Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para enriquecer los espermacitos de paquiteno, espertáidos redondos y elongafines espermatíides de testículos de ratón adultos utilizando un gradiente discontinuo de densidad de albúmina sérica bovina con equipo de laboratorio estándar.

Resumen

Para caracterizar cada paso de la espermatogénesis, los investigadores deben separar diferentes subpoblaciones de células germinales de los testículos. Sin embargo, aislar poblaciones discretas es un reto, porque el testículo adulto contiene una mezcla compleja de células germinales de todos los pasos de la espermatogénesis junto con ciertas poblaciones de células somáticas. En las últimas décadas, diferentes técnicas como la elutriación centrífuga, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y STA-PUT se han aplicado con éxito al aislamiento de células germinales. Un inconveniente es que todos ellos requieren dispositivos dedicados y entrenamiento especializado. Siguiendo los principios subyacentes al método STA-PUT, se ha desarrollado un protocolo simple para el aislamiento de espermacitos de paquiteno, espertánidos redondos y elongados espertáidos de los testículos del ratón. Después de preparar una suspensión de una sola célula de las células testiculares, las poblaciones celulares específicas se enriquecen mediante la sedimentación por gravedad a través de un gradiente discontinuo de densidad de albúmina sérica bovina (BSA). Las fracciones celulares se recogen manualmente y se analizan microscópicamente. Este gradiente de densidad modificado para el protocolo de sedimentación de espermatozoides redondos (MDR) se puede aplicar ampliamente, ya que sólo requiere equipos de laboratorio estándar. Además, el protocolo requiere materiales de partida mínimos, reduciendo su costo y uso de animales de laboratorio.

Introducción

Todavía se desconoce mucho sobre los eventos moleculares y biológicos que tienen lugar durante la espermatogénesis de los mamíferos, un proceso complejo en el que las células madre espermatogoniales se transforman en espermatozoides altamente especializados^1,2. La espermatogénesis tiene lugar dentro de los túbulos seminiferosos de los testículos. Los túbulos contienen una mezcla de células germinales de cada paso de diferenciación, incluyendo células madre espermatogoniales, espermatogonia divisoria mitológica, espermacitos meióticos y espermatozoides posmeióticos (que experimentan diferenciación haploide de espermicidas para alargar los espermatozoides, y finalmente a los espermatozoides maduros). Las células somáticas de los testículos incluyen células Sertoli que se entremezclan con células germinales dentro de los túbulos semilíferos, células mioideas peritubulares que forman paredes de los túbulos, y células Leydig productoras de testosterona en el espacio intersticial entre los túbulos.

El estudio de los procesos moleculares y bioquímicos durante la espermatogénesis a menudo requiere la separación de poblaciones de células germinales distintas de una mezcla compleja de células testiculares. Se han desarrollado muchas estrategias diferentes para el enriquecimiento celular. Los métodos más exitosos son la sedimentación de velocidad STA-PUT por unidad gravedad^3,4,5,6, elutriación centrífuga basada en centrifugación de contraflujo^7,8, y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) que separa las células de acuerdo con el contenido de ADN y/o marcadores específicos. Estos métodos se utilizan comúnmente entre los investigadores de espermatogénesis y permiten el enriquecimiento eficiente de tipos específicos de células germinales. Sin embargo, una limitación de estas técnicas es que requieren hardware especializado y costoso que requiera experiencia.

Aquí se presenta un protocolo simple y económico para aislar las poblaciones enriquecidas de las tres poblaciones celulares más abundantes de testículos de ratón: espertánidos redondos, espermismocitos de paquiteno y elongados espertánidos. Este protocolo se conoce como el gradiente de densidad modificado para los espermatozoides redondos (MDR), porque funciona particularmente bien para enriquecer los espermatozoides redondos. El método MDR se basa en los mismos principios que la sedimentación de velocidad STA-PUT, pero sólo requiere equipos de laboratorio estándar. Las células vivas pueden sedimentar a través de un gradiente de densidad de albúmina de suero bovino (BSA) discontinuo preparado manualmente dentro de un tubo estándar de 50 ml bajo el campo gravitatorio de la tierra. Las células más grandes se mueven más rápido a través del gradiente, que separa diferentes poblaciones de células germinales. Después de la sedimentación, las fracciones enriquecidas de los tres tipos de células se recogen manualmente. La pureza de estas poblaciones celulares enriquecidas es comparable a las obtenidas por STA-PUT y elutriación centrífuga.

Además de cubrir la construcción y el uso del gradiente BSA para la sedimentación de velocidad, el protocolo también describe un método de digestión para liberar las células testiculares de los túbulos seminiferosos. El protocolo fue modificado a partir del desarrollado por Romrell et al.⁹ e incluye digestiones secuenciales con colagenasa IV y trippsina. Se ha demostrado que las digestiones secuenciales combinadas con el uso de un tampón de bicarbonato (es decir, la solución Krebs) mejoran en gran medida la separación y viabilidad de las células germinales⁹.

