Modello porcinario dell'aneurisma aortico addominale a infrarosso

Riepilogo

Questo nuovo modello crea robusti aneurismi aortici infrarossi nei suini utilizzando una combinazione di angioplastica a palloncino, perfusione di elastasi/collagesi, applicazione di elastasi topica e somministrazione orali composto di ammisofino, che interferisce con il cross-linking di collagene.

Abstract

I grandi modelli animali per studiare gli aneurismi aortici addominali sono scarsi. Lo scopo di questo modello è quello di creare aneurismi aortici addominali orientali (AAA) riproducibili, clinicamente significativi, nei suini. Per raggiungere questo obiettivo, usiamo una combinazione di angioplastica a palloncino, elastasi e collagenase, e un inibitore di ossidasi lisillo, chiamato za-aminopropionile (BAPN), per creare aneurismi aortici infrarossi clinicamente significativi, analoghi alle malattie umane.

I suini maschi non cagionati vengono alimentati con BAPN per 7 giorni prima dell'intervento chirurgico per ottenere uno stato costante nel sangue. Viene eseguita una laparotomia mediana e l'aorta infrarossa viene sezionata circonferenziale. Una misurazione iniziale viene registrata prima dell'induzione dell'aneurisma con una combinazione di angioplastica a palloncino, elastasi (500 unità)/collagenase (8000 unità) perfusione e applicazione di elastasi topica. I suini vengono alimentati con BAPN ogni giorno fino alla procedura terminale nel giorno postoperatorio 7, 14 o 28, in cui viene misurato l'aneurisma e viene procurato il tessuto. BAPN - i suini chirurgici vengono confrontati con i suini che hanno subito un intervento chirurgico da solo.

I suini trattati con BAPN e chirurgia hanno avuto una dilatazione aortica media dell'89,9% - 47,4% al giorno 7, 105,4% - 58,1% al giorno 14 e 113,5% - 30,2% al giorno 28. I suini trattati con la sola chirurgia avevano aneurismi significativamente più piccoli rispetto agli animali chirurgici BAPN al giorno 28 (p < 0.0003). Il gruppo di chirurgia BAPN - aveva prove macroscopiche e immunohistochimiche della malattia aneurismica allo stadio finale.

Clinicamente significativo a infrarossi AAA può essere indotto utilizzando angioplastica a palloncino, perfusione elastasi/collagenasi e applicazione topica, integrata con BAPN orale. Questo modello crea aAA di grandi dimensioni clinicamente significativi con segni distintivi della malattia umana. Ciò ha importanti implicazioni per la chiarificazione della patogenesi AAA e il test di nuove terapie e dispositivi per il trattamento di AAA. Le limitazioni del modello includono la variazione del BAPN ingerito dai suini, la qualità della perfusione di elastasi e il costo del BAPN.

Introduzione

Secondo il Center for Disease Control (CDC), gli aneurismi aortici (AA) sono una delle principali cause di morte negli Stati Uniti e rappresentano un carico di malattia significativo¹. Un aneurisma aortico è definito come una dilatazione di una porzione discreta del lume del vaso di oltre il 50%². Un sottoinsieme di AA nell'addome, indicato come aneurismi aortici addominali (AAA) sono una preoccupazione crescente. AAA rimangono clinicamente in silenzio fino a rottura o dissezione imminente, con insorgenza acuta, grave dolore addominale essendo generalmente l'unico sintomo che presenta^3,4. La rottura dell'AAA è quasi sempre fatale con un tasso di mortalità del 90%⁵. La chirurgia aperta o endovascolare è l'unica opzione terapeutica per i pazienti e può essere una procedura altamente morbosa. È importante sottolineare che gli AAA sono una delle poche malattie cardiovascolari senza terapia medica per la cura.

