Ein Datenintegrations-Workflow zur Identifizierung von Arzneimittelkombinationen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen

Zusammenfassung

Große genetische Screens in Modellorganismen haben zur Identifizierung negativer genetischer Interaktionen geführt. Hier beschreiben wir einen Datenintegrations-Workflow, der Daten aus genetischen Screens in Modellorganismen verwendet, um Arzneimittelkombinationen abzugrenzen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen bei Krebs abzielen.

Zusammenfassung

Eine synthetische letale Interaktion zwischen zwei Genen ist gegeben, wenn das Knock-out eines der beiden Gene die Zelllebensfähigkeit nicht beeinträchtigt, aber das Knock-out beider synthetischer letaler Interaktoren zum Verlust der Zelllebensfähigkeit oder zum Zelltod führt. Die am besten untersuchte synthetische letale Wechselwirkung ist zwischen BRCA1/2 und PARP1, wobei PARP1-Inhibitoren in der klinischen Praxis zur Behandlung von Patienten mit BRCA1/2-mutierten Tumoren eingesetzt werden. Große genetische Screens in Modellorganismen, aber auch in haploiden menschlichen Zelllinien haben zur Identifizierung zahlreicher zusätzlicher synthetischer letaler Interaktionspaare geführt, die alle potenzielle Ziele von Interesse bei der Entwicklung neuartiger Tumortherapien sind. Ein Ansatz besteht darin, Gene therapeutisch mit einem synthetischen letalen Interaktor anzusprechen, der im interessierenen Tumor mutiert oder signifikant herunterreguliert ist. Ein zweiter Ansatz besteht darin, Arzneimittelkombinationen zu formulieren, die synthetische tödliche Wechselwirkungen ansprechen. In diesem Artikel skizzieren wir einen Datenintegrationsworkflow zur Bewertung und Identifizierung von Arzneimittelkombinationen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen. Wir nutzen verfügbare Datensätze zu synthetischen letalen Interaktionspaaren, Homologie-Mapping-Ressourcen, Drug-Target-Links aus dedizierten Datenbanken sowie Informationen zu Medikamenten, die in klinischen Studien im Krankheitsbereich untersucht werden. Wir heben außerdem die wichtigsten Ergebnisse von zwei aktuellen Studien unserer Gruppe zur Beurteilung von Arzneimittelkombinationen im Zusammenhang mit Eierstock- und Brustkrebs hervor.

Einleitung

Synthetische Letalität definiert eine Assoziation von zwei Genen, wobei der Verlust eines Gens die Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt, aber der Verlust beider Gene zum Zelltod führt. Es wurde erstmals 1946 von Dobzhansky beschrieben, während verschiedene Phänotypen von Drosophila durch Züchtung homozygoter Mutanten¹analysiert wurden. Mutanten, die keine lebensfähigen Nachkommen produzierten, obwohl sie selbst lebensfähig waren, zeigten tödliche Phänotypen, wenn sie mit bestimmten anderen Mutanten gekreuzt wurden, was den Grundstein für die Etablierung der Theorie der synthetischen Letalität bereitete. Hartwell und Kollegen schlugen vor, dass dieses Konzept für die Krebstherapie beim Menschen anwendbar sein könnte². Pharmakologisch provozierte synthetische Letalität könnte sich auf nur eine Mutation stützen, da der synthetische tödliche Partner des mutierten Gens durch eine pharmakologische Verbindung anvisieren kann. Das erste Genpaar, das die pharmakologische Induktion synthetischer Letalität ermöglicht, war BRCA(1/2) und PARP1. PARP1 fungiert als Sensor für DNA-Schäden und ist an Stellen von Doppel- und Einzel-DNA-Strangbrüchen, Supercoils und Crossovers gebunden³. BRCA1 und 2 spielen eine wichtige Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch homologe Rekombination⁴. Farmer und Kollegen veröffentlichten Ergebnisse, dass Zellen, die einen Mangel an BRCA1/2 hatten, anfällig für PARP-Hemmung waren, während in BRCA-Wildtypzellen keine Zytotoxizität beobachtet wurde⁵. Letztendlich wurden PARP-Inhibitoren für die Behandlung von BRCA-defizientärem Brust- und Eierstockkrebs zugelassen^6,7. Darüber hinaus werden synthetische Letalitätsgenpaare, die zur klinischen Zulassung pharmakologischer Verbindungen führen, mit Spannung erwartet und sind ein wichtiger Bereich der jüngsten^{Krebsforschungsbemühungen 8}.

