Um fluxo de trabalho de integração de dados para identificar combinações de drogas visando interações letais sintéticas

Resumo

Grandes telas genéticas em organismos modelo levaram à identificação de interações genéticas negativas. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho de integração de dados usando dados de telas genéticas em organismos modelo para delinear combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas no câncer.

Resumo

Uma interação letal sintética entre dois genes é dada quando o knock-out de qualquer um dos dois genes não afeta a viabilidade celular, mas o nocaute de ambos os interagedores letais sintéticos leva à perda de viabilidade celular ou morte celular. A interação letal sintética mais bem estudada é entre BRCA1/2 e PARP1, com inibidores PARP1 sendo utilizados na prática clínica para tratar pacientes com tumores mutados BRCA1/2. Grandes telas genéticas em organismos modelo, mas também em linhas de células humanas haploides levaram à identificação de numerosos pares adicionais de interação letal sintética, todos sendo potenciais alvos de interesse no desenvolvimento de novas terapias tumorais. Uma abordagem é atingir os genes terapeuticamente com um interagente letal sintético que seja mutado ou significativamente downregulado no tumor de interesse. Uma segunda abordagem é formular combinações de drogas abordando interações letais sintéticas. Neste artigo, delineamos um fluxo de trabalho de integração de dados para avaliar e identificar combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas. Fazemos uso de conjuntos de dados disponíveis em pares de interação letal sintética, recursos de mapeamento de eremologia, links de alvos de drogas de bancos de dados dedicados, bem como informações sobre medicamentos que estão sendo investigados em ensaios clínicos na área de interesse da doença. Destacamos ainda os principais achados de dois estudos recentes do nosso grupo sobre avaliação da combinação de medicamentos no contexto do câncer de ovário e de mama.

Introdução

A letalidade sintética define uma associação de dois genes, onde a perda de um gene não afeta a viabilidade, mas a perda de ambos os genes leva à morte celular. Foi descrito pela primeira vez em 1946 por Dobzhansky enquanto analisava vários fenótipos de drosophila, criando mutantes homozigos¹. Mutantes que não produziam descendentes viáveis, embora viáveis, exibiam fenótipos letais quando cruzados com certos outros mutantes, estabelecendo terreno para o estabelecimento da teoria da letalidade sintética. Hartwell e colegas sugeriram que esse conceito poderia ser aplicável para a terapia do câncer em humanos². A letalidade sintética provocada farmacologicamente poderia contar com apenas uma mutação, dado que o parceiro letal sintético do gene mutante é alvo de um composto farmacológico. O primeiro par genético a permitir a indução farmacológica da letalidade sintética foi o BRCA(1/2) e PARP1. PARP1 funciona como um sensor para danos de DNA, e está ligado a locais de quebras de fios de DNA duplo e único, superligas e crossovers³. BRCA1 e 2 desempenham papéis importantes na reparação de quebras de duplo fio de DNA através da recombinação homólogo⁴. Agricultor e colegas publicaram achados de que as células deficientes para BRCA1/2 eram suscetíveis à inibição de PARP, enquanto nenhuma citotoxicidade foi observada nas células do tipo selvagem BRCA⁵. Em última análise, foram aprovados os inibidores parp para o tratamento de câncer de mama e ovário deficiente brca^6,7. Além disso, os pares de genes de letalidade sintética que levam à aprovação clínica de compostos farmacológicos são muito esperados e uma área importante dos recentes esforços de pesquisa sobre câncer⁸.

Interações genéticas letais sintéticas foram modeladas em múltiplos organismos, incluindo moscas frutíferas, C. elegans e^{leveduras 2}. Usando várias abordagens, incluindo a interferência de RNA e os nocautes na biblioteca CRISPR/CAS, novos pares de genes letais sintéticos foram descobertos nos últimos anos^9,10,11. Um protocolo sobre os procedimentos experimentais da RNAi em combinação com o CRISPR/CAS foi publicado recentemente por Housden e colegas¹². Enquanto isso, os pesquisadores também realizaram grandes telas em células humanas haploides para identificar interações letais sintéticas^13,14. Em métodos silico, como análise de rede biológica e machine learning também mostraram-se promissores na descoberta de interações letais sintéticas^15,16.

