Establecimiento y Análisis de Organoides Tridimensionales (3D) Derivados de los Especímenes de Metastasis ósea del Cáncer de Próstata del Paciente y sus Xenoinjertos

Resumen

Los cultivos tridimensionales de muestras BMPC pacientes y xenoinjertos de cáncer de próstata metastásico óseo mantienen la heterogeneidad funcional de sus tumores originales, lo que resulta en quistes, esferoides y organoides complejos similares a tumores. Este manuscrito proporciona una estrategia de optimización y protocolo para el cultivo 3D de muestras derivadas de pacientes heterogéneos y su análisis utilizando IFC.

Resumen

El cultivo tridimensional (3D) de organoides a partir de muestras tumorales de pacientes humanos y modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de cáncer de próstata, conocidos como organoides derivados del paciente (DOP), son un recurso invaluable para estudiar el mecanismo de tumorigenesis y metástasis del cáncer de próstata. Su principal ventaja es que mantienen la heterogeneidad genómica y funcional distintiva del tejido original en comparación con las líneas celulares convencionales que no lo hacen. Además, los cultivos 3D de DOP se pueden utilizar para predecir los efectos del tratamiento farmacológico en pacientes individuales y son un paso hacia la medicina personalizada. A pesar de estas ventajas, pocos grupos utilizan rutinariamente este método en parte debido a la amplia optimización de las condiciones de cultivo de DOP que pueden ser necesarias para diferentes muestras de pacientes. Anteriormente demostramos que nuestro modelo PDX de metástasis ósea de cáncer de próstata, PCSD1, recapitulaba la resistencia de la metástasis ósea del paciente donante a la terapia antiandrógeno. Utilizamos organoides PCSD1 3D para caracterizar aún más los mecanismos de resistencia a los antiandrógenos. Siguiendo una visión general de los estudios publicados actualmente de los modelos PDX y PDO, describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando esferas de membrana de sótano abovedada o flotante (por ejemplo, Matrigel) en condiciones de cultivo optimizadas. También se describen las imágenes de puntadas in vivo y el procesamiento celular para histología. Este protocolo se puede optimizar aún más para otras aplicaciones, incluyendo la mancha occidental, la cocultura, etc. y se puede utilizar para explorar las características de la DOP cultivada en 3D relacionadas con la resistencia a los medicamentos, la tumorigenesis, la metástasis y las terapias.

Introducción

Los organoides cultivados tridimensionales han llamado la atención por su potencial para recapitular la arquitectura in vivo, la funcionalidad celular y la firma genética de sus tejidos originales^1,2,3,4,5. Lo más importante es que los organoides 3D establecidos a partir de tejidos tumorales de pacientes o modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) proporcionan oportunidades inestimables para comprender los mecanismos de señalización celular sobre la tumorigenesis y determinar los efectos del tratamiento farmacológico en cada población celular^{6,7,8,9,10,11,12,13}. ⁵ desarrolló un protocolo estándar para el establecimiento de organoides de próstata humanos y de ratón, que ha sido ampliamente adoptado en el campo de la urología. Además, se ha dedicado un esfuerzo significativo para una mayor caracterización de los organoides 3D y para comprender los mecanismos detallados de la tumorigenesis y la metástasis^4,12,14,15. Además del protocolo previamente establecido y ampliamente aceptado para las culturas de organoides 3D, aquí describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando tres métodos de doming diferentes en condiciones de cultivo optimizadas.

En este manuscrito, los organoides 3D se establecieron como un modelo ex vivo de cáncer de próstata metastásico óseo (BMPC). Las células utilizadas para estos cultivos provenían de la serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) y se derivaron directamente de los tejidos tumorales metastásicos del cáncer de próstata del paciente (PCSD18 y PCSD22) o de los modelos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) (muestras denominadas PCSD1, PCSD13 y PCSD17). Debido a que la metástasis ósea espontánea de las células cancerosas de próstata es poco frecuente en los modelos de ratón genéticamente modificados¹⁶, utilizamos la inyección directa intrafemoral (IF) de células tumorales humanas en machos Rag2^-/-c^-/- ratones para establecer los modelos PDX del cáncer de próstata metastásico óseo¹⁷.

