Un flujo de trabajo de integración de datos para identificar combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas

Resumen

Las pantallas genéticas grandes en organismos modelo han llevado a la identificación de interacciones genéticas negativas. Aquí, describimos un flujo de trabajo de integración de datos utilizando datos de pantallas genéticas en organismos modelo para delinear combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas en el cáncer.

Resumen

Una interacción letal sintética entre dos genes se da cuando el knock-out de cualquiera de los dos genes no afecta a la viabilidad celular, pero el knock-out de ambos interactores letales sintéticos conduce a la pérdida de viabilidad celular o la muerte celular. La interacción letal sintética mejor estudiada es entre BRCA1/2 y PARP1, con inhibidores de PARP1 que se utilizan en la práctica clínica para tratar a pacientes con tumores mutados de BRCA1/2. Las pantallas genéticas grandes en organismos modelo pero también en variedades de células humanas haploides han llevado a la identificación de los pares mortales sintéticos numerosos adicionales de la interacción, todos siendo blancos potenciales del interés en el desarrollo de terapias nuevas del tumor. Un acercamiento es terapéutico a los genes de la blanco con un interactor mortal sintético que se mute o downregulated perceptiblemente en el tumor del interés. Un segundo enfoque es formular combinaciones de fármacos que aborden las interacciones letales sintéticas. En este artículo, se describe un flujo de trabajo de integración de datos para evaluar e identificar combinaciones de fármacos dirigidas a las interacciones letales sintéticas. Hacemos uso de los conjuntos de datos disponibles sobre pares de interacción letal sintética, recursos de mapeo de homología, enlaces de fármacos objetivo de bases de datos dedicadas, así como información sobre medicamentos que se están investigando en ensayos clínicos en el área de interés de la enfermedad. Destacamos además los hallazgos clave de dos estudios recientes de nuestro grupo sobre la evaluación de la combinación de fármacos en el contexto del cáncer de ovario y de mama.

Introducción

La letalidad sintética define una asociación de dos genes, donde la pérdida de un gen no afecta a la viabilidad, pero la pérdida de ambos genes conduce a la muerte celular. Fue descrito por primera vez en 1946 por Dobzhansky mientras analizaba varios fenotipos de drosophila mediante la cría de mutantes homocigóticos¹. Los mutantes que no produjeron descendencia viable, aunque viables ellos mismos, exhibieron fenotipos letales cuando se cruzaron con ciertos otros mutantes, sentando las bases para el establecimiento de la teoría de la letalidad sintética. Hartwell y sus colegas sugirieron que este concepto podría ser aplicable a la terapia contra el cáncer en humanos². La letalidad sintética provocada farmacológicamente podría basarse en una sola mutación, dado que la pareja letal sintética del gen mutado es atacable por un compuesto farmacológico. El primer par del gene para permitir la inducción farmacológica de la mortalidad sintética era BRCA (1/2) y PARP1. PARP1 funciona como un sensor para el daño en el ADN, y está vinculado a sitios de doble y simple cadena de ADN-roturas, supercoils y cruces³. BRCA1 y 2 juegan un papel importante en la reparación de las roturas de doble cadena de ADN a través de la recombinación homóloga⁴. El granjero y los colegas publicaron hallazgos que las células deficientes para BRCA1/2 eran susceptibles a la inhibición de PARP, mientras que no se observó citotoxicidad en las células de tipo salvaje de BRCA^5. En última instancia, los inhibidores de PARP fueron aprobados para el tratamiento del cáncer de mama y ovario deficiente en BRCA^6,7. Además, los pares de genes de letalidad sintética que conducen a la aprobación clínica de compuestos farmacológicos son muy esperados y un área importante de los esfuerzos recientes de investigación del cáncer⁸.

Las interacciones genéticas letales sintéticas se modelaron en múltiples organismos, incluidas las moscas de la fruta, C. elegans y la levadura^2. Utilizando varios enfoques, incluyendo knockouts de ARN-interferencia y CRISPR/CAS-biblioteca, se descubrieron nuevos pares de genes letales sintéticos en los últimos años^9,10,11. Housden y sus^colegaspublicaron recientemente un protocolo sobre los procedimientos experimentales de RNAi en combinación con CRISPR/CAS. Mientras tanto, los investigadores también realizaron grandes pantallas en células humanas haploides para identificar interacciones letales sintéticas^13,14. Los métodos in silico como el análisis biológico de redes y el aprendizaje automático también han demostrado ser prometedores en el descubrimiento de interacciones letales sintéticas^15,16.