Concepção, uma abordagem para fazer uso de interações letais sintéticas no contexto da terapia anti-tumor é identificar proteínas mutantes ou não funcionais em células tumorais, fazendo com que seus parceiros de interação letal sintéticas prolvam de alvos medicamentosos para intervenção terapêutica. Devido à heterogeneidade da maioria dos tipos de tumores, pesquisadores iniciaram a busca pelas chamadas proteínas do hub letal sintético. Esses hubs letais sintéticos têm uma série de parceiros de interação letal sintética que são mutados e, portanto, não funcionais ou significativamente baixos em amostras de tumores. Abordar tais polos letais sintéticos é promissor no aumento da eficácia medicamentosa ou na superação da resistência a medicamentos, como poderia ser mostrado, por exemplo, no contexto do neuroblastoma resistente à vincristina¹⁷. Uma segunda abordagem para melhorar o tratamento medicamentoso fazendo uso do conceito de interações letais sintéticas é identificar combinações de drogas visando interações letais sintéticas. Isso poderia levar a novas combinações de terapias anti-tumores individuais já aprovadas e ao reposicionamento de medicamentos de outras áreas da doença para o campo da oncologia.

Neste artigo, apresentamos um procedimento passo a passo para produzir uma lista de combinações de drogas que visam pares de interação letal sintética. Neste fluxo de trabalho, nós (i) usamos dados sobre interações letais sintéticas do BioGRID e (ii) informações sobre genes homólogos da Ensembl, (iii) recuperar pares de alvos de drogas do DrugBank, (iv) construir associações de drogas contra doenças a partir de ClinicalTrials.gov, e (v) assim gerar um conjunto de combinações de drogas que abordam interações letais sintéticas. Por fim, fornecemos combinações de medicamentos no contexto do câncer de ovário e de mama na seção de resultados representativos.

Protocolo

1. Recuperando pares de genes letais sintéticos

1. Recuperação de dados da BioGrid.
   1. Baixe o arquivo de interação BioGRID mais recente no formato tab2 de https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip usando um navegador da Web ou diretamente da linha de comando Linux usando curl ou wget¹⁸.
      
      ##download e desempacota o mais recente arquivo de interação BioGRID
      #download mais recente arquivo de interação BioGRID usando curl
      enrolar -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack o arquivo de dados baixado
      biogrid_latest.zip de abrir zíper
      BG="BIOGRID-ALL-3.5.171.tab2.txt"
       
   2. Depois que o arquivo zip tiver sido baixado, o arquivo desempacotar deve e observar o nome do arquivo de conjunto de dados real (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) para etapas subsequentes. O arquivo de dados BioGRID contém interações de diferentes tipos que serão filtradas na próxima etapa.
      NOTA: Existem outras fontes (por exemplo, DRYGIN, SynlethDB) que detêm interações letais sintéticas, conforme descrito na discussão.
2. Filtro para letalidade sintética e interações genéticas negativas (Sistema Experimental).
   1. Use informações na coluna "Sistema Experimental" (coluna número 12) que indique a natureza de evidências de apoio para uma interação para identificar interações letais sintéticas.
   2. Restringir o conjunto de dados a entradas com um valor de Letalidade Genética Negativa ou Sintética. Na mesma etapa, filtrar colunas e somente reter colunas relevantes para etapas de análise subsequentes, conforme listado na tabela 1 abaixo.
      
      ##restrict o arquivo de interação BioGRID para colunas relevantes e apenas retêm interações classificadas como letalidade genética e sintética negativa
      corte -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1){
      imprimir $0
      }mais se ($4 == "Genética Negativa" || $4 == "Letalidade Sintética"){
      imprimir $0
      }
      > bg_synlet.txt
      
      NOTA: Nos trechos de código ^Sou usado para representar guias horizontais. Podem ser incluídas categorias adicionais de BioGRID, como defeito de crescimento sintético. Outras colunas de relevância para este fluxo de trabalho estão listadas na Tabela 1. BioGRID também mantém os escores para interações individuais. Os cortes podem ser usados para identificar interações fortes/de alta confiança.

Número da coluna	Nome do cabeçalho da coluna
3	Nome de Gene
12	espécie
13	IDs de drogas

Tabela 1: Colunas relevantes do arquivo de dados BioGRID.

3. Identificar espécies para as quais foram relatadas interações letais sintéticas.
   1. Determine o número de idas fiscais de parceiros de interação letal sintética para obter uma estimativa sobre o número de interações letais sintéticas disponíveis por organismo.
      