Una vez que los organoides 3D se establecen a partir de células tumorales de pacientes heterogéneos o xenoinjertos derivados del paciente, es esencial confirmar su identidad como células tumorales de próstata y determinar sus fenotipos en los cultivos organoides 3D. La química de la inmunofluorescencia (IFC) permite la visualización de la expresión proteica in situ en cada célula, a menudo indicando las funciones potenciales para poblaciones celulares específicas^2,4. En general, los protocolos IFC para una gran mayoría de muestras, incluidos los tejidos y las células, son sencillos y están totalmente optimizados. Sin embargo, la densidad celular y el número de organoides pueden ser significativamente menores que la del cultivo convencional. Por lo tanto, el protocolo IFC para organoides requiere pasos adicionales para asegurar el procesamiento adecuado y la inserción en parafina para todos los organoides en las muestras. Describimos pasos adicionales para un proceso de preincrustación de agarosa y consejos para etiquetar la ubicación de organoides seccionados en la diapositiva que aumenta la tasa de éxito de IFC en organoides, especialmente cuando las muestras de organoides tienen menor densidad celular de la deseada.

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Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de California en San Diego (UCSD). IRB #090401 La aprobación fue recibida de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UCSD para recolectar muestras quirúrgicas de pacientes con fines de investigación. Se obtuvo un consentimiento informado de cada paciente y se obtuvo una muestra de metástasis quirúrgica de cáncer de próstata ósea a partir de la reparación ortopédica de una fractura patológica en el fémur. Los protocolos de los animales se realizaron bajo el protocolo aprobado por la Universidad de California en San Diego (UCSD) y el Protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) #S10298. Las células del tejido tumoral del paciente disociado mecánica y enzimáticamente se inyectaron intrafemoralmente en^ratones macho sin o 8 semanas de edad,como se describió anteriormente¹⁷. El volumen tumoral de xenoinjerto se determinó utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo y mediciones de pinza. Tras el crecimiento tumoral de hasta 2,0 cm (el tamaño máximo permitido aprobado por IACUC), el tumor fue cosechado para el establecimiento de organoides 3D.

NOTA: La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para establecer organoides 3D y un número de protocolo para cada paso de los procedimientos experimentales.

1. Procesamiento de tejidos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX)

NOTA: Este es un paso inicial para el establecimiento organoide de un tumor derivado de un modelo de ratón xenoinjerto. Este protocolo está adaptado de una publicación anterior de Drost et al.⁵ y hemos modificado las condiciones de los medios de comunicación para incluir la suplementación con suero a medios organoides.