Synthetische letale Geninteraktionen wurden in mehreren Organismen modelliert, darunter Fruchtfliegen, C. elegans und Hefe². Mit verschiedenen Ansätzen, einschließlich RNA-Interferenz- und CRISPR/CAS-Bibliotheks-Knockouts, wurden in den letzten Jahren neuartige synthetische tödliche Genpaare entdeckt^9,10,11. Ein Protokoll über die experimentellen Verfahren von RNAi in Kombination mit CRISPR/CAS wurde kürzlich von Housden und Kollegen veröffentlicht¹². In der Zwischenzeit führten forscher auch große Bildschirme in haploiden menschlichen Zellen durch, um synthetische tödliche Wechselwirkungen zu identifizieren^13,14. In silico-Methoden wie biologische Netzwerkanalyse und maschinelles Lernen haben sich auch bei der Entdeckung synthetischer tödlicher Wechselwirkungen^{als vielversprechend erwiesen 15,16}.

Konzeptionell besteht ein Ansatz zur Nutzung synthetischer letaler Wechselwirkungen im Rahmen der Antitumortherapie darin, mutierte oder nicht-funktionelle Proteine in Tumorzellen zu identifizieren, wodurch ihre synthetischen letalen Interaktionspartner vielversprechende Wirkstoffziele für therapeutische Interventionen sind. Aufgrund der Heterogenität der meisten Tumorarten haben Forscher die Suche nach sogenannten synthetischen letalen Hub-Proteinen begonnen. Diese synthetischen letalen Naben haben eine Reihe von synthetischen letalen Interaktionspartnern, die entweder mutiert und daher nicht funktionsfähig oder in Tumorproben signifikant herunterreguliert sind. Die Behandlung solcher synthetischen tödlichen Naben ist vielversprechend für die Steigerung der Arzneimittelwirksamkeit oder die Überwindung von Arzneimittelresistenzen, wie beispielsweise im Zusammenhang mit dem Vincristin-resistenten Neuroblastom¹⁷gezeigt werden könnte. Ein zweiter Ansatz zur Verbesserung der medikamentösen Behandlung unter Verwendung des Konzepts synthetischer tödlicher Wechselwirkungen besteht darin, Arzneimittelkombinationen zu identifizieren, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen. Dies könnte zu neuen Kombinationen bereits zugelassener Einzel-Antitumortherapien und zur Neupositionierung von Medikamenten aus anderen Krankheitsbereichen in den Bereich der Onkologie führen.

In diesem Artikel stellen wir ein Schrittweises Verfahren vor, um eine Liste von Arzneimittelkombinationen zu erhalten, die auf synthetische tödliche Interaktionspaare abzielen. In diesem Workflow verwenden wir (i) Daten über synthetische letale Interaktionen von BioGRID und (ii) Informationen über homologe Gene von Ensembl, (iii) rufen Drug-Target-Paare aus DrugBank ab, (iv) bauen Krankheits-Wirkstoff-Assoziationen aus ClinicalTrials.gov auf und (v) generieren daher eine Reihe von Arzneimittelkombinationen, die synthetische tödliche Wechselwirkungen ansprechen. Schließlich bieten wir Arzneimittelkombinationen im Zusammenhang mit Eierstock- und Brustkrebs im Abschnitt repräsentative Ergebnisse an.