Durante el enriquecimiento de MDR, las células pasan alrededor de 4 h juntas fuera del entorno de los túbulos seminiferosos y no son sometidas a fuerzas mecánicas estresantes, lo que permite la recolección de fracciones celulares altamente viables para el análisis aguas abajo. Además, al igual que la elutriación centrífuga y STA-PUT, el protocolo MDR no requiere ningún tratamiento químico o etiquetado de las células, lo que también ayuda a mantener su viabilidad. Es importante destacar que tan solo dos testículos de ratón adultos son suficientes para el aislamiento MDR y, por lo tanto, un ratón adulto proporciona suficientes células enriquecidas para el análisis de ARN y proteínas. El protocolo STA-PUT estándar recomienda el uso de hasta 12 ratones adultos para el aislamiento celular^6; aunque, sobre la base de la experiencia previa, se sabe que el aislamiento exitoso se puede hacer de tres a cuatro ratones adultos. La cantidad más baja de material de partida que se ha notificado que es suficiente para la elutriación centrífuga es de seis testículos de ratón (tres ratones)^8. Por lo tanto, además de eliminar la necesidad de costosos equipos especializados, el protocolo MDR reduce el número de animales de laboratorio necesarios.

Protocolo

El mantenimiento de ratones de laboratorio y todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos pertinentes para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Configuración de equipos y reactivos

1. Ajuste el baño de agua a 37 oC.
2. Establezca la incubadora de cultivo celular en 34 oC, 5% CO_2,95% de humedad. Coloque el rotador de tubo dentro de la incubadora.
   NOTA: Las incubadoras requieren mucho tiempo para cambiar la temperatura interna. Si una incubadora está constantemente establecida a 34 oC no está disponible, configure una 1 día antes del experimento.
3. Prepare y etiquete la cantidad adecuada de diapositivas de vidrio de microscopía. Dibuja un anillo de 1 cm de diámetro con una pluma de grasa y deja que la grasa se seque.
4. Preparar 1x búfer Krebs, pH 7.8 (Tabla 1). Ponga dos tubos cónicos con 50 mL de 1x Krebs a 34oC para precalentar los pasos 2.5-2.8. Almacene el resto de los 1x Krebs a 4oC o sobre hielo.
5. Preparar soluciones BSA. Primero prepare 25 ml de solución BSA al 10% (p/v) en Krebs disolviendo 2,5 g de BSA en 1 búfer Krebs a un volumen final de 25 ml. Diluir la solución 10% BSA con 1 búfer Krebs para obtener diferentes concentraciones de BSA (Tabla 2). Mantenga todas las soluciones de BSA a 4 oC.
   NOTA: Preparar las soluciones el mismo día del procedimiento y conservarlas a 4oC hasta su uso.
6. Preparar las enzimas de digestión sopesando la cantidad correcta de tripsina y colagenasa a tubos cónicos de 50 ml (Tabla 3).

2. Disección animal y preparación de la suspensión de células germinales

NOTA: Esto toma aproximadamente 1 h para completar.