1. Procesar la muestra tumoral como se describe a continuación.
   1. Muestras de tumor de picado a piezas de 1-3 mm³ de tamaño y digerir las muestras con 10 ml de solución de disociación celular durante 45 min a temperatura ambiente.
   2. Para terminar la digestión, agregue 20 ml de medios completos DMEM a las muestras.
   3. Filtrar la suspensión a través de un colador de células de 70 m. Utilice una brida de émbolo estéril para empujar cualquier tejido sobrante en la parte superior del colador de células de 70 m.
   4. Centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4oC.
   5. Lave el pellet celular tres veces con un medio completo adDMEM fresco. Haga coincidir el volumen de medios para el lavado y la resuspensión con el volumen de medios sugerido en la Tabla 3. Por ejemplo, para una condición de cultivo de placa de 24 pocillos, el volumen para el lavado debe ser de 500 l.
      NOTA: Como se muestra en la Tabla 3, el protocolo es aplicable a diferentes condiciones de cultivo.
   6. Determine el recuento final de células con el tinte azul Trypan y un hemocitómetro.
   7. Después de obtener el recuento celular, vuelva a suspender el gránulo celular en 80 ml de 2% de FBS en PBS por 2 x 10⁶ células tumorales.
   8. Añadir 20 l de cóctel de agotamiento de células de ratón por 2 x 10⁶ células tumorales. Mezclar bien e incubar durante 15 min a 2-8 oC.
   9. Ajuste el volumen a 500 l con un 2% de FBS en tampón de PBS por 2 x 10⁶ células tumorales.
      NOTA: Se pueden procesar hasta 1 x 10⁷ células tumorales en 2,5 ml de suspensión celular en una columna LS.
   10. Cargue las columnas LS en el separador de columna magnética y coloque un tubo cónico de 15 ml en un bastidor debajo para recoger el flujo.
   11. Enjuague cada columna con 3 ml de 2% de FBS en el búfer PBS. Deseche el tubo cónico con el lavado que fluye y sustitúyalo por un nuevo tubo cónico estéril de 15 ml.
   12. Agregue la suspensión celular (hasta 2,5 ml de 1 x 10⁷ células tumorales) a la columna. Recoger el flujo a través de que será el enriquecido con las células tumorales humanas.
   13. Lave la columna dos veces con 1 ml de 2% de FBS en el búfer PBS.
       NOTA: Es importante realizar pasos de lavado tan pronto como la columna esté vacía. Además, trate de evitar la formación de burbujas de aire.
2. Alícuota el volumen adecuado de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml para el cultivo deseado configurado (Tabla 3).
3. Centrifugar el tubo de 1,5 ml a 300 x g y 4 oC durante 5 min.
4. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante.

2. Procesamiento de los tejidos tumorales primarios del paciente

NOTA: Este es un paso inicial para el establecimiento de organoides.

1. Siga todos los pasos 1 excepto el proceso de agotamiento de la célula del ratón, que no es necesario para el procesamiento de los tejidos tumorales primarios del paciente.

3. Formar una cúpula redonda en la placa

NOTA: Este manuscrito describe tres formas de hacer una cúpula a partir de una mezcla del pellet celular y la membrana del sótano (por ejemplo, Matrigel) como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. En los pasos 2-4, las células y la membrana del sótano deben mantenerse en hielo para evitar la solidificación de la membrana del sótano.

1. Resuspenda el gránulo celular en el volumen adecuado de membrana del sótano (p. ej., 40 l) para una placa de 24 pocillos configurada(Tabla 3).
2. Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para asegurarse de que las células se vuelvan a suspender bien en la membrana del sótano.
3. Pipetear el volumen apropiado(Tabla 3) de la mezcla de membrana cell-basement (y opcional 10 l de adDMEM de medios completos) en el centro de la placa de cultivo de tejido precalentado.
4. Invierta la placa y coloque inmediatamente la placa boca abajo en la incubadora de cultivo celular CO₂ a 5% co_2,37 oC durante 15 min. Esto evita que las células se asienten y se adhieran al fondo de la placa mientras permite que la membrana del sótano se solidifique.
5. Pipetear el volumen apropiado(Tabla 3) de medio precalentado que contiene 10 M y-27632 dihidrocloruro en cada pocil.
6. Coloque la placa del lado derecho dentro de la incubadora de cultivo celular CO₂ (5% CO₂, 37 oC).
7. Cambie el medio cada 3-4 días. Después de 5-7 días, utilice el medio de cultivo sin 10 M Y-27632 dihidrocloruro para mantener los cultivos.

4. Formando una cúpula flotante a partir de una cúpula redonda unida en la placa

1. Después del paso 3.7, separe la cúpula usando un rascador de celda.

5. Formación de perlas flotantes

NOTA: Este protocolo se denomina perlas flotantes, ya que la mezcla de membrana de sótano, medios y organoides se ven como cuentas.

