Modelo suíno de aneurisma aórtica abdominal infra-renal

Resumo

Este modelo novo cria aneurismas abdominais infra-renais robustos no suíno usando uma combinação de angioplastia do balão, perfusão elastase/collagenase, aplicação tópica da elastase, e administração do composto oral β-aminopropionitrile, que interfere com a cruz-ligação do colágeno.

Resumo

Grandes modelos animais para estudar aneurismas da aorta abdominal são escassos. O objetivo deste modelo é criar aneurismas de aorta abdominal infra-renal reproduzíveis e clinicamente significativos (AAA) em suínos. Para conseguir isso, usamos uma combinação de angioplastia balão, elastase e colagem, e um inibidor de oxidase de lysyl, chamado β-aminopropionitrile (BAPN), para criar aneurismas aórticos infrasres clinicamente significativos, análogos à doença humana.

Suínos machos não castrados são alimentados com BAPN por 7 dias antes da cirurgia para alcançar um estado estável no sangue. Uma laparotomia midline é realizada e a aorta infra-renal é circunferentially dissecada. Uma medida inicial é registrada antes da indução do aneurisma com uma combinação de angioplastia balão, elastase (500 unidades)/colagem (8000 unidades) perfusão e aplicação tópica de elastase. Os suínos são alimentados com BAPN diariamente até o procedimento terminal no dia pós-operatório 7, 14 ou 28, momento em que o aneurisma é medido, e tecidos adquiridos. Os porcos BAPN + cirurgia são comparados aos porcos que se submeteram à cirurgia sozinho.

Os suínos tratados com BAPN e a cirurgia tiveram uma dilatação aórtica média de 89,9% ± 47,4% no dia 7, 105,4% ± 58,1% no dia 14 e 113,5% ± 30,2% no dia 28. Os porcos tratados com cirurgia sozinho tiveram aneurismas significativamente menores comparados aos animais de BAPN + cirurgia no dia 28 (p < 0.0003). O grupo bapn + cirurgia teve evidências macroscópicas e imunohistoquímicas da doença aneurismal em estágio final.

AAA infra-renal clinicamente significativa pode ser induzida por meio de angioplastia balão, perfusão de elastase/colagem e aplicação tópica, complementada com BAPN oral. Este modelo cria a AAA grande, clìnica significativa com características da doença humana. Isso tem implicações importantes para a elucidação da patogênese aAA e testes de novas terapias e dispositivos para o tratamento da AAA. As limitações do modelo incluem variação na BAPN ingerida por suínos, qualidade de perfusão de elastase e custo da BAPN.

Introdução

De acordo com o Center for Disease Control (CDC), aneurismas da aorta (AA) são uma das principais causas de morte nos Estados Unidos e representam uma carga significativa da doença¹. Um aneurisma da aorta é definido como uma dilatação de uma porção discreta do lumen da embarcação por sobre 50%^2. Um subconjunto de AA no abdômen, referido como aneurismas da aorta abdominal (AAA) são uma preocupação crescente. AAA permanece clinicamente silenciosa até a ruptura ou dissecação iminente, com início agudo, dor abdominal intensa geralmente sendo o único sintoma de apresentação^3,4. Ruptura da AAA é quase sempre fatal, com uma taxa de mortalidade de 90%⁵. A cirurgia aberta ou endovascular é a única opção terapêutica para pacientes, e pode ser um procedimento altamente mórbido. Importante, AAA são uma das poucas doenças cardiovasculares sem terapia médica para a cura.

Até o momento, grande parte da pesquisa sobre a patogênese da AAA tem se concentrado em modelos de roedores, usando elastase, que é uma enzima que degrada a elastina encontrada dentro da mídia da aorta, para induzir aneurismas. ^6,7 No entanto, a traduzbilidade clínica de pequenos modelos animais para a doença aneurismal humana é restrita, como avaliação de mudanças estruturais na aorta, e a hemodinâmica alterada é limitada devido ao tamanho. Devido à semelhança anatômica e de tamanho, o sistema circulatório suíno correlaciona-se melhor com a biologia humana do que os roedores^8. Grandes modelos animais permitem uma maior compreensão dos mecanismos celulares do processo da doença, podem ser usados desenvolver novos tratamentos em doses terapêuticas para grandes mamíferos, e testar dispositivos de reparação mecânica, o que não seria viável em pequenos modelos animais. Além disso, a natureza aguda dos modelos de roedores não replica as características crônicas e patológicas da doença aneurismal humana.