Protokoll

1. Synthetische letale Genpaare abrufen

1. Datenabruf aus BioGrid.
   1. Laden Sie die neueste BioGRID-Interaktionsdatei im tab2-Format von https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip entweder mit einem Webbrowser oder direkt über die Linux-Befehlszeile mit curl oder wget¹⁸herunter.
      
      ##download und entpacken Sie die neueste BioGRID-Interaktionsdatei
      #download neueste BioGRID-Interaktionsdatei mit curl
      curl -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack der heruntergeladenen Datendatei
      entpacken biogrid_latest.zip
      BG="BIOGRID-ALL-3.5.171.tab2.txt"
       
   2. Nachdem das Zip-Archiv heruntergeladen wurde, muss das Archiv entpackt und der Name der eigentlichen Datensatzdatei (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) für nachfolgende Schritte. Die BioGRID-Datendatei enthält Interaktionen verschiedener Typen, die im nächsten Schritt gefiltert werden.
      HINWEIS: Andere Quellen (z. B. DRYGIN, SynlethDB), die synthetische tödliche Wechselwirkungen enthalten, existieren, wie in der Diskussion beschrieben.
2. Filter für synthetische Letalität und negative genetische Interaktionen (Experimental System).
   1. Verwenden Sie Informationen in der Spalte "Experimentelles System" (Spalte Nummer 12), die die Art der unterstützenden Beweise für eine Interaktion angeben, um synthetische tödliche Wechselwirkungen zu identifizieren.
   2. Beschränken Sie den Datensatz auf Einträge mit dem Wert Negative Genetic oder Synthetic Lethality. Filtern Sie im selben Schritt Spalten und behalten Sie nur Spalten bei, die für nachfolgende Analyseschritte relevant sind, wie in Tabelle 1 unten aufgeführt.
      
      ##restrict die BioGRID-Interaktionsdatei in relevante Spalten und behalten nur Interaktionen bei, die als negative genetische und synthetische Letalität eingestuft sind
      cut -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      drucken $0
      }else if($4 == "Negative Genetic" || $4 == "Synthetic Lethality"){
      drucken $0
      }
      }' > bg_synlet.txt
      
      HINWEIS: In den Codeausschnitten ^I wird verwendet, um horizontale Registerkarten darzustellen. Zusätzliche BioGRID-Kategorien wie synthetischer Wachstumsdefekt können einbezogen werden. Weitere spalten, die für diesen Workflow relevant sind, sind in Tabelle 1aufgeführt. BioGRID behält auch die Scores für einzelne Interaktionen bei. Cutoffs können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit starker/hoher Zuverlässigkeit zu identifizieren.

Spaltennummer	Name der Spaltenüberschrift
3	Genname
12	Spezies
13	Drogen-IDs

Tabelle 1: Relevante Spalten der BioGRID-Datendatei.

3. Identifizieren Sie Arten, für die synthetische tödliche Interaktionen berichtet wurden.
   1. Bestimmen Sie die Anzahl der Steuer-IDs synthetischer letaler Interaktionspartner, um eine Schätzung der Anzahl der synthetischen tödlichen Interaktionen zu erhalten, die pro Organismus verfügbar sind.
      
      ##count die Anzahl der Auftritte jeder Steuer-ID in den zuvor extrahierten synthetischen tödlichen Interaktionen
      cut -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | Schwanz -n +2 | tr "\t" "\n" \
      | | sortieren uniq -c | sortieren -r -g
      
      HINWEIS: Als Ergebnis von Schritt 1 eine Liste synthetischer tödlicher Interaktionen mit Gensymbolen von Organismen, in denen die Interaktionen bestimmt wurden. Die Mehrzahl der synthetischen letalen Wechselwirkungen wurde in Modellorganismen bestimmt. Wenn Sie Dateien in ein Tabellenkalkulationsprogramm (z. B. Excel) laden, vermeiden Sie es, die Gensymbole¹⁹,^20zuruinieren.

