúrgica utilizando gasa estéril, povidona-yodo y 70% alcohol isopropílico. Cubrir el cerdo de la manera estéril habitual. Tome una muestra de sangre antes de la incisión.
   NOTA: En este punto, todo el equipo, incluidos los instrumentos, globos, cables, etc. debe ser estéril.
2. Usando una hoja de once o electrocauterización de Bovie, realice una laparotomía de línea media para entrar en la cavidad abdominal.
3. Desplazar las vísceras abdominales cefáladas a la izquierda del cerdo para exponer el retroperitoneo. Cubra el intestino con una toalla azul húmeda para evitar la desecación. Hacer una incisión aguda para entrar en el retroperitoneo, permitiendo el acceso a la vena cava inferior (IVC) y la aorta abdominal infrarrenal.
   NOTA: La identificación y protección de los uréteres bilateralmente es crucial en esta parte del caso. La anatomía retroperitoneal porcina porcina (incluyendo el curso de los uréteres) refleja groseramente la de los seres humanos, con sutiles variaciones detalladas a continuación.
4. Circunferencialmente diseccionar la aorta de los vasos renales, inferiormente a la trifurcación aórtica. Tenga cuidado de evitar lesiones por CIV y la arteria lumbar. Una vez expuesta toda la aorta infrarrenal, utilice pinzas para medir el diámetro aórtico en la parte media de la aorta infrarrenal.
   NOTA: A diferencia de los seres humanos, los cerdos tienen una trifurcación aórtica, no la bifurcación.
5. Identificar la arteria mesentérica caudal en la parte anterior de la aorta infrarrenal, que generalmente se encuentra unos pocos centímetros proximal a la trifurcación aórtica. Esta arteria no existe en los seres humanos. Diseccionar, sujetar y transceder esta arteria. En este punto, administrar 5000 unidades de sulfato de heparina no fraccionado por vía intravenosa.
6. Cannute la arteria mesentérica caudal con una guía de alambre de acero inoxidable de 0.018 de un conjunto de introductores de micropuntura. Dilatar en serie la arteria sobre el alambre con un 5 francés (Fr) y luego un introductor de 7 Fr.
7. Dejando el 7 Fr introducer en su lugar, reemplace el 0.018 en alambre con un 0.035 en el alambre guía, y luego retire el 7 Fr introducer, asegurando la hemostáfilo con un dedo sobre el sitio de la canonulación a medida que se quita el introductor. Inserte un 0.035 en el alambre guía hasta que queden aproximadamente 30 cm de alambre o se encuentre resistencia.
8. Inserte un globo de angioplastia transluminal percutánea de 16 mm sobre el alambre en la aorta infrarrenal y colóquelo en el punto medio de la aorta diseccionada. Infle el globo mientras mide intermitentemente el diámetro de la aorta dilatada con pinzas hasta que la dilatación máxima sea aproximadamente un 80% mayor que la medición basal.
9. Después de 10 minutos de reperfusión, abrazadera cruzada la aorta simplemente distal a los vasos renales y proximal a la trifurcación aórtica. Identificar y sujetar los vasos lumbares previamente diseccionados para aislar la aorta infrarrenal de la circulación sistémica. Esto es importante para evitar la perfusión sistémica de elastasa, que puede causar una respuesta séptica en el período postoperatorio agudo.
10. Vuelva a introducir el introductor 7 Fr sobre el cable y retire el cable. Enjuague el segmento aórtico aislado con salina asegurando que no haya fugas de líquido. Conecte la solución de elastasa (500 unidades) y colagenasa (8000 unidades) al introductor y percoe 30 ml en la aorta aislada bajo presión manual constante durante 10 minutos. Se deben introducir en el segmento aislado todo el ml de soluciones.
    NOTA: Un segmento aórtico bien perfundido debe estar tenso sin fugas de la pared aórtica o del sitio de la canonulación. Un lazo de recipiente puede estar envuelto sólo proximal al sitio de la cánulation para asegurar que no escape la elastasa. En el transcurso de 10 min, la solución de elastasa/colagenasa se puede observar "llorando" a través de la pared aórtica.
11. Después de 10 min, irrigar la solución del lumen aórtico con solución salina. Retire el introductor y ligar el muñón de la arteria mesentérica caudal. Suelte todas las abrazaderas (pinzas lumbares primero, seguidas de abrazadera distal, luego abrazadera proximal).
    NOTA: Restringir el tiempo de abrazadera a no más de 10 minutos para prevenir la isquemia de la médula espinal. Tenga una puntada de reparación (5-0 polipropileno) cargada en caso de sangrado del muñón de la arteria mesentérica caudal después de que se liberen las abrazaderas cruzadas.
12. Remoje una gasa quirúrgica de 2 cm x 5 cm con 20 ml de elastasa sin diluir (27 unidades/ml) y envuelva alrededor de la aorta interviniente durante 10 min. Tome una medida de la aorta después de todas las intervenciones con una pinza.
13. Irriga el abdomen con salina, reemplazar el intestino y cerrar el abdomen en tres capas. BAPN inhibe la cicatrización de heridas, por lo que con el fin de minimizar los riesgos de descomposición de la herida y dehiscencia fascial, utilizar la sutura con un tiempo de absorción largo y asegúrese de tomar birutas de tejido de tamaño pequeño juiciosamente en cada capa. Utilice una sutura de polidioxanona (PDS) sintética absorbible (PDS) para la fascia, una sutura de 2-0 absorbible trenzada para el dérmico profundo más tarde, y una sutura monofilamento absorbible subcuticular (4-0) para la piel.