A combinação de elastase e um composto chamado β-aminopropionitrile (BAPN) revolucionou os modelos murine AAA, criando aneurismas maiores e contêm sequelas de doença aneurismal crônica, incluindo trombode mural, dissecção e ruptura⁹. Bapn é um inibidor da oxidase de lisíldeo, que é essencial para crosslinking colágeno, um componente crucial da parede da aorta^10,11,12. A atividade oxidase de lysyl diminui com o envelhecimento e dada a associação de idade e a naturezacrônica do complicado AA, a BAPN tem um grande potencial para imitar experimentalmente os efeitos do envelhecimento^9,13,14. O uso de BAPN e sua capacidade de replicar doenças crônicas em um ambiente subagudo oferece uma nova vantagem sobre os modelos animais alternativos de grande aaa. Em comparação com outros modelos suínos estabelecidos da AAA, este modelo cria os maiores aneurismas comcaracterísticas da doença em estágio terminal, e os resultados foram publicados anteriormente^8,11,15.

Ao conferir certas vantagens, recursos significativos e investimento são necessários para concluir com sucesso este modelo que pode dissuadir alguns investigadores. Entre esses recursos estão o acesso a salas de cirurgia, cirurgiões qualificados e provedores de anestesia, habitação animal e pessoal veterinário para ajudar com cuidados pós-operatórios. Além disso, o custo da BAPN pode ser proibitivamente caro para alguns laboratórios.

Poucos grandes modelos animais existem para estudar a fisiopatologia complexa da formação AAA e traduzir a doença humana. Grandes modelos animais de AAA são fundamentais para ajudar a avaliar a viabilidade de novas tecnologias e tratamentos para doenças humanas. Portanto, o objetivo deste estudo foi criar um modelo reproduzível de estágio avançado infra-renal AAA em suínos. A justificativa para o uso da BAPN e do modelo suíno elastase é entender melhor a fisiopatologia da AAA imitando a natureza crônica e as sequelas da doença aneurismal humana em um ambiente agudo ou subagudo, bem como testar novas terapias e dispositivos para AAA Tratamento.

Protocolo

Protocolos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia (nº 3848).

NOTA: Este modelo foi publicado anteriormente pela Cullen et al. e é um protocolo modificado descrito por Hynecek et al.^8,15.

1. Animais

1. Use suínos machos não castrados pesando 20-30 kg para os experimentos.
2. A fim de maximizar a proporção de doses à base de peso de BAPN ingeridos, fornecer porcos com refeições divididas de comida padrão e 0,15 g / kg de BAPN misturado com iogurte natural de leite integral ou comida de cachorro molhada. Comece a administração bapn 7 dias antes da operação de índice para alcançar um estado estável no sangue, e diariamente durante o curso pós-operatório.
   NOTA: BAPN tem inúmeros efeitos colaterais se ingerido em grandes quantidades. Precauções de isolamento para o pessoal, incluindo boné, vestidos, luvas e capas de sapatos devem ser usadas sempre que interagir com animais alimentados com BAPN ou manipulação BAPN.
3. Faça porcos zero por os (NPO) na noite anterior à cirurgia.

2. Anestesia

1. Induzir anestesia geral (GA) usando tiletamina-zolzepam 6 mg/kg, xilazine (2 mg/kg) e sulfato de atropina (0,04 mg/kg) administrado simuscularmente.
2. Intuição do porco usando um tubo endotraheal padrão (ETT) e miller lâmina.
3. Obtenha acesso intravenoso periférico (IV) usando um calibre IV de 16 ou 18 em uma veia de orelha e seguro no lugar com fita adesiva.
4. Conecte o ETT à máquina de anestesia e mantenha ga usando isoflurano inalado (0,2 mg/kg).
5. Aplique ligações do eletrocardiograma (EKG) e o oximetria do pulso para monitorar sinais vitais durante a cirurgia. Tome temperatura oral no início do caso. Coloque um bloco de eletrocautery na porção dependente do porco.
6. Certifique-se de que um membro de sua equipe está monitorando e registrando regularmente sinais vitais para garantir que o porco esteja devidamente calmo, ventilado e oxigenado, bem como para identificar e intervir adequadamente sobre qualquer instabilidade hemodinâmica durante o Cirurgia.