2. Übersetzung synthetischer tödlicher Genpaare in menschliche Orthologe

1. Abrufen menschlicher Orthologe für relevante Modellorganismen, die in Schritt 1.3 identifiziert wurden.
   1. Rufen Sie menschliche Orthologe aus Ensembl BioMart^{21 ab,} indem Sie den jeweiligen Gendatensatz des Modellorganismus mit dem menschlichen Gendatensatz verknüpfen. Verwenden Sie für diese Aufgabe die Gensymbole, die das Gen im Modellorganismus bezeichnen, und orthologe menschliche Gene. Verwenden Sie den Ensembl BioMart Webservice, um den Abrufprozess zu automatisieren und senden Sie die Abfrage direkt an BioMart RESTful access, um die orthologen Genpaare abzurufen (siehe Beispiel unten und Ensembl BioMart Hilfe & Dokumentation für weitere Details).
      
      ##retrieve human ortholog für Saccharomyces Cerevisiae von Ensembl BioMart, indem sie curl verwenden, um die BioMart-Abfrage direkt an den BioMart RESTful-Zugangsdienst zu senden
      curl -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      
      ' "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"
      
      Um die orthologen menschlichen Gene für andere Modellorganismen abzurufen, ersetzen Sie den Wert des name-Attributs des ersten Dataset-Elements durch den Namen des jeweiligen Ensembl-Datensatzes und führen Sie die Abfrage erneut aus.
      
      HINWEIS: Der Prozess der Ortholog-Zuordnung ist in Ensembl BioMart Help & Documentation (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html) gut dokumentiert.
   2. Rufen Sie über die URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel auf eine BioMart-Beispielabfrage für menschliche Orthologe für Saccharomyces cerevisiae, die in Schritt 1.3 identifizierte Top-Spezies, zu.
      HINWEIS: Andere Quellen (z. B. Roundup, Oma-Browser, HomoloGene, Inparanoid) für die Homologie-Kartierung existieren, wie im Diskussionsabschnitt dieses Manuskripts beschrieben.
2. Fügen Sie menschliche Orthologe zu extrahierten synthetischen tödlichen Wechselwirkungen hinzu.
   1. Verbinden Sie synthetische letale Interaktionen basierend auf der Steuer-ID des Organismus und dem Gensymbol mit den in Schritt 2.1 abgerufenen orthologen Paaren. Für menschliche synthetische tödliche Interaktionspaare erstellen entweder künstliche orthologe Paare für jedes menschliche Gen, das im Datensatz vorhanden ist, oder stellen Sie sicher, dass menschliche synthetische tödliche Interaktionen beim Verbinden nicht verworfen werden und übertragen Sie die menschlichen Gensymbole in die neu hinzugefügten Spalten.
      
      ##collect Ortholog-Mappings in einer einzigen Datei und verbinden Sie sich mit einer synthetischen tödlichen Interaktionsdatei
      #create einer Zieldatei mit Headern zum Sammeln von Orthologzuordnungen
      Echo "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol"->-Mapping.txt
      
      #repeat diesem Schritt für jeden Modellorganismus achten Sie darauf, den Namen der Eingabedatei und die Steuer-ID anzupassen
      #adds für jedes Ortholog-Paar in s_cerevisiae.txt einen neuen Eintrag im Mapping.txt: Dem Gensymbol wird die Steuer-ID vorangestellt, um die nachfolgende Verbindung mit der Datei für synthetische tödliche Interaktionen zu erleichtern
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      if($1 != "" && $2 != ""){
      drucken org_tax_id"/"$1, $2
      }
      }' s_cerevisiae.txt >> Mapping.txt
      
      #create künstliche Mapping-Einträge für menschliche Gene
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      if($5 == human_tax_id){
      drucken $5"/"$2, $2
      }
      if($6 == human_tax_id){
      drucken $6"/"$3, $3
      }
      }' bg_synlet.txt | sortieren -u >> Mapping.txt
      
      #add erforderlichen Verknüpfungsschlüssel (Steuer-ID/Gensymbol) zu synthetischen tödlichen Interaktionen
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      drucken $0, "Key Interactor A", "Key Interactor B"
      }else{
      drucken $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      }' bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt
      