1. Sacrificar un ratón macho adulto (de 7 semanas o más, testículo según 80-120 mg dependiendo de la tensión y la edad) por luxación cervical o asfixia por_CO2.
2. Rocíe el abdomen ventral del ratón con 70% de etanol. Abra la cavidad abdominopelvic con tijeras, haciendo una abertura en forma de V.
3. Tirando de la almohadilla de grasa epidérmica con fórceps, localice los testículos y retírelos con tijeras. Evite molestar a la tunica albuginea. Coloque los testículos en una placa Petri de 6 cm que contenga 1x Krebs.
4. Destapar los testículos y desechar la tunica albuginea. Disperse ligeramente los túbulos seminiferosos bistándolos suavemente con fórceps.
5. Utilice fórceps para transferir los túbulos seminiferosos en un tubo cónico de 50 ml que contenga 2 ml de solución de colagenasa recién preparada (Tabla 3).
6. Incubar los túbulos en el baño de agua de 37oC durante 3 min. Agitar suavemente balanceando el tubo.
   NOTA: Los túbulos flotantes deben ocurrir dentro de 3 minutos debido a la eliminación de células intersticiales. La temperatura fisiológica de las células testiculares es de 34 oC; por lo tanto, las digestiónes largas se hacen generalmente a esta temperatura. Sin embargo, la digestión corta de 3 minutos se puede llevar a cabo a 37 oC (temperatura recomendada por el fabricante). Tenga en cuenta que si se utilizan 34 oC, el tiempo de digestión debe ser reoptimizado.
7. Añadir al menos 40 ml de 1x Krebs calientes y dejar que los túbulos sedimenten (1 min) a temperatura ambiente (RT). Retire el sobrenadante y repita 1x.
8. Añadir 25 ml de solución de trippsina recién preparada(Tabla 3), colocar el tubo en el rotador del tubo dentro de la incubadora de 34oC e incubar durante 15 a 20 minutos (15 rpm). Compruebe esporádicamente el estado de los túbulos. Una vez que la solución se nubla y sólo quedan pequeños trozos de túbulos, coloque el tubo en hielo e inmediatamente continúe con el siguiente paso.
   NOTA: Para evitar la sobredigestión y la lisis celular, vaya rápidamente a los siguientes pasos de lavado. Algunos protocolos incluyen la desactivación de la tripsina por suero bovino fetal (FBS). En este protocolo, se omite el tratamiento FBS, y en su lugar, la trippsina se elimina por centrifugación inmediata y posteriores lavados con 1x Krebs fríos.
9. Filtrar la solución a través de un colador de células de 40 m en un nuevo tubo cónico de 50 ml sobre hielo.
10. Centrífuga 600 x g durante 5 min a 4oC para peletizar las células.
    NOTA: La centrifugación con una fuerza demasiado fuerte puede dañar las células.
11. Retire el sobrenadante desvelándolo cuidadosamente.
12. Toque el gránudo celular para resuspender las células en el resto de 1x Krebs.
13. Agregue al menos 40 ml de 1x Krebs fríos a las células resuspendidas.
14. Repita los pasos 2.10 y 2.11.
15. Toque el tubo con el pellet celular para resuspender las células. Añadir 1 mL de 0,5% de BSA en 1x Krebs y con una punta de pipeta cortada resuspender las células mediante la pipeteo de la solución hacia arriba y hacia abajo. Evite hacer burbujas.
16. Por último, añadir 1 x 3 ml de 0,5% de BSA en 1x Krebs para que el volumen final sea de 3 ml. Filtrar la suspensión de la célula germinal a través de un colador de células de 40 m y proceder inmediatamente a cargar las células en el gradiente BSA.

3. Separación de células germinales a través del gradiente BSA discontinuo

NOTA: Esta sección tarda aproximadamente 2 h en completarse. Comience a preparar el gradiente discontinuo de BSA durante los pasos de lavado (pasos 2.10-2.14) para cargar las células tan pronto como el pretratamiento esté listo.

1. Acomode un tubo de 50 ml verticalmente sobre hielo para que sea posible ver un lado del tubo. Alternativamente, ejecute el protocolo en una cámara frigorífica a 4 oC, en cuyo caso no se necesita hielo.
2. Corte la punta de una pipeta serológica de 10 ml desde la punta para obtener una apertura más grande(Figura 1A)y móntela en el controlador de pipeta(Figura 1C).
   NOTA: Esto disminuirá la velocidad durante el pipeteo, lo que facilita el apilamiento de las diferentes soluciones BSA. Alternativamente, utilice una pipeta mecánica de 1 ml con un pistón liso y corte las puntas de la pipeta con una apertura de aproximadamente 3 mm de diámetro(Figura 1B).
3. Comience pipeteando 5 ml de solución 5% BSA en la parte inferior del tubo de 50 ml.
4. Tubería lentamente 5 ml de 4% de solución BSA en la parte superior de la solución 5%. Comience tocando suavemente la superficie de la solución del 5% con la punta cortada de la pipeta y coloque las dos soluciones manteniendo cuidadosamente el contacto con la superficie, asegurando no permitir que la punta de la pipeta se sumerja.
   NOTA: Una línea clara debe ser visible entre las dos capas al final de este paso.
5. Repita el paso 3.4 con las otras soluciones BSA para obtener un gradiente discontinuo del 5% al 1%(Figura 1D).
6. Cargue cuidadosamente la suspensión de una sola celda en la parte superior del gradiente sin molestar. Dejar que las células sedimenten a través del gradiente durante 1,5 h a 4 oC o sobre hielo.

4. Colección de fracciones de células germinales enriquecidas

NOTA: Esta sección tarda aproximadamente 30 minutos en completarse.

1. Monte una punta de pipeta de 1 ml en una pipeta mecánica de 1 ml y corte la punta de modo que la abertura tenga un diámetro de 3 mm(Figura 1B).
2. Recoja cuidadosamente fracciones de 1 ml en tubos separados de 1,5 ml, comenzando desde la parte superior del gradiente BSA, y guárdelas en hielo. Numerar los tubos en el mismo orden en que se recogerán las fracciones.
   NOTA: En este punto, debe haber una serie de tubos de 28 tubos que contengan suspensiones celulares. Utilice una pipeta mecánica de 1 ml con un pistón liso y corte las puntas de la pipeta para minimizar el riesgo de perturbar el gradiente BSA.
3. Centrifugar las fracciones de células germinales a 600 x g durante 10 min a 4 oC.
4. Tenga cuidado de no molestar el pellet, deseche la mayor parte del sobrenadante y resuspenda el pellet celular moviendo el tubo. Añadir 1 ml de tampón de 1x Krebs frío en hielo a cada tubo y repetir centrifugación.
   NOTA: Repita el paso de lavado si BSA interfiere con el análisis posterior.
5. Deseche la mayor parte del sobrenadante, pero deje 100 l después del lavado final. Resuspenda el pellet celular con cuidado.
   NOTA: La resustitución de las células cuidadosamente garantiza que la muestra tomada de esta solución representa todas las celdas de la fracción dada. Mantenga las suspensiones celulares sobre hielo mientras prepara los portaobjetos.