Concepciónmente, un acercamiento para hacer uso de interacciones mortales sintéticas en el contexto de la terapia antitumores es identificar las proteínas transformadas o no-funcionales en células del tumor, haciendo a sus socios mortales sintéticos de la interacción que prometen las blancos de la droga para la intervención terapéutica. Debido a la heterogeneidad de la mayoría de los tipos de tumores, los investigadores han comenzado la búsqueda de las llamadas proteínas sintéticas letales del cubo. Estos cubos mortales sintéticos tienen un número de socios mortales sintéticos de la interacción que sean transformados y por lo tanto no funcionales o downregulated perceptiblemente en muestras del tumor. Abordar estos centros letales sintéticos es prometedor para aumentar la eficacia de los fármacos o superar la resistencia a los medicamentos, como podría demostrarse, por ejemplo, en el contexto del neuroblastoma resistente a la vincristina¹⁷. Un segundo enfoque para mejorar el tratamiento farmacológico haciendo uso del concepto de interacciones letales sintéticas es identificar combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas. Esto podría conducir a nuevas combinaciones de terapias antitumorales únicas ya aprobadas y al reposicionamiento de fármacos de otras áreas de la enfermedad al campo de la oncología.

En este artículo, presentamos un procedimiento paso a paso para producir una lista de combinaciones de fármacos que se dirigen a pares de interacción letales sintéticas. En este flujo de trabajo, (i) utilizamos datos sobre interacciones letales sintéticas de BioGRID y (ii) información sobre genes homólogos de Ensembl, (iii) recuperamos pares fármaco-diana de DrugBank, (iv) creamos asociaciones enfermedad-fármaco de ClinicalTrials.gov, y (v) por lo tanto generamos un conjunto de combinaciones de fármacos que abordan interacciones letales sintéticas. Por último, proporcionamos combinaciones de fármacos en el contexto del cáncer de ovario y de mama en la sección de resultados representativos.

Protocolo

1. Recuperación de pares de genes letales sintéticos

1. Recuperación de datos de BioGrid.
   1. Descargue el último archivo de interacción BioGRID en formato tab2 desde https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip ya sea utilizando un navegador web o directamente desde la línea de comandos de Linux usando curl o wget¹⁸.
      
      ##download y desempaquetar el último archivo de interacción bioGRID
      #download último archivo de interacción bioGRID utilizando curl
      curl -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack el archivo de datos descargado
      descomprimir biogrid_latest.zip
      BG="BIOGRID-ALL-3.5.171.tab2.txt"
       
   2. Una vez descargado el archivo zip, desempaquetar el archivo debe y anotar el nombre del archivo de conjunto de datos real (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) para los pasos posteriores. El archivo de datos BioGRID contiene interacciones de diferentes tipos que se filtrarán en el paso siguiente.
      NOTA: Existen otras fuentes (por ejemplo, DRYGIN, SynlethDB) que contienen interacciones letales sintéticas, como se describe en la discusión.
2. Filtro de letalidad sintética e interacciones genéticas negativas (Sistema Experimental).
   1. Utilice la información de la columna "Sistema experimental" (columna número 12) que indica la naturaleza de la evidencia de apoyo para una interacción para identificar interacciones letales sintéticas.
   2. Restrinja el conjunto de datos a las entradas con un valor de Mortalidad genética o sintética negativa. En el mismo paso, filtre las columnas y conserve solo las columnas relevantes para los pasos de análisis posteriores, como se indica en la tabla 1 a continuación.
      
      ##restrict el archivo de interacción BioGRID a las columnas relevantes y solo conserva las interacciones clasificadas como letalidad genética y sintética negativa
      cut -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      imprimir $0
      }else if($4 == "Genética negativa" || $4 == "Letalidad sintética"){
      imprimir $0
      }
      }' > bg_synlet.txt
      
      Nota : en los fragmentos de código ^ I se utiliza para representar fichas horizontales. Se pueden incluir categorías adicionales de BioGRID, como el defecto de crecimiento sintético. Otras columnas relevantes para este flujo de trabajo se enumeran en la tabla 1. BioGRID también conserva las puntuaciones de las interacciones individuales. Los puntos de corte se pueden utilizar para identificar interacciones de confianza fuerte/alta.