      ##count o número de aparições de cada identificação fiscal nas interações letais sintéticas anteriormente extraídas
      corte -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | cauda -n +2 | tr "\t" "\n" \
      | classificar | uniq -c | classificar -r -g
      
      NOTA: Como resultado da etapa 1, uma lista de interações letais sintéticas com símbolos genéticos de organismos nos quais as interações foram determinadas. A maioria das interações letais sintéticas foram determinadas em organismos modelo. Ao carregar arquivos em um programa de planilha (por exemplo, Excel) evite arruinar gene symbols^19,20.

2. Traduzir pares de genes letais sintéticos para ortologs humanos

1. Recuperar ortopos humanos para organismos modelos relevantes identificados na etapa 1.3.
   1. Recuperar ortopologs humanos do Ensembl BioMart²¹ ligando o respectivo conjunto de dados genéticos do organismo modelo com o conjunto de dados genéticos humanos. Use os símbolos genéticos denotando o gene no organismo modelo e genes humanos ortologos para esta tarefa. Use o webservice Ensembl BioMart para automatizar o processo de recuperação e enviar a consulta diretamente ao acesso BioMart RESTful para recuperar os pares genéticos ortologos (veja o exemplo abaixo e Ensembl BioMart Help & Documentation para obter mais detalhes).
      
      ##retrieve ortologos humanos para Saccharomyces Cerevisiae da Ensembl BioMart usando curl para enviar a consulta BioMart diretamente para o serviço de acesso BioMart RESTful
      curl -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=
      
      
      
      
      
      
      
      "padrão"
      
      
      
      " http://www.ensembl.org/biomart/martservice"
      
      A fim de recuperar os genes humanos ortomanos para outros organismos modelo, substitua o valor do atributo de nome do primeiro elemento Dataset com o nome do respectivo conjunto de dados Ensembl e re-execute a consulta.
      
      NOTA: O processo de mapeamento de ortolog está bem documentado no Ensembl BioMart Help & Documentation (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html).
   2. Acesse uma consulta biomart de exemplo para ortologs humanos para Saccharomyces cerevisiae, as principais espécies identificadas na etapa 1.3, através do URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel.
      NOTA: Existem outras fontes (por exemplo, roundup, navegador oma, HomoloGene, inparanoide) para mapeamento de homologia, conforme descrito na seção de discussão deste manuscrito.
2. Adicione ortopedias humanas às interações letais sintéticas extraídas.
   1. Junte-se a interações letais sintéticas baseadas no id fiscal do organismo e no símbolo genético com os pares ortologos recuperados na etapa 2.1. Para os pares de interação letal sintética humana, ou criam pares ortologos artificiais para cada gene humano presente no conjunto de dados ou garantem que as interações letais sintéticas humanas não sejam descartadas durante a junção e transferência dos símbolos genéticos humanos para as colunas recém-adicionadas.
      
      ##collect mapeamentos de ortolog em um único arquivo e junte-se ao arquivo de interação letal sintética
      #create um arquivo de destino com cabeçalhos para coletar mapeamentos de ortolog
      echo "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol" mapeamento >.txt
      
      #repeat este passo para cada organismo modelo, tome cuidado para adaptar o nome do arquivo de entrada e o ID fiscal
      #adds para cada par de ortolog em s_cerevisiae.txt uma nova entrada no mapeamento.txt: O símbolo genético é prefixado com o id fiscal para facilitar a adesão subsequente com o arquivo de interações letais sintéticas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      se ($1 != "" && $2 != "){
      imprimir org_tax_id"/"$1, $2
      }
      }' mapeamento s_cerevisiae.txt >>.txt
      
      #create entradas de mapeamento artificial para genes humanos
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      se ($5 == human_tax_id){
      imprimir $5"/"$2, $2
      }
      se ($6 == human_tax_id){
      imprimir $6"/"$3, $3
      }
      bg_synlet.txt | classificar -u mapeamento >>.txt
      
      #add chaves de adesão necessárias (tax id/Gene Symbol) para interações letais sintéticas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1){
      imprimir $0, "Key Interactor A", "Key Interactor B"
      }else{
      imprimir $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt
      