5. Análisis de Fracciones Celulares

NOTA: El análisis tarda 2 h en completarse.

1. Uno a la vez, pipeteo de 20 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) dentro de cada anillo de pluma de grasa en una diapositiva de microscopía numerada.
2. Añadir inmediatamente 2 l de la suspensión de la célula resuspendida de la fracción correspondiente. Repita el proceso para cada fracción.
   NOTA: Mientras prepara las diapositivas, mantenga todas las suspensiones celulares sobre hielo.
3. Seque los portaobjetos en RT durante 1 h hasta la noche (O/N).
   NOTA: Durante este paso, después de tomar una muestra de cada fracción, las celdas se pueden procesar para análisis o almacenamiento posteriores (sección 6).
4. Enjuague las diapositivas una vez con 1PBS y monte con medio de montaje con 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)(Tabla de Materiales).
5. Analice las diapositivas bajo un microscopio de fluorescencia para estimar qué tipo particular de célula germinal se enriquece en cada fracción.
   NOTA: Diferentes tipos de células pueden ser reconocidos por su morfología nuclear característica visualizada por la tinción DAPI. Figura 2 A muestra fracciones representativas enriquecidas en elongafines espertálados, espertánidos redondos y espermacitos de paquiteno. El núcleo espertático redondo es pequeño (6 x 7 m de diámetro) y redondo(Figura 2A). Los núcleos espermátidos redondos del ratón también se caracterizan por una sola estructura de heterocromía redonda llamada cromocentro. Los núcleos de los espermicidas de alargamiento tienen una forma típica alargada y un tamaño nuclear reducido debido a la condensación de cromatina(Figura 2A). Los núcleos de espermatocitos de paquiteno son mucho más grandes (diámetro superior a 10 m) y de forma más irregular, con áreas de cromatina densamente embalada distribuidas en todo(Figura 2A).
6. Si es necesario, realice inmunomanchas además de la tinción DAPI para apoyar el reconocimiento de los diferentes tipos de células.
   1. En este caso, esparza 2 ml de suspensión celular con 20 ml de una solución de fijación (4% PFA y tensioactivo no iónico al 0,1% en PBS) dentro de un anillo de pluma de grasa. Después de secar las diapositivas, postfijar las células con 4% PFA durante 10 min en RT.
   2. Enjuague con PBS, luego permeabilice con tensioactivo no iónico al 0,1% en PBS durante 5 min. Enjuague con PBS y desactive cualquier PFA restante incubando diapositivas en 100 mM NH₄Cl durante 5 min.
   3. Enjuague con PBS y proceda a un protocolo de inmunofluorescencia estándar que consiste en bloqueos e incubaciones con anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios etiquetados con fluorocromo. Monte los portaobjetos con soporte antidescolorcon dAPI(Tabla de materiales)y permita que se ajusten durante 24 horas.
      NOTA: Ejemplos de marcadores útiles para la incubación de anticuerpos primarios incluyen aglutinina de cacahuete (PNA; 1:2,000 en solución de bloqueo) que mancha el acrometo en espermatidos redondos y alargados, anticuerpo anti-DDX4 (1:200 en solución de bloqueo) que etiqueta un solo gránulo citoplasma citoflásico en espermicidas redondos y anticuerpoanti-H2AX (1:100 en solución de bloqueo) que reconoce los cuerpos sexuales en los espermatocitos de paquiteno. Véanse los resultados representativos y la Figura 2C,D para ver ejemplos de análisis de inmunofluorescencia de las fracciones.

6. Procesamiento de las muestras restantes para el almacenamiento

NOTA: La sección 6 tarda aproximadamente 20 minutos en completarse.