      #join synthetisch letale Wechselwirkungen mit orthologen Paaren
      merge tmp_bg_synlet_w_keys.txt mapping.txt 7 1 > tmp.txt
      tmp zusammenführen.txt mapping.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt
      
      HINWEIS: Der in diesem Beispiel verwendete Merge-Befehl ist kein Unix-Standardbefehl. Die Implementierung mit Hilfe der GNU Core Utilities sort and join ist jedoch unkompliziert. Der Befehl wurde eingeführt, um die Komplexität des Sortierens der Dateien zu verbergen, bevor sie mit dem Befehl join verbunden werden können. Eine Implementierung von merge finden Sie unter https://github.com/aheinzel/merge-sh.
   2. Verwendung eines beliebigen Genidentifikators, der das Gen in einem bestimmten Namensraum eindeutig identifiziert, um bestmögliche Ergebnisse zu erzielen.
      HINWEIS: Schritt 2 führt zu einer Liste synthetischer tödlicher Interaktionen von mehreren Organismen, die menschlichen Genen zugeordnet sind.

3. Kartierung synthetischer tödlicher Interaktionspartner mit Drogen

1. Rufen Sie Drug-Target-Paare von DrugBank ab.
   1. Laden Sie DrugBank-Daten aus dem Download-Bereich von DrugBank herunter und erstellen Sie zuerst ein Konto, wenn nicht bereits^{erstellt 22}. Verwenden Sie die CSV-Datei mit Arzneimittelzielidentifikatoren (Abschnitt Proteinidentifikatoren: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) und das DrugBank-Vokabular (Open Data-Abschnitt: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) mit DrugBank-Identifikatoren und -Namen. Alternativ können Sie die erforderlichen Informationen aus dem XML-Datenbankabbild extrahieren.
      
      ##restrict die DrugBank-Arzneimittelzieldatei in relevante Spalten und behält nur Einträge für menschliche molekulare Entitäten bei
      DB_TARGETS="alle.csv"
      DB_NAMES="Drugbank-Vokabular.csv"
      
      #extract relevanten Spalten und Neuformatieren, um die Registerkarte als Spaltentrener zu verwenden
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt
      
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1 || $2 == "Menschen"){
      Drucken $1, $3
      }
      }' target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt
      
      HINWEIS: DrugBank-Daten werden in zwei Hauptformaten bereitgestellt. Die komplette Datenbank steht als XML-Datei zur Verfügung. Darüber hinaus wird der Großteil der Daten in einer Reihe von CSV-Dateien (Comma-Separated Value) zur Verfügung gestellt.
   2. Beachten Sie, dass DrugBank auch nicht-menschliche Drogenziele aufzeichnet. Die Speziesspalte (Spalte Nummer 12) kann verwendet werden, um humane Drogenziele zu extrahieren.
      HINWEIS: Zur besseren Lesbarkeit sind die Namen der extrahierten Spalten in Tabelle 2angegeben. Andere Quellen (z. B. die Therapeutic Target Database oder Chembl), die Drug-Target-Links enthalten, existieren, wie im Diskussionsabschnitt beschrieben.

Spaltennummer	Name der Spaltenüberschrift
3	Genname
12	Spezies
13	Drogen-IDs

2. Fügen Sie Medikamentennamen zu Drogenzielen hinzu.
   1. Da Informationen zu Arzneimittelnamen und Arzneimittelzielen in zwei separaten CSV-Dateien bereitgestellt werden, führen Sie die Informationen aus den beiden Dateien zusammen, um anschließend Namen von Arzneimitteln hinzuzufügen, die auf einen synthetischen tödlichen Interaktionspartner zu synthetischen tödlichen Interaktionen abzielen. Verbinden Sie die beiden Datensätze mithilfe der gemeinsamen DrugBank-drug-ID-Spalte. Normalisieren Sie zuerst den Wirkstoffzieldatensatz, dass er nur eine einzige DrugBank-Drug-ID pro Zeile enthält, da die Ausgangsdatei mehrere DrugBank-Arzneimittel-IDs hintereinander enthalten kann, wenn ein Protein von mehreren Medikamenten angegriffen wird.
      