      #join interações letais sintéticas com pares ortologos
      mesclar tmp_bg_synlet_w_keys.txt mapeamento.txt 7 1 > tmp.txt
      fusão tmp.txt mapeamento.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt
      
      NOTA: O comando de mesclagem usado neste exemplo não é um comando Unix padrão. No entanto, sua implementação com a ajuda do tipo GNU Core Utilities e junte-se é simples. O comando foi introduzido para esconder a complexidade de classificar os arquivos antes que eles possam ser unidos com a junta de comando. Uma implementação de mesclagem pode ser encontrada em https://github.com/aheinzel/merge-sh.
   2. Uso de qualquer identificador genético identificando exclusivamente o gene em um determinado namespace para obter os melhores resultados possíveis.
      NOTA: O passo 2 resulta em uma lista de interações letais sintéticas de múltiplos organismos mapeados para genes humanos.

3. Mapeando parceiros de interação letal sintética para drogas

1. Recuperar pares de alvos de drogas do DrugBank.
   1. Baixe dados do DrugBank da seção de downloads do DrugBank e crie uma conta primeiro se ainda não tiver criado²². Use o arquivo CSV com identificadores de alvo de drogas (seção de identificadores de proteínas: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) e o vocabulário do DrugBank (seção de dados abertos: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) com identificadores e nomes do DrugBank. Alternativamente, extrair as informações necessárias do despejo do banco de dados XML.
      
      ##restrict o arquivo de alvo de drogas do DrugBank para colunas relevantes e só reter entradas para entidades moleculares humanas
      DB_TARGETS="tudo.csv"
      DB_NAMES="vocabulário do banco de medicamentos.csv"
      
      #extract colunas e reformat relevantes para usar a guia como seperador de colunas
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt
      
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1 || $2 == "Humanos"){
      imprimir $1, $3
      }
      target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt
      
      NOTA: Os dados do DrugBank são fornecidos em dois formatos principais. O banco de dados completo está disponível como arquivo XML. Além disso, a maioria dos dados é disponibilizada em uma série de arquivos de valor separados por círio (CSV).
   2. Esteja ciente de que o DrugBank também registra alvos de drogas não humanos. A coluna de espécies (coluna número 12) pode ser usada para extrair alvos de drogas humanas.
      NOTA: Para melhor legibilidade, os nomes das colunas extraídas são fornecidos na Tabela 2. Existem outras fontes (por exemplo, o Banco de Dados de Alvos Terapêuticos ou Chembl) que detêm links de alvo de drogas, conforme descrito na seção de discussão.

Número da coluna	Nome do cabeçalho da coluna
3	Nome de Gene
12	espécie
13	IDs de drogas

2. Adicione nomes de drogas a alvos de drogas.
   1. Uma vez que o nome da droga e as informações de alvo de drogas são fornecidas em dois arquivos CSV separados, mescla as informações dos dois arquivos para posteriormente adicionar nomes de drogas direcionadas a um parceiro de interação letal sintética para interações letais sintéticas. Junte-se aos dois conjuntos de dados usando a coluna comum DrugBank-drug-ID. Normalize o conjunto de dados de alvo de drogas primeiro que ele contém apenas um único DrugBank-drug-iD por linha, como o arquivo inicial pode conter várias IDs de drogas DrugBank em uma fileira se uma proteína é alvo de múltiplas drogas.
      
      ##generate um único arquivo que mantém símbolo genético alvo de drogas, ID de drogas do DrugBank e nome de droga
      #normalize conjunto de dados de alvo de drogas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1){
      imprimir $0
      }else se ($1 != "" && $2 != "){
      split ($2, drug_targets, ";")
      para(i em drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      imprimir $1, drug_target | "sort -u"
      }
      }
      human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt
      
      #extract colunas e reformat relevantes para usar a guia como separador de colunas
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt
      
      mesclar human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 21 > db_human_drug_targets.txt
      
      NOTA: Coluna um e três no vocabulário do banco de medicamentos.csv arquivo detém a ID de drogas do DrugBank e o respectivo nome.

3. Adicione drogas direcionadas a parceiros de interação letal sintética ao conjunto de dados de interação letal sintética.
   1. Junte-se ao conjunto de dados de interação letal sintética com o arquivo de nome de droga-alvo gerado na etapa anterior usando as colunas de símbolos genéticos para adicionar drogas às interações letais sintéticas. Tome cuidado para adicionar nomes de drogas para ambos os parceiros de cada interação letal sintética.
       