Ad oggi, gran parte della ricerca sulla patogenesi AAA si è concentrata sui modelli di roditori, usando l'elastasi, che è un enzima che degrada l'elastina presente nei media aortici, per indurre gli aneurismi. ^6,7 Tuttavia, la traslabilità clinica di piccoli modelli animali a malattie aneurissimale umane è limitata, in quanto la valutazione dei cambiamenti strutturali nell'aorta e l'emodinamica alterata sono limitate a causa delle dimensioni. A causa della somiglianza anatomica e di dimensioni, il sistema circolatorio dei porcini è meglio correlato alla biologia umana rispetto ai roditori⁸. I grandi modelli animali consentono un'ulteriore comprensione dei meccanismi cellulari del processo della malattia, possono essere utilizzati per sviluppare nuovi trattamenti a dosi terapeutiche per i grandi mammiferi e testare dispositivi di riparazione meccanica, che non sarebbero fattibili in piccoli modelli animali. Inoltre, la natura acuta dei modelli di roditori non replica la cronicità e le caratteristiche patologiche della malattia aneurismica umana.

La combinazione di elastasi e un composto chiamato z-aminopropionitrile (BAPN) ha rivoluzionato i modelli Murine AAA, creando aneurismi che sono più grandi e contengono sequela di malattia aneurismatica cronica, tra cui trombo murale, dissezione e rottura⁹. BAPN è un inibitore dell'ossidasi lisilla, che è essenziale per il crosslinking al collagene, una componente cruciale della parete aortica^10,11,12. L'attività di ossidasi liscile diminuisce con l'invecchiamento e data l'associazione dell'età e la natura cronica della complicata AA, BAPN ha un grande potenziale per imitare sperimentalmente gli effetti dell'invecchiamento^9,13,14. L'uso di BAPN e la sua capacità di replicare le malattie croniche in un ambiente subacuto offrono un nuovo vantaggio rispetto ai modelli alternativi di grandi animali di AAA. Rispetto ad altri modelli AAA porcina consolidati, questo modello crea i più grandi aneurismi con segni distintivi della malattia allo stadio finale, e i risultati sono stati precedentemente pubblicati^8,11,15.

Pur conferendo alcuni vantaggi, sono necessarie risorse e investimenti significativi per completare con successo questo modello che può scoraggiare alcuni investigatori. Tra queste risorse figurano l'accesso alle sale operatorie, ai chirurghi qualificati e ai fornitori di anestesia, all'alloggiamento degli animali e al personale veterinario per assisterla nell'assistenza post-operatoria. Inoltre, il costo di BAPN può essere proibitivo per alcuni laboratori.

Esistono pochi grandi modelli animali per studiare la complessa fisiopatologia della formazione di AAA e tradursi in malattie umane. I grandi modelli animali di AAA sono fondamentali per aiutare a valutare la fattibilità di nuove tecnologie e trattamenti per le malattie umane. Pertanto, lo scopo di questo studio era quello di creare un modello riproducibile di araggi infrarossi stadio avanzato AAA nei suini. La logica per l'uso del modello baPN e suina elastasi è quella di comprendere meglio la fisiopatologia di AAA imitando la natura cronica e il sequel della malattia aneurismica umana in un ambiente acuto o subacuto, nonché per testare nuove terapie e dispositivi per AAA Trattamento.

Protocollo

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia (n. 3848).

NOTA: Questo modello è stato precedentemente pubblicato da Cullen et al. ed è un protocollo modificato descritto da Hynecek et al.^8,15.

1. Animali

1. Per gli esperimenti utilizzare suini maschi non castrati del peso di 20-30 kg.
2. Al fine di massimizzare la proporzione di dosi a base di peso di BAPN ingerito, fornire ai maiali pasti divisi di chow standard e 0,15 g/kg di BAPN mescolati con yogurt semplice a latte intero o cibo per cani bagnati. Iniziare la somministrazione BAPN 7 giorni prima dell'operazione dell'indice per raggiungere lo stato costante nel sangue e ogni giorno durante il corso post-operatorio.
   NOTA: BAPN ha numerosi effetti collaterali se ingerito in grandi quantità. Le precauzioni di isolamento per il personale, tra cui berretto, abiti, guanti e copriscarpe, devono essere indossate quando si interagisce con animali alimentati BAPN o che maneggia NOb il BAPN.
3. Fare maiali nil per os (NPO) la notte prima dell'intervento chirurgico.