3. Técnica cirúrgica

1. Realizar a esterilização da área cirúrgica usando gaze estéril, povidone-iodo e 70% de álcool iopropyl. Armar o porco da forma estéril habitual. Tome uma amostra de sangue antes da incisão.
   NOTA: Neste ponto, todos os equipamentos, incluindo instrumentos, balões, fios, etc deve ser estéril.
2. Usando uma lâmina onze ou eletrocautery Bovie, realizar uma laparotomia midline para entrar na cavidade abdominal.
3. Deslocar as vísceras abdominais cedendo à esquerda do porco para expor o retroperitoneum. Cubra o intestino com uma toalha azul úmida para evitar a dessecação. Faça uma incisão afiada para entrar no retroperitoneum, permitindo o acesso à cava de vena inferior (IVC) e aorta abdominal infra-renal.
   NOTA: A identificação e a proteção dos ureters bilateralmente são cruciais nesta parte do caso. A anatomia retroperitoneal do suíno (que inclui o curso dos ureteres) espelha bruta aquela dos seres humanos, com as variações subtis detalhadas abaixo.
4. Circunferentemente dissecar a aorta dos vasos renais, inferiormente à trifurcation aórtica. Tome cuidado para evitar ivc e lesão lombar da artéria. Uma vez que toda a aorta infra-renal é exposta, use pinças para medir o diâmetro da aorta na parte meados da aorta infra-renal.
   NOTA: Ao contrário dos seres humanos, os suínos têm uma trifurcation aórtica, não bifurcação.
5. Identifique a artéria mesentérica caudal na porção anterior da aorta infra-renal, que geralmente se encontra a alguns centímetros proximais à trifurcação aórtica. Esta artéria não existe em humanos. Dissecar, apertar e transescar esta artéria. Neste ponto, administrar 5000 unidades de sulfato heparina não fracionado por via intravenosa.
6. Cannulate a artéria mesentérica caudal com um 0.018 no guia do fio do aço inoxidável de um jogo do introducer da microunctura. Em série dilatar a artéria sobre o fio com um francês 5 (P) e, em seguida, um 7 Fr introdutor.
7. Deixando o 7 Fr introdutor no lugar, substituir o 0.018 em fio com um 0.035 em guidewire, e, em seguida, remover o 7 Fr introdutor, garantindo hemostasis com um dedo sobre o local da cannulação como o introdutor é removido. Insira um 0.035 no fio-guia até que aproximadamente 30 cm de restos de arame ou resistência seja encontrado.
8. Insira um balão de angioplastia transluminal percutânea de 16 mm sobre o fio na aorta infra-renal e posicione-o no ponto médio da aorta dissecada. Inflar o balão enquanto medindo intermitentemente o diâmetro da aorta dilatada com pinças até a dilatação máxima é aproximadamente 80% maior do que a sua medida de base.
9. Após 10 min de reperfusão, cruze a aorta apenas distal aos vasos renais e proximal à trifurcation aórtica. Identifique e clampei os vasos lombares previamente dissecados para isolar a aorta infra-renal da circulação sistêmica. Isso é importante para evitar a perfusão sistêmica de elastase, o que pode causar uma resposta séptica no período pós-operatório agudo.
10. Reintroduzir o 7 Fr introdução sobre o fio e remover o fio. Nivele o segmento isolado da aorta com salina que assegurando nenhum escapamento do líquido. Conecte a solução elastase (500 unidades) e colagem (8000 unidades) ao introdutor e perfunde 30 mL na aorta isolada pressão manual constante por 10 min. Todo o 30 mL de soluções deve ser introduzido no segmento isolado.
    NOTA: Um segmento aórtico bem perfundido deve ser tenso sem vazamento da parede da aorta ou do local da cannulação. Um laço da embarcação pode ser envolvido apenas proximal ao local da cannulação para assegurar-se de que nenhuma fuga elastase. Ao longo de 10 min, a solução elastase/collagenase pode ser observada "chorando" através da parede da aorta.
11. Após 10 min, irrigar a solução do lumen da aorta com sorline. Retire o introdutor e ligate o coto da artéria mesentérica caudal. Libere todos os grampos (grampos lombares primeiro, seguido saque de grampo distal, em seguida, grampo proximal).
    NOTA: Restringir o tempo de braçadeira para não mais de 10 min, a fim de evitar a isquemia da medula espinhal. Tenha um ponto de reparo (5-0 polipropileno) carregado em caso de sangramento do coto da artéria mesentérica caudal após as braçadeiras cruzadas são liberados.
12. Mergulhe um pedaço de 2 cm x 5 cm de gaze cirúrgica com 20 mL de elastase não diluída (27 unidades/mL) e envolva a aorta interveio por 10 min. Tome uma medida da aorta depois de todas as intervenções com uma pinça.
13. Irrigar o abdômen com sosseo, substituir o intestino, e fechar o abdômen em três camadas. Bapn inibe a cicatrização de feridas, por isso, a fim de minimizar os riscos de quebra da ferida e dehiscência fascial, usar a sutura com um longo tempo de absorções e não se esqueça de tomar judiciosamente pequenas mordidas de tamanho de tecido em cada camada. Utilize uma sutura de monofilamento absorvente sintético em execução 1 looped Polydioxanone (PDS) para a fáscia, uma sutura absorvível trançada em execução para o dérmico profundo mais tarde, e uma sutura monofilamento absorvente subcuticular em execução (4-0) para a pele.