      ##enhance o arquivo de interação letal sintética adicionando drogas direcionadas aos parceiros de cada interação letal sintética
      mesclar bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      mesclar tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt
      
      NOTA: O passo 3 resulta em interação letal sintética de múltiplos organismos com seus genes e drogas humanas ortologos visando esses genes.

4. Estabelecendo o conjunto de combinações de medicamentos atualmente testados em ensaios clínicos

1. Tenha acesso aos dados ClinicalTrials.gov.
   1. Recuperar informações sobre ensaios clínicos em formato XML a partir de ClinicalTrials.gov em (i) ensaios individuais, (ii) ensaios resultantes de uma consulta de pesquisa ou (iii) todos os ensaios no banco de dados. Alternativamente, utilizar os recursos fornecidos pela iniciativa de transformação de ensaios clínicos, que também hospeda todos os dados de ClinicalTrials.gov em uma base de dados relacional. Consulte o passo 4.4 para mais detalhes.
      NOTA: Uma conta gratuita é necessária para acessar a instância de banco de dados hospedada na nuvem hospedada pela iniciativa de transformação de ensaios clínicos. Além disso, é necessário um cliente plsql.
2. Concentre-se em ensaios intervencionais.
3. Filtro para ensaios específicos para a indicação de interesse.
   NOTA: ClinicalTrials.gov fornece nomes de doenças do vocabulário controlado por Títulos de Sujeitos Médicos do NCBI (MeSH). Ao contrário do que o submetida forneceu nomes de doenças, o vocabulário controlado permite identificar eficientemente ensaios para a indicação de interesse. No entanto, é preciso ter em mente que o vocabulário controlado pelo NCBI MeSH é um dicionário. Portanto, verifique o Navegador MeSH (https://meshb.nlm.nih.gov) se a indicação geral de interesse tem algum termo filho/mais estreito e inclua-os se for o caso.
4. Recuperar os ensaios identificados junto com as drogas testadas nestes ensaios. Uma consulta para ensaios na indicação geral de câncer de ovário é fornecida abaixo.
   
   ##retrieve ensaios intervencionais para a indicação geral do câncer de ovário a partir da iniciativa de transformação de ensaios clínicos hospedado banco de dados relacionais contendo dados ClinicalTrials.gov
   | gato <\pset footer off
   SELECIONE S.NCT_ID DISTINTAS, s.brief_title, i.intervention_type i.name
   DOS estudos s
   INSIENTOU BROWSE_CONDITIONS c ON (s.nct_id = c.nct_id)
   Intervenções internas da JOIN i ON (s.nct_id = i.nct_id)
   ONDE s.study_type = 'Intervencionista'
   E c.mesh_term IN (
   'Neoplasias ovarianas',
   'Carcinoma, Epitelial Ovariana',
   'Tumor de células de Granulosa',
   'Síndrome do Câncer de Mama e Ovário Hereditário',
   'Luteoma',
   'Síndrome de Meigs',
   'Tumor celular sertoli-leydig',
   'Thecoma'
   )
   ORDEM POR s.nct_id, i.intervention_type;
   Eof
   psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact

5. Extrair nomes de drogas e mapear os nomes do DrugBank.
   NOTA: Embora seja tentador usar diretamente os nomes dos medicamentos recuperados de ensaios clínicos de interesse, deve-se estar ciente de que os nomes de intervenção em ClinicalTrials.gov são inseridos pelo apresentador como texto gratuito. Como consequência, os nomes não são padronizados, as marcas podem ser usadas em vez do nome do composto comum e não há garantia para a normalização adequada dos dados (por exemplo, vários nomes de medicamentos em uma entrada). Além disso, é comum que os medicamentos sejam submetidos com um tipo de intervenção diferente, diferente da droga. Portanto, o mapeamento dos nomes de intervenção recuperados para nomes de medicamentos do DrugBank é melhor realizado manualmente.
   
     ##Obtain uma lista de intervenções utilizadas no conjunto de ensaios clínicos previamente recuperados.
   corte -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | cauda -n +2 | classificar -u
   
   NOTA: As colunas três e quatro possuem tipo de nome de intervenção e intervenção, respectivamente.

6. Complemente com medicamentos já em uso clínico a partir de diretrizes
   NOTA: O passo 4 resulta em uma lista de medicamentos sob avaliação/uso para a indicação de interesse.