2. Anestesia

1. Indurre l'anestesia generale (GA) utilizzando tiletamina-zolzepam 6 mg/kg, xilozina (2 mg/kg), e solfato di atropina (0,04 mg/kg) somministrato intramuscolare.
2. Intubare il maiale utilizzando un tubo endotracheale standard (ETT) e lama Miller.
3. Ottenere l'accesso per via endovenosa periferica (IV) utilizzando un 16 o 18 gauge IV in una vena orecchio e fissare in posizione con nastro adesivo.
4. Collegare l'ETT alla macchina per anestesia e mantenere GA utilizzando isoflurane inalato (0,2 mg/kg).
5. Applicare l'elettrocardiogramma (EKG) che conduce e l'ossimerità dell'impulso per monitorare i segni vitali durante l'intervento chirurgico. Prendere la temperatura orale all'inizio della cassa. Posizionare un cuscinetto elettrocauterio sulla porzione dipendente del maiale.
6. Assicurarsi che un membro del personale monitori continuamente e registri regolarmente i segni vitali per garantire che il maiale sia adeguatamente sedato, ventilato e ossigenato, nonché per identificare e intervenire in modo appropriato su qualsiasi instabilità emodinamica durante il Chirurgia.

3. Tecnica chirurgica

1. Eseguire la sterilizzazione dell'area chirurgica utilizzando garza sterile, povidone-iodio e 70% di alcol isopropile. Drappo il maiale nel solito modo sterile. Preleva un campione di sangue prima dell'incisione.
   NOTA: A questo punto, tutte le attrezzature, inclusi strumenti, palloncini, fili, ecc. devono essere sterili.
2. Utilizzando un undici lama o elettrocauterio Bovie, eseguire una laparotomia mediana per entrare nella cavità addominale.
3. Sposta il viscere addominale cefalato alla sinistra del maiale per esporre il retroperitoneo. Coprire l'intestino con un asciugamano blu umido per evitare la disidratazione. Fare una forte incisione per entrare nel retroperitoneo, consentendo l'accesso alla vena cava inferiore (IVC) e all'aorta addominale infrarossa.
   NOTA: L'identificazione e la protezione degli ureteri bilateralmente è fondamentale in questa parte del caso. L'anatomia retroperitoneale suina (compreso il decorso degli ureteri) rispecchia grossolanamente quella degli esseri umani, con sottili variazioni dettagliate di seguito.
4. Sezionata circonferenzalmente l'aorta dai vasi renali, in modo inferiore alla triforcazione aortica. Fare attenzione a evitare IVC e lesioni dell'arteria lombare. Una volta esposta l'intera aorta infrarossa, utilizzare le pinze per misurare il diametro aortico nella parte centrale dell'aorta infrarossa.
   NOTA: A differenza degli esseri umani, i maiali hanno una triforcazione aortica, non la biforcazione.
5. Identificare l'arteria mesenterica caudale sulla parte anteriore dell'aorta infrarossa, che di solito si trova a pochi centimetri prossimati alla triforcazione aortica. Questa arteria non esiste negli esseri umani. Disseta, morsetto e transetto questa arteria. A questo punto, amministrare 5000 unità di solfato di eparina non frazionata per via endovenosa.
6. Cannula l'arteria mesenterica caudale con una guida a 0,018 in filo d'acciaio inossidabile da un set di intromettermi di micropuntura. Dilatano serialmente l'arteria sul filo con un 5 Francese (Fr) e poi un 7 Fr introducer.
7. Lasciando il 7 Fr introducer in posizione, sostituire lo 0.018 in filo con un 0.035 in filo guida, quindi rimuovere il 7 Fr introducer, assicurando l'emostasis con un dito sul sito di canamulation mentre l'introduttore viene rimosso. Inserire uno 0,035 nel filo guida fino a quando non si incontrano circa 30 cm di filo o si incontra la resistenza.