4. Cuidado postoperatorio

1. Utilice 0,2 mg/kg de buprenorfina subcutánea-SR para la analgesia postoperatoria. Evaluar cada cerdo tres veces al día durante los tres primeros días postoperatorios en busca de signos de dolor y malestar y administrar analgesia adicional si se identifica.
2. Administrar antibióticos postoperatorios (1 g de cefalexina por vía intramuscular) en POD 1-3.
3. Animales de la casa socialmente después de POD 3.

5. Adquisición de tejido aórtico

1. Realizar la adquisición de tejidos en POD 7, 14 o 28.
2. Inducir GA como se describe en los pasos 2.1-2.5 anteriores.
   NOTA: La adquisición de tejido aórtico terminal no necesita ser estéril.
3. 5.3. Vuelva a abrir la incisión anterior de la laparotomía de línea media, siendo consciente del intestino adherido a la pared abdominal anterior. Refleja el intestino para exponer el retroperitoneo y la aorta similares al paso 3.3 anterior.
4. Diseccionar la aorta hasta que se exponga el aneurisma y medir el diámetro externo del segmento aneurisma con pinzas. Calcular dilatación aórtica (%) utilizando la siguiente ecuación: [(diámetro infrarrenal de cosecha - diámetro infrarrenal operativo inicial) x 100%]. Una vez alcanzada la medición, administrar una dosis letal de pentobarbital-fenitoína (por ejemplo, Euthasol) mediante inyección en el CIV.
5. Diseccionar la aorta de la trifurcación a la aorta suprarrenal y explantar el segmento aneurisma con un segmento de control de aorta no tratada. Coloque la muestra en nitrógeno líquido o formalina para su evaluación histológica.

Resultados

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba exacta de Fisher o la prueba de chi al cuadrado según corresponda. Los valores de los datos se notifican como dilatación aórtica media (%) - desviación estándar (%). La significancia estadística se estableció P < 0.05. La combinación de BAPN y cirugía que proporciona tratamiento de elastasa (cirugía/elastasa) crea AAA más robusto y reproducible en cerdos en el día 28 en comparación con los tratados con cirugía y elastasa solo (dilatación ...

Discusión

Se creó un modelo novedoso de AAA infrarrenal en cerdos utilizando una combinación de angioplastia con balón, perfusión y elastasa tópica, y dietética como BAPN. Usando este modelo, la dilatación aórtica de >100% se logró con características gruesas e histológicas de la enfermedad aneurisma humana crónica. Este modelo proporciona una puerta de entrada para comprender mejor la fisiopatología compleja de la AAA y traducir las terapias potenciales a las enfermedades humanas.

Los mode...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arrow Ergo Pack System	Arrow	CDC-21242-X1A	Just need 7 Fr dilator
Atlas PTA Balloon dilation catheter	Bard	AT-120184	16 mm x 4 cm x 120 cm
Bovie electrocautery	Bovie Medical	A2350
Collagenase Type 1 (5 gm)	Worthington	LS004196
Crile Needle drviers	MFI medical	61-2201
DeBakey Atraumatic Forceps	MFI medical	52-4977
DeBakey Peripheral Vascular Clamp	Medline	MDS1318119
Glidewire	Terumo Interventional Systems	GS3506	outer Wire diameter 0.035 mm, Length 150 cm
GraphPad Prism 6	GraphPad Software Inc. La Jolla, Calif)		statistical software
Metzenbaum Scissors	MFI medical	61-0004
Mayo-Hegar Needle Holder	tiger medical	N407322
Micropuncture Introducer Set	Cook	G47946
Mixter Forceps, Standard Grade, Right angle	Cole-Parmer	UX-10818-16
Monocryl suture	Ethicon	Y496G-BX	4-0 monocryl
PDS II suture	Ethicon	D8926	Number 1 looped
Porcine Pancreatic Elastase	Sigma-Aldrich	E1250
Satinsky Vascular Clamps	Medline	MDs5632515
Suction canister	Cardinal Health	65651212
Schuco Aspirator	MFI medical	S430A
Vicryl suture	Ethicon	J789D-SD	2-0 vicryl
Yankauer Suction tube	Sklarcorp	07-1801