1. Una vez que se haya tomado una muestra de cada fracción para una diapositiva de microscopía, agregue 1 ml de 1x Krebs helados a cada fracción y centrifugar las células a 600 a 13.000 x g durante 10 min a 4 oC.
   NOTA: Una centrifugación de baja velocidad resulta en un pellet suelto, lo que hace que sea difícil eliminar por completo 1x Krebs, mientras que una centrifugación de alta velocidad puede dañar las células. Elija la velocidad de centrifugación de acuerdo con los requisitos específicos del protocolo descendente.
2. Retire y deseche el sobrenadante y continúe con el análisis descendente preferido.
   NOTA: En este punto, las células pueden ser congeladas a presión en nitrógeno líquido y almacenadas a -70 oC. Una vez familiarizado con esta técnica, es posible continuar con el protocolo descendente de preferencia directamente, pero siempre es aconsejable tomar una muestra y asegurar la pureza de cada fracción. El ARN total se puede extraer, cuantificar y analizar mediante métodos como la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (PCR) y la secuenciación del ARN. También se pueden preparar extractos de proteínas totales a partir de los cuales se pueden realizar análisis de inmunoprecipitación o hincha occidental(Figura 3).

Resultados

Por lo general, se considera que el enriquecimiento suficiente de un tipo de célula germinal es superior al 80%⁶. El protocolo MDR funciona particularmente bien para enriquecer los espermatozoides redondos. Se puede obtener rutinariamente un alto número de espermatozoides redondos puros >90% utilizando esta técnica. Las fracciones óptimas de los espermatocitos de paquiteno y los espermatídidos elongantes se enriquecen al 75% y al 80%, respectivamente. Los espermicidas alargados tienden a permanecer en cima del gradiente y se recogen con la primera fracción. En el ejemplo mostrado, la fracción 1 contenía el 80% de los espermatídidos de alargamiento(Figura 2B). La mayoría de los espermatidos alargados obtenidos con esta técnica han condensado núcleos, mientras que los espermicidas de alargamiento temprano no condensados son escasos(Figura 2A). Las siguientes fracciones contienen espermatozoides redondos enriquecidos. En el ejemplo, el enriquecimiento de espermatidos redondos fue de más del 90% en las fracciones 2, 3 y 4, y el enriquecimiento por encima del 80% se vio en conjunto en siete fracciones (2-8)(Figura 2B). Debido a su gran tamaño, los espermatocitos de paquiteno sedimentan más rápido y se recogen en último lugar. En el ejemplo de purificación, el enriquecimiento fue de alrededor del 75% en las fracciones 14 y 15(Figura 2B).

Mientras que la morfología nuclear, visualizada por la tinción DAPI, generalmente es suficiente para el reconocimiento de las células, el análisis de inmunofluorescencia se puede realizar para apoyar el análisis. PNA mancha los acromas en desarrollo de espermatidos redondos y alargadores, y la apariencia acrosomal puede ser explotada para categorizar aún más los espermatidos redondos en los pasos 1-8 de la diferenciación¹⁰. Distinguir los espermatidos redondos y de antaño teñidos con ANP se basa en las diferencias en su forma nuclear(Figura 2C, panel izquierdo). El anticuerpo anti-DDX4 es un marcador útil para las fracciones espermabíidas redondas, ya que visualiza un solo gránulo perinuclear DDX4 positivo, el cuerpo cromatoide (CB), en el citoplasma de cada espermatozoide redondo. Esta tinción específica de CB es fácil de distinguir de la tinción citoplasma más ampliamente distribuida en espermatocitos(Figura 2C,panel medio). Los espermatocitos de paquiteno pueden ser reconocidos por el anticuerpo anti-H2AX que etiqueta el cuerpo sexual nuclear que aparece específicamente en la fase del paquiteno de la primera división meiótica(Figura 2C,panel derecho). En esta purificación, la tinción de PNA reveló que las fracciones espermatidedas redondas enriquecidas con MDR contenían una mezcla de espermatidos redondos en varios pasos de diferenciación, todos conteniendo su estructura de firma, el DDX4-positivo CB(Figura 2D, Fracción RS). Anti-H2AX validó aún más los espermacitos de paquiteno de enriquecimiento en la fracción 16(Figura 2D, fracción pSpc).

El recuento celular reveló que el número de células en las fracciones redondas de espermatozoides y paquiteno es adecuado para varios análisis posteriores. Las fracciones espermáticas redondas (5-8) contenían cada una alrededor de 2.5 x 10⁶ células. Por lo tanto, al agrupar estas fracciones, es posible obtener más de 10 millones de células. Las fracciones de espermatocitos de paquiteno (14 y 15) generalmente contenían algo menos de células. En este aislamiento, se contaron alrededor de 1.5 x 2.0 x 10⁶ células por fracción. La primera fracción contenía 0,75 x 10⁶ espermicidas alargados.