Número de columna	Nombre de encabezado de columna
3	Nombre del gen
12	especie
13	Mos.000

Tabla 1: Columnas relevantes del archivo de datos BioGRID.

3. Identificar las especies para las que se informaron interacciones letales sintéticas.
   1. Determinar el número de identificadores de impuestos de socios de interacción letal sintética para obtener una estimación del número de interacciones letales sintéticas disponibles por organismo.
      
      ##count el número de apariciones de cada identificación fiscal en las interacciones letales sintéticas extraídas previamente
      cut -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | cola -n +2 | tr "\t" "\n" \
      | | de ordenación uniq -c | ordenar -r -g
      
      NOTA: Como resultado del paso 1, una lista de interacciones letales sintéticas con símbolos genéticos de organismos en los que se determinaron las interacciones. La mayoría de las interacciones letales sintéticas se han determinado en organismos modelo. Al cargar archivos en un programa de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel) evite arruinar Gene Symbols^19,20.

2. Traducción de pares de genes letales sintéticos a ortólogos humanos

1. Recuperar ortólogos humanos para los organismos modelo relevantes identificados en el paso 1.3.
   1. Recupere ortólogos humanos de Ensembl BioMart²¹ vinculando el conjunto de datos de genes del organismo modelo respectivo con el conjunto de datos de genes humanos. Utilice los símbolos del gen que denotan el gen en el organismo modelo y los genes humanos ortólogos para esta tarea. Utilice el servicio web Ensembl BioMart para automatizar el proceso de recuperación y enviar la consulta directamente a BioMart RESTful access para recuperar los pares de genes ortólogos (consulte el ejemplo a continuación y la Ayuda y documentación de Ensembl BioMart para obtener más detalles).
      
      ##retrieve ortólogo humano para Saccharomyces Cerevisiae de Ensembl BioMart utilizando curl para enviar la consulta de BioMart directamente al servicio de acceso BioMart RESTful
      curl -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=
      
      
      
      "default"
      
      
      
      "default"
      
      
      
      ' "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"
      
      Para recuperar los genes humanos ortólogos para otros organismos modelo, reemplace el valor del atributo name del primer elemento dataset por el nombre del conjunto de datos Ensembl respectivo y vuelva a ejecutar la consulta.
      
      NOTA: El proceso de mapeo de ortólogos está bien documentado en la Ayuda y documentación de Ensembl BioMart (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html).
   2. Acceda a un ejemplo de consulta de BioMart para ortólogos humanos para Saccharomyces cerevisiae, las principales especies identificadas en el paso 1.3, a través de la URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel.
      NOTA: Existen otras fuentes (por ejemplo, roundup, oma browser, HomoloGene, inparanoid) para el mapeo de homología, como se describe en la sección de discusión de este manuscrito.
2. Agregue ortólogos humanos a las interacciones letales sintéticas extraídas.
   1. Una las interacciones letales sintéticas basadas en la identificación fiscal del organismo y el símbolo de genes con los pares ortólogos recuperados en el paso 2.1. Para los pares de interacción letal sintética humana, cree pares ortólogos artificiales para cada gen humano presente en el conjunto de datos o asegúrese de que las interacciones letales sintéticas humanas no se descarten al unir y transferir los símbolos de genes humanos a las columnas recién agregadas.
      
      ##collect asignaciones de ortólogos en un solo archivo y se une con el archivo de interacción letal sintética
      #create un archivo de destino con encabezados para recopilar asignaciones de ortólogos
      echo "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol" > asignación.txt
      
      #repeat este paso para cada organismo modelo, tenga cuidado de adaptar el nombre del archivo de entrada y la identificación fiscal
      #adds para cada par de ortólogos en s_cerevisiae.txt una nueva entrada en el mapeo.txt: El símbolo del gen tiene el prefijo de la identificación fiscal para facilitar la posterior unión con el archivo de interacciones letales sintéticas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      if($1 != "" && $2 != ""){
      imprimir org_tax_id"/"$1, $2
      }
      }' asignación de s_cerevisiae.txt >>.txt
      
      #create entradas de mapeo artificial para genes humanos
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      if($5 == human_tax_id){
      imprimir $5"/"$2, $2
      }
      if($6 == human_tax_id){
      imprimir $6"/"$3, $3
      }
      }' bg_synlet.txt | asignación de >> sort -u.txt
      
      #add claves de unión necesarias (identificación fiscal/símbolo de gen) a interacciones letales sintéticas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      imprimir $0, "Interactor clave A", "Interactor clave B"
      }else{
      imprimir $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      }' bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt
      