1. Corte una película de 2 pulgadas x 4 pulgadas de parafina.
2. Coloque la película de parafina en la parte superior de los divots de un estante vacío de sujeción de puntas de una caja de punta de pipeta de plástico de 1000 ml.
3. Presione suavemente hacia abajo sobre la película de parafina para rastrear los divots usando un dedo índice enguantado, pero sin romper a través de la película de parafina.
4. Rocíe la película de parafina con 70% de etanol y encienda la lámpara UV en la campana de cultivo celular para esterilizar la película de parafina preparada durante al menos 30 minutos.
5. Preparar una mezcla de células y 20 ml de membrana del sótano. La densidad de sembrado puede ser de 50.000 a 250.000 células por cúpula.
6. Pipetear la mezcla de células procesadas a partir del paso 1 o 2, y 20 l de membrana de sótano en el molde de la divot formada en la película de parafina preparada.
7. Resuspenda el pellet celular en la membrana del sótano y pipetee la suspensión celular en los divots filmados con parafina preparado.
8. Coloque las cuentas solidificadas y la película de parafina en una placa de 6 pocillos. Un pozo en un plato de 6 pocillos puede caber hasta 5 perlas.
9. Pipetear 3-5 ml de medio precalentado que contiene 10 M Y-27632 dihidrocloruro en cada pocil mientras se cepillan suavemente las perlas de la película de parafina.
   NOTA: Como volumen mínimo, se recomiendan 3 ml. Para un número máximo de perlas (N-5) por pozo, se recomiendan 5 ml de medio.
10. Colocar la placa dentro de una incubadora de CO₂ (5% CO₂, 37oC).
11. Cambie el medio organoide cada 3-4 días. Después de 5-7 días, utilice el medio de cultivo sin 10 M Y-27632 dihidrocloruro para mantener los cultivos.

6. Costura de imagen de organoides in vivo con microscopio⁸

NOTA: Ciertos microscopios no pueden alcanzar el perímetro exterior de la placa celular (pared del borde); por lo tanto, sugerimos utilizar los pozos cerca del perímetro de la placa de la celda cuando la costura de la imagen.

1. Coloque la placa de cultivo celular en posición ascendente en el soporte de la placa en el microscopio keyence.
2. Coloque la lente en el centro de la cúpula objetivo.
3. Configure el proceso de costura automática seleccionando el número de fotogramas. Por ejemplo, se pueden elegir 3 x 3 o 5 x 5 para generar 9 imágenes o 25 imágenes en total.
4. Pulse el botón de captura para iniciar el proceso de creación de imágenes.
5. Abra el software del visor de imágenes y cargue un grupo de imágenes tomadas en el paso 4.
6. Haga clic en Punto de imagen para crear una imagen cosida de alta resolución.
   NOTA: La captura de imágenes serie 9 o 25 se puede realizar mediante configuración manual o automática para enfocar las celdas.

7. Procesamiento organoide para histología: el método de agarosa spin down

NOTA: Este protocolo está adaptado de una publicación anterior de Vlachogiannis et al.⁷. Hemos añadido un paso que implica la incrustación de agarosa para incrustar con éxito todas las poblaciones de organoides.