Como se muestra en la Figura 3A, la cantidad total de ARN obtenida de la mayoría de las fracciones osciló entre 0,5 y 2,5 g, lo que es suficiente para los análisis de ARN aguas abajo, como PCR de transcripción inversa, secuenciación de ARN o visualización de ARN en un gel. La cantidad de proteína obtenida de cada fracción suele oscilar entre 20 y 140 g(Figura 3B),que es suficiente para varias manchas occidentales. Se prepararon lisatos de células enteras a partir de fracciones recogidas, y el análisis de manchas occidentales se realizó utilizando anticuerpos que detectan DDX4, PIWIL1 y PIWIL2, que están muy expresados en espermatocitos de paquiteno y espermamicidas redondos, así como en los ubicuos gliceraldehydo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

En este protocolo, el 10% de los lelístas proteicos derivados de fracciones individuales era suficiente para detectar claramente todas estas proteínas en un ajuste estándar de la mancha occidental(Figura 3C). También se demostró que la cantidad de proteína en una fracción era suficiente para la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo contra PIWIL1, así como para la detección de PIWIL2 coinmunocida(Figura 3D). Además, este protocolo se ha utilizado con éxito para obtener fracciones enriquecidas de espermacitos de paquiteno y espermatidos redondos de ratones de control y genéticamente modificados para aplicaciones posteriores, como la transcripción inversa cuantitativa PCR¹¹ y la secuenciación de ARN de alto rendimiento¹².

Figura 1: Preparación de un gradiente BSA discontinuo. (A) Una punta de pipeta serológica de 5 ml para la preparación del gradiente. (B) Una punta de pipeta de 1 ml para la preparación del gradiente y la recolección de las fracciones de célula germinal después de la sedimentación. (C) El equipo necesario para la preparación del gradiente. (D) Vista lateral del gradiente de densidad BSA discontinuo del 5% (abajo) a la solución BSA del 1% (superior); las soluciones BSA del 2% y 4% son de color azul para una mejor visualización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de las fracciones celulares recogidas y el análisis de enriquecimiento. (A) Células testiculares manchadas de DAPI. La fila superior muestra las células testiculares en el epitelio semivagabundo intacto de una sección de testículos fija en PFA, incrustada en parafina (izquierda) o en suspensión (derecha). La fila inferior muestra fracciones de espertánidos alargados enriquecidos (ES), espertáidos redondos (RS) o espermacitos de paquiteno (PSpc). Barras de escala de 20 m para la fila superior y 10 m para los inserciones de la fila inferior. (B) Cuantificación relativa de los diferentes tipos de células germinales en cada fracción. Las células se contaron manualmente usando el software ImageJ y se clasificaron en celdas RS, ES, PSpc, Sertoli y otras celdas. Los números de fracción y los porcentajes respectivos de BSA en el gradiente se indican en el eje X. (C) Análisis de inmunofluorescencia de células testiculares. Panel izquierdo: PNA con etiqueta de rodamina mancha el acrósoma tanto en ES (flecha amarilla) como en RS (flecha blanca). Panel medio: El anticuerpo DDX4 mancha un solo gránulo perinuclear en RS, que es fácil de distinguir de la señal citoplasmática más difusa en los espermacitos (flecha azul). No se detecta ninguna señal DDX4 en ES (flecha naranja). Panel derecho: El anticuerpo h2AX reconoce el cuerpo sexual nuclear característico presente sólo en los espermatocitos de paquiteno (células negativas de H2AX marcadas con un asterisco blanco). Las barras de escala de 10 m.(D) las fracciones de celda enriquecidas con MDR se etiquetaron con PNA (fracción RS), anti-DDX4 (fracción RS) y anti-H2AX (fracción PSpc) para validar aún más el enriquecimiento celular en cada fracción. Barras de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis aguas abajo después del enriquecimiento de células MDR. (A) el ARN se extrajo de cada fracción después de un enriquecimiento representativo de células MDR y se cuantificó. Los números de fracción y los porcentajes respectivos de BSA en el gradiente se indican en el eje X. (B) Las proteínas se extrajeron de cada fracción al lisar el pellet celular en el ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón y luego se cuantificaron. (C) Los extractos de proteína sofial fueron preparados y analizados por la hincha occidental utilizando anticuerpos contra DDX4, PIWIL1, PIWIL2 y GAPDH. El 10% del islafueo se cargó desde cada fracción indicada. (D) La inmunoprecipitación se realizó a partir de fracciones indicadas utilizando anti-PIWIL1 seguida de la hincha occidental con anticuerpos anti-PIWIL1 y anti-PIWIL2. La muestra de entrada incluye una mezcla de lemiles proteicos de diferentes fracciones, y la inmunoprecipitación de control (IP) utilizando IgG de conejo también se realizó a partir de un lisato mixto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Representación esquemática del protocolo MDR y tiempo necesario para completar cada paso. El material de partida se compone de dos testículos de un ratón adulto. Se indica el número medio de células y la cantidad de ARN y proteína obtenida de una fracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Búfer	Reactivos	Preparación	Almacenamiento
Búfer Krebs (10x)	3.26 g KH2PO4	Llevar a 2 L con H2O, filtro 0,22 m y autoclave.	Se puede almacenar a 4 oC durante varios meses
	139.5 g NaCl
	5.89 g MgSO4•7H2O
	50 g dextrosa
	3.78 g CaCl2•2H2O
	7.12 g KCl
Búfer Krebs (1x)	4.24 g NaHCO3	Disolver NaHCO3 a 100 mL de H2O, añadir 200 mL de 10x Krebs buffer, y llevar a 2 L con H2O.	Para ser preparado fresco
	200 mL 10x Colchón Krebs

Tabla 1: Preparación del buffer Krebs.