      ##generate eine einzige Datei mit dem Drogenziel-Gensymbol, der DrugBank-Drogen-ID und dem Arzneimittelnamen
      #normalize Drogenzieldatensatz
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      drucken $0
      }else if($1 != "" && $2 != ""){
      Split($2, drug_targets, ";")
      for(i in drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      Drucken $1, drug_target | "sort -u"
      }
      }
      }' human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt
      
      #extract relevanten Spalten und Neuformatieren, um tabulatorische Daten als Spaltentrennzeichen zu verwenden
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt
      
      human_target_to_drug.txt zusammenführen \
      drugbank_id_to_name.txt 2 1 > db_human_drug_targets.txt
      
      HINWEIS: Spalte eins und drei im Drugbank-Vokabular.csv Datei enthalten die DrugBank-Medikamenten-ID und den entsprechenden Namen.

3. Fügen Sie Medikamente, die auf synthetische letale Interaktionspartner abzielen, zum synthetischen tödlichen Interaktionsdatensatz hinzu.
   1. Verbinden Sie den Datensatz für synthetische tödliche Interaktionen mit der Im vorherigen Schritt generierten Datei mit dem Namen des Arzneimittelziels unter Verwendung der Gensymbolspalten, um Drogen zu synthetischen tödlichen Interaktionen hinzuzufügen. Achten Sie darauf, Arzneimittelnamen für beide Partner jeder synthetischen tödlichen Interaktion hinzuzufügen.
       
      ##enhance der Datei für synthetische tödliche Interaktion durch Hinzufügen von Medikamenten, die auf die Partner jeder synthetischen tödlichen Interaktion abzielen
      merge bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      merge tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt
      
      HINWEIS: Schritt 3 führt zu einer synthetischen tödlichen Interaktion mehrerer Organismen mit ihren orthologen menschlichen Genen und Medikamenten, die auf diese Gene abzielen.

4. Festlegung des Satzes der derzeit getesteten Arzneimittelkombinationen in klinischen Studien

1. Erhalten Sie Zugriff auf ClinicalTrials.gov Daten.
   1. Rufen Sie Informationen zu klinischen Studien im XML-Format von ClinicalTrials.gov entweder zu (i) einzelnen Studien, (ii) Studien, die sich aus einer Suchanfrage ergeben, oder (iii) allen Studien in der Datenbank ab. Alternativ können Sie die Ressourcen der Transformationsinitiative für klinische Studien nutzen, die auch alle Daten aus ClinicalTrials.gov in einer relationalen Datenbank hostet. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 4.4.
      HINWEIS: Für den Zugriff auf die in der Cloud gehostete Datenbankinstanz, die von der Transformationsinitiative für klinische Studien gehostet wird, ist ein kostenloses Konto erforderlich. Zusätzlich wird ein plsql-Client benötigt.
2. Konzentrieren Sie sich auf interventionelle Studien.
3. Filter für Studien, die für die Indikation von Interesse spezifisch sind.
   HINWEIS: ClinicalTrials.gov bietet Krankheitsnamen aus dem NCBI Medical Subject Headings (MeSH) kontrollierten Vokabular. Im Gegensatz zu den vom Einreicher angegebenen Krankheitsnamen ermöglicht das kontrollierte Vokabular die effiziente Identifizierung von Studien für die Indikation von Interesse. Dennoch muss man bedenken, dass das NCBI MeSH kontrollierte Vokabular ein Thesaurus ist. Überprüfen Sie daher den MeSH-Browser (https://meshb.nlm.nih.gov), ob die allgemeine Interessensbekundung kindliche/engere Begriffe enthält und fügen Sie diese gegebenenfalls hinzu.
4. Rufen Sie die identifizierten Studien zusammen mit den in diesen Studien getesteten Medikamenten ab. Eine Abfrage für Studien in der allgemeinen Indikation Eierstockkrebs finden Sie unten.
   