      #join interacciones letales sintéticas con pares ortólogos
      combinar asignación de tmp_bg_synlet_w_keys.txt.txt 7 1 > tmp.txt
      Combinar asignación de TMP.txt.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt
      
      Nota : el comando merge utilizado en este ejemplo no es un comando estándar de Unix. Sin embargo, su implementación con la ayuda de gnu core utilities sort and join es sencilla. El comando se ha introducido para ocultar la complejidad de ordenar los archivos antes de que se puedan unir con el comando join. Puede encontrar una implementación de merge en https://github.com/aheinzel/merge-sh.
   2. Uso de cualquier identificador de gen que identifique de forma única el gen en un determinado espacio de nombres para obtener los mejores resultados posibles.
      NOTA: El paso 2 da como resultado una lista de interacciones letales sintéticas de múltiples organismos asignados a genes humanos.

3. Mapeo de socios de interacción letal sintética a las drogas

1. Recupere los pares droga-blanco de DrugBank.
   1. Descargue los datos de DrugBank de la sección de descargas de DrugBank y cree primero una cuenta si aún no se ha creado²². Use el archivo CSV con identificadores de destino de medicamentos (sección de identificadores de proteínas: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) y el vocabulario de DrugBank (sección de datos abiertos: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) con identificadores y nombres de DrugBank. Como alternativa, extraiga la información necesaria del volcado de base de datos XML.
      
      ##restrict el archivo objetivo de drogas de DrugBank a columnas relevantes y solo retiene las entradas para entidades moleculares humanas
      DB_TARGETS="todos.csv"
      DB_NAMES="vocabulario de drugbank.csv"
      
      #extract las columnas relevantes y volver a formatear para utilizar la ficha como separador de columnas
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt
      
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1 || $2 == "Humanos"){
      imprimir $1, $3
      }
      }' target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt
      
      NOTA: Los datos de DrugBank se proporcionan en dos formatos principales. La base de datos completa está disponible como archivo XML. Además, la mayoría de los datos están disponibles en una serie de archivos de valores separados por comas (CSV).
   2. Tenga en cuenta que DrugBank también registra objetivos de drogas no humanos. La columna de especies (columna número 12) se puede utilizar para extraer dianas farmacológicas humanas.
      Nota : para una mejor legibilidad, los nombres de las columnas extraídas se proporcionan en la tabla 2. Existen otras fuentes (por ejemplo, la Base de Datos de Dianas Terapéuticas o Chembl) que contienen enlaces fármaco-diana, como se describe en la sección de discusión.

Número de columna	Nombre de encabezado de columna
3	Nombre del gen
12	especie
13	Mos.000

2. Agregue nombres de medicamentos a los objetivos de los medicamentos.
   1. Dado que el nombre de la droga y la información de la droga-blanco se proporcionan en dos archivos CSV separados, combine la información de los dos archivos para agregar posteriormente los nombres de las drogas dirigidas a un socio de interacción letal sintética a las interacciones letales sintéticas. Combine los dos conjuntos de datos mediante la columna común DrugBank-drug-ID. Normalice primero el conjunto de datos de drug-target que solo contiene un solo DrugBank-drug-ID por fila, ya que el archivo inicial puede contener varios ID de fármacos de DrugBank en una fila si una proteína es el objetivo de varios fármacos.
      
      ##generate un solo archivo con el símbolo del gen objetivo de la droga, la identificación de la droga de DrugBank y el nombre de la droga
      #normalize conjunto de datos de dianas farmacológicas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      imprimir $0
      }else if($1 != "" && $2 != ""){
      split($2, drug_targets, ";")
      for(i en drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      imprimir $1, drug_target | "ordenar -u"
      }
      }
      }' human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt
      
      #extract las columnas relevantes y volver a formatear para utilizar la ficha como separador de columnas
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt
      
      combinar human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 2 1 > db_human_drug_targets.txt
      
      NOTA: Columna uno y tres en el vocabulario drugbank.csv archivo contienen la identificación de drogas DrugBank y el nombre respectivo.

3. Agregue medicamentos dirigidos a socios de interacción letal sintética al conjunto de datos de interacción letal sintética.
   1. Únase al conjunto de datos de interacción letal sintética con el archivo de nombre de fármaco objetivo generado en el paso anterior utilizando las columnas de símbolos de genes para agregar fármacos a las interacciones letales sintéticas. Tenga cuidado de agregar nombres de medicamentos para ambos socios de cada interacción letal sintética.
       