Concentración de BSA (p/v)	Solución 10% BSA	1x buffer Krebs
0.50%	0,5 ml	9,5 ml
1%	1 mL	9 ml
2%	2 ml	8 ml
3%	3 ml	7 ml
4%	4 ml	6 mL
5%	5 mL	5 mL

Tabla 2: Preparación de soluciones BSA.

Solución de digestión	Concentración de trabajo	Reactivos	Preparación
Colagenasa	1 mg/ml	Colagenasa IV	Pesar 2 mg de colagenasa IV a un tubo cónico de 50 ml, y añadir 2 ml de tampón caliente 1x Krebs justo antes de la digestión (paso 2.3).
Tripsina	0,6 mg/ml	Tripsina	Pesar 15 mg de tripsina a un tubo cónico de 50 ml, y añadir 25 ml de tampón caliente 1x KREBS y 40 l de DNase I justo antes de la digestión (paso 2.6).
	>3.2 ku/mL	DNase I

Tabla 3: Preparación de las enzimas de digestión.

Discusión

Aquí se presenta un protocolo simple y económico para aislar las poblaciones enriquecidas de espermicidas redondos, espermatocitos de paquiteno y espermicidas de alargamiento utilizando equipos de laboratorio estándar (resumen del protocolo que se muestra en la Figura 4). Aunque no se requiere experiencia o maquinaria costosa, hay algunos pasos críticos que deben ser considerados durante la digestión del tejido, la construcción del gradiente, y la carga de la suspensión celular en el gradiente.

Las células germinales se liberan de los túbulos seminiferosos por dos digestión enzimáticas consecutivas. La primera digestión con colagenasa IV separa los túbulos seminiferosos mediante la eliminación de células intersticiales. El tiempo prolongado de digestión puede dañar los túbulos y conducir a la pérdida de espermitidos, ya que (si se liberan de los túbulos durante este paso) se descartarán en los siguientes pasos. El segundo paso de digestión con tripsina libera células germinales de los túbulos seminiferosos. Puede haber lisis celular ocasional y por lo general se forman algunos grumos debido a la liberación de ADN genómico. No se recomienda exceder la duración o temperatura sugerida de la digestión, ya que esto puede conducir a una peor viabilidad, aumento de la lisis celular y aglomeración. Si se produce un aglutinamiento leve, los grumos pueden ser ignorados. Sin embargo, en casos de aglomeración significativa y pérdida de células, tiempo de digestión de trippsina o concentración debe reducirse. También debe tenerse en cuenta que la actividad enzimática de la trippsina puede variar entre lotes y durante tiempos prolongados de almacenamiento. La cantidad de DNase I durante la digestión de la trippsina también se puede aumentar para eliminar el exceso de grumos, pero esto debe considerarse una solución secundaria. Es importante obtener una suspensión homogénea de una sola célula al final del pretratamiento, ya que las células agrupadas se sedimentarán más rápido, contaminando las fracciones y alterando el gradiente.

Construir el gradiente puede requerir cierta práctica. Si hay molestias utilizando una punta de pipeta de 5 ml con un controlador de pipeta, se recomienda utilizar una pipeta mecánica normal de 1 ml con un pistón liso y luego cortar las puntas de la pipeta a una abertura de 3 mm de diámetro(Figura 1B). Una apertura más amplia y una carga suave de las soluciones BSA disminuirán el riesgo de mezclar el gradiente. Cuando se prepara correctamente, es posible ver los límites entre las soluciones BSA adyacentes debido a sus diferentes índices de refracción. El degradado debe producirse directamente antes de su uso. También debe tenerse en cuenta que cualquier pequeño temblor o vibración puede perturbar el gradiente, por lo que el gradiente debe establecerse en un entorno donde no se perturbará.

La carga de la suspensión de la celda en el gradiente debe hacerse con mucho cuidado. Después de la carga, la suspensión celular debe permanecer en la parte superior del gradiente, desde el cual las células comenzarán a sedimentar lentamente a través de la primera capa. Si se ven grandes grupos de células moviéndose rápidamente a través del gradiente, es probable que las celdas no se resuspendieron cuidadosamente o hay un exceso de aglomeración. Si las células no permanecen en la parte superior del gradiente BSA discontinuo al cargarse, pero se hunden inmediatamente entre las capas de BSA del 1% y 2% (paso 3.6), es probable que la suspensión celular sea demasiado densa. Este protocolo se ha optimizado utilizando dos testículos de un ratón adulto (80-120 mg/testis) como material de partida; aunque se han realizado aislamientos exitosos utilizando cantidades reducidas de material de partida. Para ampliar el protocolo y obtener células germinales más enriquecidas a partir de un mayor número de testículos, se deben introducir más tubos de 50 ml con el gradiente.