   ##retrieve interventionelle Studien für die allgemeine Indikation Eierstockkrebs aus der Transformationsinitiative für klinische Studien gehostete relationale Datenbank mit ClinicalTrials.gov Daten
   Cat <\pset Fußzeile aus
   WÄHLEN SIE VERSCHIEDENE s.nct_id, s.brief_title, i.intervention_type i.name
   AUS Studien s
   INNER JOIN browse_conditions c ON(s.nct_id = c.nct_id)
   INNER JOIN Interventionen i ON(s.nct_id = i.nct_id)
   WObei s.study_type = 'Interventional'
   UND c.mesh_term IN (
   "Ovarielle Neoplasmen",
   "Karzinom, Ovarialepithel",
   "Granulosa-Zelltumor",
   "Hereditäres Brust- und Eierstockkrebssyndrom",
   "Luteom",
   "Meigs-Syndrom",
   'Sertoli-Leydig-Zelltumor',
   'Das Koma'
   )
   BESTELLUNG NACH s.nct_id, i.intervention_type;
   Eof
   psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact

5. Extrahieren Sie Arzneimittelnamen und ordnen Sie DrugBank-Namen zu.
   HINWEIS: Während es verlockend ist, die Arzneimittelnamen aus klinischen Studien von Interesse direkt zu verwenden, muss man sich bewusst sein, dass Interventionsnamen in ClinicalTrials.gov vom Einreicher als Freitext eingegeben werden. Infolgedessen sind die Namen nicht standardisiert, Markennamen können anstelle des gebräuchlichen Verbindungsnamens verwendet werden und es gibt keine Garantie für eine ordnungsgemäße Datennormalisierung (z. B. mehrere Arzneimittelnamen in einem Eintrag). Darüber hinaus ist es üblich, dass Medikamente mit einem anderen Interventionstyp eingereicht werden, der sich vom Medikament unterscheidet. Daher wird die Zuordnung der abgerufenen Interventionsnamen zu DrugBank-Medikamentennamen am besten manuell durchgeführt.
   
     ##Obtain eine Liste von Interventionen, die in den zuvor abgerufenen klinischen Studien verwendet wurden.
   cut -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | Schwanz -n +2 | sortieren -u
   
   HINWEIS: Die Spalten drei und vier enthalten die Art der Intervention bzw. den Namen der Intervention.

6. Ergänzung mit Medikamenten, die bereits in der klinischen Anwendung aus Leitlinien verwendet werden
   HINWEIS: Schritt 4 führt zu einer Liste von Medikamenten, die für die Indikation von Interesse untersucht / verwendet werden.

5. Identifizierung von Wirkstoffkombinationen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen

1. Suche nach synthetischen tödlichen Wechselwirkungen, die von zwei interessanten Medikamenten angegriffen werden. Beschränken Sie den Datensatz von Schritt 3 auf interessante Medikamente, indem Sie Zeilen in der Datei herausfiltern, die sowohl Medikament A als auch Medikament B ent.
   
   ##only Einträge für synthetische tödliche Wechselwirkungen und Drogen, die sie auslösen, beibehalten, wenn beide Partner von den beiden interessierenden Medikamenten (drug_a und drug_b) betroffen sind.
   awk -F "\t" '{
   if( ($12 == drug_a && $14 == drug_b) || ($12 == drug_b && $14 == drug_a) ) {
   drucken $0
   }
   }' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt

2. Stellen Sie sicher, dass keines der beiden Medikamente allein auf beide synthetischen tödlichen Interaktionspartner abzielt. Überprüfen Sie die Wirkstoffziele jedes identifizierten Arzneimittels im Datensatz aus Schritt 3.2 und bewerten Sie, ob beide identifizierten synthetischen tödlichen Partner Ziele des spezifischen Arzneimittels sind.
   