4. Cuidados pós-operatórios

1. Utilize 0,2 mg/kg de buprenorfina subcutânea-SR para analgesia pós-operatória. Avalie cada porco três vezes ao dia durante os três primeiros dias pós-operatórios em busca de sinais de dor e desconforto e administrar analgesia adicional se identificado.
2. Administrar antibióticos pós-operatórios (1 g de cephalexina intramuscularmente) no POD 1-3.
3. Animais socialmente abrigam após o POD 3.

5. Aquisição de tecidos aórticos

1. Realizar aquisição de tecidos em qualquer POD 7, 14 ou 28.
2. Induzir GA como descrito nos passos 2.1-2.5 acima.
   NOTA: A aquisição de tecidos aórticos terminais não precisa ser estéril.
3. 5.3. Reabrir a incisão de laparotomia média anterior, sendo consciente do intestino respeitado para a parede abdominal anterior. Reflito para expor o retroperitoneum e aorta semelhantes aos passos 3.3 acima.
4. Dissecar a aorta até que o aneurisma seja exposto e medir o diâmetro externo do segmento aneurismal com pinças. Calcule a dilatação da aorta (%) usando a seguinte equação: [(diâmetro infra-renal de colheita - diâmetro infrarenal operacional inicial) x 100%]. Uma vez que a medição é alcançada, administrar uma dose letal de pentobarbital-fenitoína (por exemplo, Euthasol) via injeção no IVC.
5. Dissecar a aorta da trifurcação para a aorta suprarenal e explantar o segmento aneurismal com um segmento de controle de aorta não tratada. Coloque a amostra em nitrogênio líquido ou formalina para avaliação histológica.

Resultados

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o teste exato de Fisher ou o teste quadrado do qui como apropriado. Os valores dos dados são relatados como dilatação aórtica média (%) ± desvio padrão (%). Significância estatística foi definida P < 0,05. A combinação de BAPN e cirurgia que fornecem tratamento elastase (cirurgia/elastase) cria a AAA mais robusta e reproduzível em suínos no dia 28 em comparação com aqueles tratados apenas com cirurgia e elastase (dilatação média da aorta (%) ± de...

Discussão

Um modelo novo de AAA infrarenal no suíno foi criado usando uma combinação de angioplastia do balão, perfusão e elastase tópica, e dietética como BAPN. Usando este modelo, a dilatação da aorta de >100% foi alcançada com características brutas e histológicas da doença aneurismal humana crônica. Este modelo fornece uma porta de entrada para entender melhor a fisiopatologia complexa da AAA e traduzir terapias potenciais para a doença humana.

Modelos anteriores de AAA em suínos for...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arrow Ergo Pack System	Arrow	CDC-21242-X1A	Just need 7 Fr dilator
Atlas PTA Balloon dilation catheter	Bard	AT-120184	16 mm x 4 cm x 120 cm
Bovie electrocautery	Bovie Medical	A2350
Collagenase Type 1 (5 gm)	Worthington	LS004196
Crile Needle drviers	MFI medical	61-2201
DeBakey Atraumatic Forceps	MFI medical	52-4977
DeBakey Peripheral Vascular Clamp	Medline	MDS1318119
Glidewire	Terumo Interventional Systems	GS3506	outer Wire diameter 0.035 mm, Length 150 cm
GraphPad Prism 6	GraphPad Software Inc. La Jolla, Calif)		statistical software
Metzenbaum Scissors	MFI medical	61-0004
Mayo-Hegar Needle Holder	tiger medical	N407322
Micropuncture Introducer Set	Cook	G47946
Mixter Forceps, Standard Grade, Right angle	Cole-Parmer	UX-10818-16
Monocryl suture	Ethicon	Y496G-BX	4-0 monocryl
PDS II suture	Ethicon	D8926	Number 1 looped
Porcine Pancreatic Elastase	Sigma-Aldrich	E1250
Satinsky Vascular Clamps	Medline	MDs5632515
Suction canister	Cardinal Health	65651212
Schuco Aspirator	MFI medical	S430A
Vicryl suture	Ethicon	J789D-SD	2-0 vicryl
Yankauer Suction tube	Sklarcorp	07-1801