El protocolo fue desarrollado y optimizado inicialmente para enriquecer los esperlátidos redondos haploides de los testículos adultos del ratón, y se espera que la pureza de las fracciones espermatide redondas sea superior al 90%. Además de las fracciones espermabíidas redondas altamente puras, se obtuvieron resultados satisfactorios para el enriquecimiento de espermacitos de paquiteno y elongafines espermatídidos. Cabe señalar que los eritrocitos pueden contaminar las fracciones elongatideles espermatideles, y se deben tomar medidas adicionales para eliminarlas si se espera que su presencia interfiera con los análisis posteriores. No hemos sido capaces de enriquecer otros tipos de células como células premeióticas o meióticas tempranas (antes de la fase de paquiteno) de ratones adultos utilizando el protocolo MDR.

Además, la sedimentación STA-PUT se ha utilizado con éxito para obtener fracciones enriquecidas de espermatogonia o preleptoteno, leptoteno y esperbeno cigoteno utilizando testículos juveniles recogidos en determinados momentos después del nacimiento^13. Este enfoque aprovecha la apariencia de estos tipos de células durante la primera onda de espermatogénesis. Es probable que el mismo enfoque se aplique al enriquecimiento de MDR, pero aún no se ha probado en la práctica. Otro método que es una buena opción para la purificación de células premeioticas y meióticas en etapas específicas de diferenciación es facS, que tiene la importante ventaja de permitir el aislamiento de tipos de células específicas basados en los marcadores específicos de presencia^{14 ,15,16,17}.

En general, la sedimentación de velocidad MDR sirve como un método útil para el enriquecimiento de células germinales. Si bien este método no es superior a otros métodos bien establecidos en términos de pureza o cantidad de células enriquecidas, sus claras ventajas son su simplicidad y bajos costos de configuración. Esto, junto con la baja cantidad de materiales de partida requeridos, hacen de este protocolo una gran opción para los investigadores en el campo de la espermatogénesis y aquellos en otros campos que tal vez no deseen invertir en hardware especializado o grandes grupos de animales.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Preference of researcher
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	A-31571
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9647
CaCl2·2H2O	Preference of researcher
Collagenase IV	Sigma	C5138
Complete protease inhibitor cocktail	Roche	11836145001
DDX4 antibody	Abcam	ab13840
Dextrose	Preference of researcher
DNase I	Worthington	LS006355
GAPDH	HyTest	5G4
HRP-linked anti-mouse IgG	GE Healthcare Life Sciences	NA931
HRP-linked anti-rabbit IgG	GE Healthcare Life Sciences	NA934
KCl	Preference of researcher
KH2PO4	Preference of researcher
MgSO4·7H2O	Preference of researcher
NaCl	Preference of researcher
NaHCO3	Preference of researcher
NH4Cl	Preference of researcher
Pierce BCA protein assay kit	Life Technologies	23227
PIWIL1	Cell Signaling Technology	G82
PIWIL2, clone 13E-3	Millipore	MABE363
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36962	for Alexa Fluor immunostainings
Rabbit IgG	Neomarkers	NC-100-P
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)	Vector Laboratories	RL-1072
RIPA buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT
TRIsure	Bioline	BIO-38033
Triton X-100	Preference of researcher		nonionic surfactant
Trypsin	Worthington	LS003703
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	for standard DAPI analysis of cell fractions
γH2AX antibody	Millipore	05-636
0.22 µm filter	Sartorius	Sartolab BT 180C6	or equivalent
1 mL mechanical pipette	Preference of researcher
1.5 mL or 2 mL tubes	Preference of researcher
40 µm cell sieves for 50 mL tubes	Greiner Bio-One	542040	or equivalent cell strainer
5 mL serological pipettes	Sarstedt	86.1254.001	or equivalent
50 mL conical tubes	Preference of researcher
6 cm Petri dishes	Preference of researcher
Cell culture incubator	Preference of researcher
Centrifuge for 50 mL tubes	Preference of researcher
Grease pen for microscopy glass slides	Preference of researcher
HulaMixer Sample Mixer	Thermo Fisher Scientific	15920D	or equivalent cell rotator
Microdissection forcepts	Preference of researcher
Microdissection scissors	Preference of researcher
Microscopy glass slides and coverslips	Preference of researcher
Nanodrop 1000	Thermo Scientific
Pipetboy Acu 2	Integra	155 000	or equivalent pipette controller
Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes	Preference of researcher
Tips for 1 mL mechanical pipette	Preference of researcher
Water bath	Preference of researcher
Widefield fluorescence microscope	Preference of researcher