      ##enhance el archivo de interacción letal sintética mediante la adición de fármacos dirigidos a los socios de cada interacción letal sintética
      combinar bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      Combinar TMP.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt
      
      NOTA: El paso 3 da lugar a la interacción mortal sintética de organismo múltiple con sus genes humanos ortólogos y las drogas apuntando a estos genes.

4. Establecer el conjunto de combinaciones de fármacos actualmente probadas en ensayos clínicos

1. Obtenga acceso a los datos de ClinicalTrials.gov.
   1. Recupere información sobre ensayos clínicos en formato XML de ClinicalTrials.gov sobre (i) ensayos individuales, (ii) ensayos resultantes de una consulta de búsqueda o (iii) todos los ensayos de la base de datos. Alternativamente, utilice los recursos proporcionados por la iniciativa de transformación de ensayos clínicos que también aloja todos los datos de ClinicalTrials.gov en una base de datos relacional. Consulte el paso 4.4 para obtener más detalles.
      NOTA: Se requiere una cuenta gratuita para acceder a la instancia de base de datos hospedada en la nube hospedada por la iniciativa de transformación de ensayos clínicos. Además, se requiere un cliente plsql.
2. Concéntrese en los ensayos intervencionistas.
3. Filtrar por ensayos específicos para la indicación de interés.
   NOTA: ClinicalTrials.gov proporciona nombres de enfermedades del vocabulario controlado ncbi medical subject headings (MeSH). Contrariamente a los nombres de enfermedad proporcionados por el remitente, el vocabulario controlado permite identificar eficientemente los ensayos para la indicación de interés. Sin embargo, hay que tener en cuenta que el vocabulario controlado por NCBI MeSH es un tesauro. Por lo tanto, verifique el Navegador MeSH (https://meshb.nlm.nih.gov) si la indicación general de interés tiene términos secundarios / más estrechos e inclúyalos si corresponde.
4. Recupere los ensayos identificados junto con los fármacos probados en estos ensayos. A continuación se proporciona una consulta para los ensayos en la indicación general de cáncer de ovario.
   
   ##retrieve ensayos intervencionistas para la indicación general cáncer de ovario de la iniciativa de transformación de ensayos clínicos alojada en la base de datos relacional que contiene datos ClinicalTrials.gov
   <\pset pie de página desactivado
   SELECCIONAR s.nct_id, s.brief_title, i.intervention_type, i.name
   DE estudios s
   INNER JOIN browse_conditions c ON(s.nct_id = c.nct_id)
   Intervenciones INTERNAS JOIN i ON(s.nct_id = i.nct_id)
   WHERE s.study_type = 'Intervencionista'
   Y c.mesh_term IN (
   «Neoplasias ováricas»,
   'Carcinoma Epitelial Ovárico',
   «Tumor de células de granulosa»,
   «Síndrome hereditario de cáncer de mama y ovario»,
   «Luteoma»
   «Síndrome de Meigs»,
   «Tumor de células de Sertoli-Leydig»,
   'Thecoma'
   )
   ORDEN POR s.nct_id, i.intervention_type;
   Ef
   psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact

5. Extraiga los nombres de los medicamentos y asigne los nombres de DrugBank.
   NOTA: Si bien es tentador usar directamente los nombres de medicamentos recuperados de los ensayos clínicos de interés, uno debe tener en cuenta que los nombres de intervención en ClinicalTrials.gov son ingresados por el remitente como texto libre. Como consecuencia, los nombres no están estandarizados, los nombres de marca se pueden utilizar en lugar del nombre compuesto común y no hay garantía de normalización de datos adecuada (por ejemplo, múltiples nombres de medicamentos en una entrada). Además, es común que los fármacos se someten con un tipo de intervención diferente, diferenciándose del fármaco. Por lo tanto, el mapeo de los nombres de intervención recuperados a los nombres de medicamentos de DrugBank se lleva a cabo mejor manualmente.
   
     ##Obtain una lista de intervenciones utilizadas en el conjunto de ensayos clínicos previamente recuperados.
   cortar -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | cola -n +2 | ordenar -u
   
   Nota : columnas tres y cuatro contienen el tipo de intervención y el nombre de intervención, respectivamente.

6. Complemento con fármacos ya en uso clínico de guías
   NOTA: El paso 4 da como resultado una lista de medicamentos en evaluación/en uso para la indicación de interés.