   ##find alle Arzneimittelzieleinträge für einen bestimmten Arzneimittelnamen
   awk -F "\t" '{
   if($3 == Droge){
   drucken $0
   }
   }' drug="XXX" db_human_drug_targets.txt
   
   HINWEIS: Ein Medikament, das auf beide synthetischen tödlichen Interaktionswege abzielt, wäre für jede Zelle toxisch, daher ist es theoretisch kein wertvoller Multi-Target-Wirkstoff. Das ist der Grund, warum diese Möglichkeit in diesem Schritt des Algorithmus ausgeschlossen ist.
    

6. Ausgewählte neue Wirkstoffkombinationen in vitro testen

1. Behandlung von menschlichen Brustkrebszelllinien und menschlichen gutartigen Brustepithelzellen, die in Standard-In-vitro-Kultivierungsmethoden in einer befeuchteten 37 °C-Atmosphäre mit 5% CO₂ mit verschiedenen Arzneimittelkombinationen kultiviert wurden.
2. Verwenden Sie Medien, die mit fetalem Rinderserum und Penicillin sowie Streptomycinsulfat ergänzt sind, um bakterielle Infektionen zu verhindern.
3. Verdünnen Sie Arzneimittel in Lösungsmitteln wie DMSO oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung in mindestens vier verschiedenen Konzentrationen basierend auf ihrer zuvor festgelegten IC50 (inhibitorische Konzentration) und verwenden Sie sie in Kombination oder allein zur Behandlung von Zellen.
4. Durchführung von Zelllebensfähigkeitstests und Apoptose-Assays wie AnnexinV/7-AAD-Färbungen, um zytotoxische Wirkungen zu bestimmen, die durch Behandlungen verursacht werden.
5. Überwachen Sie die pharmakologische Hemmung vermuteter molekularer Ziele mit Western Blots.
6. Unterscheiden Sie synthetische Letalität von rein additiven Effekten, die den kombinatorischen Index (CI) berechnen, wie von Chou und anderen beschrieben²³.

Ergebnisse

Unsere Gruppe hat kürzlich zwei Studien veröffentlicht, die den in diesem Manuskript dargestellten Workflow anwenden, um Arzneimittelkombinationen zu identifizieren, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen im Zusammenhang mit Eierstock- und Brustkrebs abzielen^24,25. In der ersten Studie haben wir Wirkstoffkombinationen, die derzeit in späten klinischen Studien (Phase III und IV) getestet werden oder bereits in der klinischen Praxis zur Behandlung von E...

Diskussion

Wir haben einen Workflow zur Identifizierung von Arzneimittelkombinationen skizziert, die sich auf synthetische tödliche Wechselwirkungen auswirken. Dieser Workflow nutzt (i) Daten über synthetische letale Interaktionen von Modellorganismen, (ii) Informationen über menschliche Orthologe, (iii) Informationen über Arzneimittel-Ziel-Assoziationen, (iv) Arzneimittelinformationen über klinische Studien im Zusammenhang mit Krebs sowie (v) Informationen über Arzneimittel-Krankheits- und Gen-Krankheits-Assoziationen, die a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioGRID	n/a	n/a	thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov	n/a	n/a	ClinicalTrials.gov
DrugBank	n/a	n/a	drugbank.ca
Ensembl BioMart	n/a	n/a	ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD	ebioscience	00-6993-50
AnnexinV-APC	BD Bioscience	550474
celecoxib	Sigma-Aldrich	PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay	Promega	G8080
FACS Canto II	BD Bioscience	n/a
fetal bovine serum	Fisher Scientific/Gibco	16000044
FloJo Software	FloJo LLC	V10
McCoy's 5a Medium Modified	Fisher Scientific/Gibco	16600082
penicillin G/streptomycin sulfate	Fisher Scientific/Gibco	15140122
SKBR-3 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC HTB-30
zoledronic acid	Sigma-Aldrich	SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request