8. Inserire un palloncino di angioplastica transluminale percutaneo da 16 mm sopra il filo nell'aorta infrarossa e posizionarlo al punto medio dell'aorta sezionata. Gonfiare il palloncino misurando in modo intermittente il diametro dell'aorta dilatato con pinze fino a quando la dilatazione massima è di circa l'80% superiore alla misurazione della linea di base.
9. Dopo 10 min di reperfusione, attraversare morsetto l'aorta appena distale ai vasi renali e prossimata alla triforcazione aortica. Identificare e bloccare i vasi lombari precedentemente sezionati per isolare l'aorta infrarosso dalla circolazione sistemica. Questo è importante per evitare la perfusione sistemica di elastasi, che può causare una risposta settica nel periodo post-operatorio acuto.
10. Reintrodurre il 7 Fr introdurrer sopra il filo e rimuovere il filo. Sciacquare il segmento aortico isolato con la salina senza causare perdite di liquido. Collegare la soluzione di elastasi (500 unità) e collagenase (8000 unità) all'introduzione e perfondere 30 mL nell'aorta isolata sotto costante pressione manuale per 10 min. L'intero 30 mL di soluzioni dovrebbe essere introdotto nel segmento isolato.
    NOTA: Un segmento aortico ben perfuso deve essere teso senza perdite dalla parete aortica o dal sito di cannolazione. Un anello del vaso può essere avvolto solo prossima al sito di canulazione per garantire che non si verifichino fughe di elastasi. Nel corso di 10 min, la soluzione elastasi/collagenasi può essere osservata "piangendo" attraverso la parete aortica.
11. Dopo 10 min, irrigare la soluzione dal lume aortico con salina. Rimuovere l'intromotore e legrare il ceppo di arteria mesenterica caudale. Rilasciare tutti i morsetti (i morsetti di lombare prima, seguiti da morsetto disl, quindi clamp prossimale).
    NOTA: Limitare il tempo di morsetto a non più di 10 min al fine di prevenire l'ischemia del midollo spinale. Avere un punto di riparazione (5-0 polipropilene) caricato in caso di sanguinamento dal ceppo dell'arteria mesenterica caudale dopo il rilascio dei morsetti incrociati.
12. Immergere un pezzo di garza chirurgica di 2 cm x 5 cm con 20 mL di elastasi non diluita (27 unità/mL) e avvolgere l'aorta intervenuta per 10 min. Prendere una misura dell'aorta dopo tutti gli interventi con una pinza.
13. Irrigare l'addome con la salina, sostituire l'intestino e chiudere l'addome in tre strati. BAPN inibisce la guarigione della ferita, quindi al fine di ridurre al minimo i rischi di rottura della ferita e dehiscenza fasciale, utilizzare sutura con un lungo tempo di assorbimento ed essere sicuri di prendere morsi giudiziosamente piccole di tessuto ad ogni strato. Utilizzare una sutura Polidioxanone a 1 a ciclo sintetico per la fascia, una sutura 2-0 a treccia intrecciata per il dermico profondo in un secondo momento e una sutura di monofilamento subcuticolare (4-0) per la pelle.

4. Assistenza postoperatoria

1. Utilizzare 0,2 mg/kg sottocutaneo buprenorphine-SR per analgesia post-operatoria. Valutare ogni maiale tre volte al giorno per i primi tre giorni post-operatori per segni di dolore e disagio e somministrare analgesia aggiuntiva se identificata.
2. Somministrare antibiotici postoperatori (1 g di cetforina intramuscolare) su POD 1-3.
3. Socialmente casa animali dopo POD 3.