5. Identificación de combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas

1. Búsqueda de interacciones letales sintéticas dirigidas por dos fármacos de interés. Restrinja el conjunto de datos del paso 3 a los medicamentos de interés filtrando las líneas del archivo que contiene tanto el medicamento A como el medicamento B.
   
   ##only retener entradas para interacciones letales sintéticas y drogas que las desencadenan donde ambos miembros de la pareja son el objetivo de los dos fármacos de interés (drug_a y drug_b)
   awk -F "\t" '{
   if( ($12 == drug_a && $14 == drug_b) || ($12 == drug_b &&&$14 == drug_a) ) {
   imprimir $0
   }
   }' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt

2. Asegúrese de que ninguno de los dos fármacos por sí solo se dirige a ambos socios de interacción letal sintética. Compruebe los objetivos de fármacos de cada fármaco identificado en el conjunto de datos del paso 3.2 y evalúe si ambos socios letales sintéticos identificados son objetivos del fármaco específico.
   
   ##find todas las entradas objetivo de medicamentos para un nombre de medicamento dado
   awk -F "\t" '{
   if($3 == droga){
   imprimir $0
   }
   }' droga="XXX" db_human_drug_targets.txt
   
   NOTA: Un fármaco que se dirigiría a ambas vías de interacción letal sintética sería tóxico para cualquier célula, por lo que teóricamente no es un valioso agente multi-objetivo. Esa es la razón por la que esta posibilidad se excluye en este paso del algoritmo.
    

6. Probar nuevas combinaciones de fármacos seleccionadas in vitro

1. Tratar las líneas celulares de cáncer de mama humano y las células epiteliales mamarias benignas humanas cultivadas en métodos de cultivo in vitro estándar en una atmósfera humidificada de 37 °C con 5% de CO₂ con varias combinaciones de fármacos.
2. Utilice medios complementados con suero fetal bovino y penicilina, así como sulfato de estreptomicina para dificultar la infección bacteriana.
3. Diluya los fármacos en disolventes como DMSO o solución salina tamponada con fosfato en al menos cuatro concentraciones diferentes en función de su IC50 previamente establecido (concentración inhibitoria) y utilícelos en combinación o solos para el tratamiento de las células.
4. Realizar ensayos de viabilidad celular y ensayos de apoptosis tales tinciones AnnexinV/7-AAD para determinar los efectos citotóxicos causados por los tratamientos.
5. Supervisar la inhibición farmacológica de las dianas moleculares sospechosas utilizando manchas o manchas occidente.
6. Distinguir la letalidad sintética de los efectos puramente aditivos calculando el índice combinatorio (IC) descrito por Chou y otros²³.

Resultados

Nuestro grupo ha publicado recientemente dos estudios que aplican el flujo de trabajo descrito en este manuscrito para identificar combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas en el contexto del cáncer de ovario y mama^24,25. En el primer estudio, se evaluaron las combinaciones de fármacos que actualmente se prueban en ensayos clínicos en etapa tardía (fase III y IV) o que ya se utilizan en la práctica clínica para tratar a pacien...

Discusión

Hemos esbozado un flujo de trabajo para identificar combinaciones de fármacos que afectan las interacciones letales sintéticas. Este flujo de trabajo hace uso de (i) datos sobre interacciones letales sintéticas de organismos modelo, (ii) información de ortólogos humanos, (iii) información sobre asociaciones fármaco-diana, (iv) información sobre fármacos sobre ensayos clínicos en el contexto del cáncer, así como (v) información sobre asociaciones fármaco-enfermedad y gen-enfermedad extraídas de la literatur...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioGRID	n/a	n/a	thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov	n/a	n/a	ClinicalTrials.gov
DrugBank	n/a	n/a	drugbank.ca
Ensembl BioMart	n/a	n/a	ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD	ebioscience	00-6993-50
AnnexinV-APC	BD Bioscience	550474
celecoxib	Sigma-Aldrich	PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay	Promega	G8080
FACS Canto II	BD Bioscience	n/a
fetal bovine serum	Fisher Scientific/Gibco	16000044
FloJo Software	FloJo LLC	V10
McCoy's 5a Medium Modified	Fisher Scientific/Gibco	16600082
penicillin G/streptomycin sulfate	Fisher Scientific/Gibco	15140122
SKBR-3 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC HTB-30
zoledronic acid	Sigma-Aldrich	SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request