5. Identificação de combinações de drogas visando interações letais sintéticas

1. Busca por interações letais sintéticas sendo alvo de duas drogas de interesse. Restringir o conjunto de dados da etapa 3 para drogas de interesse filtrando linhas no arquivo que seguram tanto a droga A quanto a droga B.
   
   ##only reter entradas para interações letais sintéticas e drogas desencadeando-as onde ambos os parceiros são alvo das duas drogas de interesse (drug_a e drug_b)
   awk -F "\t" '{
   se ($12 == drug_a && $14 == drug_b) || ($12 == drug_b && $14 == drug_a) ) {
   imprimir $0
   }
   }' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt

2. Certifique-se de que nenhuma das duas drogas sozinhas está mirando ambos os parceiros de interação letal sintética. Verifique os alvos de drogas de cada droga identificada no conjunto de dados a partir da etapa 3.2 e avalie se ambos os parceiros letais sintéticos identificados são alvos da droga específica.
   
   ##find todas as entradas de alvo de drogas para um determinado nome de droga
   awk -F "\t" '{
   se ($3 == droga){
   imprimir $0
   }
   }' droga="XXX" db_human_drug_targets.txt
   
   NOTA: Uma droga que atingiria ambas as vias de interação letal sintética seria tóxica para qualquer célula, então teoricamente não é um agente multi-alvo valioso. Essa é a razão pela qual essa possibilidade é excluída nesta etapa do algoritmo.
    

6. Testando novas combinações de drogas selecionadas in vitro

1. Tratar linhas de células cancerígenas de mama humanas e células epiteliais benignas humanas cultivadas em métodos padrão de cultivo in vitro em uma atmosfera umidificada de 37 °C com 5% de CO₂ com várias combinações de drogas.
2. Use mídia suplementada com soro bovino fetal e penicilina, bem como sulfato de estreptomicina para dificultar a infecção bacteriana.
3. Diluir drogas em solventes como DMSO ou soro fisiológico tamponado com fosfato em pelo menos quatro concentrações diferentes com base em seu IC50 previamente estabelecido (concentração inibitória) e usá-los em combinação ou sozinho para o tratamento de células.
4. Realizar ensaios de viabilidade celular e ensaios de apoptose tais manchas anexadas/7-AAD para determinar efeitos citotóxicos causados por tratamentos.
5. Monitore a inibição farmacológica de alvos moleculares suspeitos usando manchas ocidentais.
6. Distinguir a letalidade sintética dos efeitos puramente aditivos que calculam o índice combinatório (IC) como descrito por Chou e outros²³.

Resultados

Nosso grupo publicou recentemente dois estudos aplicando o fluxo de trabalho retratado neste manuscrito para identificar combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas no contexto do câncer de ovário e de mama^24,25. No primeiro estudo, avaliamos combinações de medicamentos que atualmente são testados em ensaios clínicos em estágio final (fase III e IV) ou já sendo utilizados na prática clínica para tratar pacientes com câncer de ...

Discussão

Delineamos um fluxo de trabalho para identificar combinações de drogas que impactam as interações letais sintéticas. Este fluxo de trabalho faz uso de (i) dados sobre interações letais sintéticas de organismos modelo, (ii) informações de ortologs humanos, (iii) informações sobre associações de alvos de drogas, (iv) informações sobre medicamentos sobre ensaios clínicos no contexto do câncer, bem como (v) sobre informações de associações de doenças-drogas e doenças genéticas extraídas da literatur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioGRID	n/a	n/a	thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov	n/a	n/a	ClinicalTrials.gov
DrugBank	n/a	n/a	drugbank.ca
Ensembl BioMart	n/a	n/a	ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD	ebioscience	00-6993-50
AnnexinV-APC	BD Bioscience	550474
celecoxib	Sigma-Aldrich	PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay	Promega	G8080
FACS Canto II	BD Bioscience	n/a
fetal bovine serum	Fisher Scientific/Gibco	16000044
FloJo Software	FloJo LLC	V10
McCoy's 5a Medium Modified	Fisher Scientific/Gibco	16600082
penicillin G/streptomycin sulfate	Fisher Scientific/Gibco	15140122
SKBR-3 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC HTB-30
zoledronic acid	Sigma-Aldrich	SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request