5. Approvvigionamento di tessuti aortici

1. Eseguire l'approvvigionamento dei tessuti su POD 7, 14 o 28.
2. Indurre GA come descritto nei passaggi 2.1-2.5 sopra.
   NOTA: l'approvvigionamento di tessuti aortici terminali non deve essere sterile.
3. 5.3. Riaprire la precedente incisione laparotomia mediana, essendo cosciente dell'intestino aderito alla parete addominale anteriore. Riflettere l'intestino per esporre il retroperitoneo e l'aorta simili al passo 3.3 sopra.
4. Dissezionare l'aorta fino a quando l'aneurisma è esposto e misurare il diametro esterno del segmento aneurisma con pinze. Calcolare la dilatazione aortica (%) utilizzando la seguente equazione: [(harvest infrarenal diameter - initial operative infrarenal diameter) x 100%]. Una volta raggiunta la misurazione, somministrare una dose letale di pentobarbital-fenitoina (ad esempio, Euthasol) tramite iniezione nell'IVC.
5. Dissezionare l'aorta dalla trifurcazione all'aorta suprarenale ed espiantare il segmento aneurisma con un segmento di controllo di aorta non trattata. Collocare il campione in azoto liquido o formalina per la valutazione istologica.

Risultati

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando Fisher test esatto o chi al quadrato test a seconda dei casi. I valori dei dati vengono riportati come dilatazione aortica media (%) e deviazione standard (%). La significatività statistica è stata impostata p < 0,05. La combinazione di BAPN e chirurgia che fornisce il trattamento dell'elastasi (chirurgia/elastasi) crea aAA più robusti e riproducibili nei suini nel giorno 28 rispetto a quelli trattati con chirurgia ed elastasi da soli (dilatazione aortica me...

Discussione

Un nuovo modello di AAA infrarossi in suini è stato creato utilizzando una combinazione di angioplastica a palloncino, perfusione ed elastasi topica, e dieta come BAPN. Utilizzando questo modello, la dilatazione aortica di >100% è stata ottenuta con caratteristiche lorde e istologiche della malattia aneurismica umana cronica. Questo modello fornisce un gateway per comprendere meglio la complessa fisiopatologia di AAA e tradurre potenziali terapie per la malattia umana.

I modelli precedenti d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arrow Ergo Pack System	Arrow	CDC-21242-X1A	Just need 7 Fr dilator
Atlas PTA Balloon dilation catheter	Bard	AT-120184	16 mm x 4 cm x 120 cm
Bovie electrocautery	Bovie Medical	A2350
Collagenase Type 1 (5 gm)	Worthington	LS004196
Crile Needle drviers	MFI medical	61-2201
DeBakey Atraumatic Forceps	MFI medical	52-4977
DeBakey Peripheral Vascular Clamp	Medline	MDS1318119
Glidewire	Terumo Interventional Systems	GS3506	outer Wire diameter 0.035 mm, Length 150 cm
GraphPad Prism 6	GraphPad Software Inc. La Jolla, Calif)		statistical software
Metzenbaum Scissors	MFI medical	61-0004
Mayo-Hegar Needle Holder	tiger medical	N407322
Micropuncture Introducer Set	Cook	G47946
Mixter Forceps, Standard Grade, Right angle	Cole-Parmer	UX-10818-16
Monocryl suture	Ethicon	Y496G-BX	4-0 monocryl
PDS II suture	Ethicon	D8926	Number 1 looped
Porcine Pancreatic Elastase	Sigma-Aldrich	E1250
Satinsky Vascular Clamps	Medline	MDs5632515
Suction canister	Cardinal Health	65651212
Schuco Aspirator	MFI medical	S430A
Vicryl suture	Ethicon	J789D-SD	2-0 vicryl
Yankauer Suction tube	Sklarcorp	07-1801