1. Elimine los medios existentes del pozo. Tenga cuidado de no aspirar las cúpulas de membrana del sótano.
2. Agregue un volumen igual (igual al volumen de medios eliminado del paso 1) volumen de la solución de recuperación de células e incubar durante 60 min a 4 oC.
3. Desaloje la cúpula de membrana del sótano usando una pipeta y aplasta la cúpula de la membrana del sótano usando una punta de pipeta. Recoja la cúpula disociada y la solución de recuperación celular en un tubo de 1,5 ml.
4. Centrífuga a 300 x g y 4oC durante 5 min.
5. Retire el sobrenadante (solución de recuperación celular). Guarde todos los sobrenadores en tubos separados hasta el final cuando se confirme la presencia de organoides en el paso final de peletización.
6. Añadir el volumen deseado(Tabla 3) de PBS frío y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para perturbar mecánicamente el pellet.
7. Centrífuga a 300 x g y 4oC durante 5 min.
8. Retire el sobrenadante (PBS).
9. Fijar el pellet en un volumen igualado (por ejemplo, 500 l para un pellet de la condición de cultivo de placa de 24 pozos, Tabla 3) de 4% PFA durante 60 min a temperatura ambiente.
10. Después de la fijación, centrífuga a 300 x g y 4 oC durante 5 min.
11. Retire el sobrenadante (PFA).
12. Lavar con volumen igualado (p. ej., 500 l para un pellet de la condición de cultivo de placa de 24 pozos, Tabla 3) de PBS y centrífuga a 300 x g y 4 oC durante 5 min.
13. Preparar agarosa caliente (2% agarosa en PBS).
    NOTA: Aquí, los gránulos celulares para secciones congeladas se pueden volver a suspender directamente en 200 l de compuesto OCT sin más pasos en el Protocolo 7.
14. Vuelva a suspender el gránulos celulares en 200 ml de agarosa (2% en PBS).
    1. Inmediatamente después de añadir agarosa, separa suavemente el pellet celular de la pared del tubo de 1,5 ml con la aguja de 25 G unida a la jeringa de 1 ml. Como se muestra en la Figura 3, si el pellet celular no está separado físicamente de la pared del tubo de 1,5 ml, entonces existe el riesgo de perder todo o parte del pellet celular durante el proceso de incrustación de agarosa.
15. Espere hasta que la agarosa del 2% en PBS esté completamente solidificada.
16. Separe el bloque de agarosa solidificado del tubo de 1,5 ml utilizando una aguja de 25 G unida a la jeringa de 1 ml.
17. Transfiera el bloque de agarosa separado que contiene el pellet celular a un nuevo tubo de 1,5 ml.
18. Llene el tubo con 70% EtOH y continúe utilizando el protocolo convencional para la deshidratación de tejidos y la incrustación de parafina.

8. Histología y citoquímica inmunofluorescente (IFC) de organoides

1. Seleccione la(s) diapositiva(s) para histología o IFC.
2. Antes de iniciar el proceso de tinción, descubra dónde se encuentran las celdas en la diapositiva y dibuje un círculo alrededor de las celdas de la diapositiva utilizando un marcador.
3. Dibuje el perímetro alrededor del borde o el borde de la diapositiva y donde se encuentran los círculos en la diapositiva de un cuaderno de laboratorio para registrar sus ubicaciones.
4. Realice la tinción deseada.
   NOTA: Durante este proceso, los círculos marcados desaparecen ya que el fabricante regular no es resistente a los productos químicos. Incluso algunos marcadores permanentes de histología pueden ser borrados durante el proceso de tinción.
5. Después del proceso de tinción, coloque la diapositiva sobre el dibujo en el cuaderno de laboratorio para encontrar las ubicaciones de las celdas en la diapositiva.

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Resultados

Los organoides 3D se establecieron con éxito a partir de un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de cáncer de próstata metastásico óseo (BMPC), así como directamente del tejido de cáncer de próstata metastásico del paciente(Figura 4). Brevemente, nuestros modelos PDX de BMPC fueron establecidos por inyección intra-femoral (IF) de células tumorales en machos Rag2^-/- c^-/- ratones y luego los tumores PDX fueron cosechados y procesados como se descri...

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Discusión

Los organoides 3D derivados de las células de cáncer de próstata de metástasis ósea del paciente son todavía relativamente raros. Aquí, describimos estrategias y protocolo optimizado para establecer con éxito organoides derivados de pacientes 3D en serie (DOP) de BMPC. Además, los protocolos se describen para asegurar los organoides en muestras con menor densidad celular para el análisis ifC e IHC. Los fenotipos diferenciales en forma de quiste, esferoides y organoides más complejos indican que este protocolo ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipettman	Gilson	F123602
1 mL Syringe	BD Syringe	329654
1.5 mL tube	Spectrum Lab Products	941-11326-ATP083
25G Needle	BD PrecisionGlide Needle	305122
4% Paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	J61899
70% Ethanol (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
adDMEM	Life Technologies	12634010
Agarose	Lonza	50000
Antibody -for Cytokeratin 5	Biolegend	905901
Antibody for Cytokeratin 8	Biolegend	904801
B27	Life Technologies	17504044
Bioluminescence imaging system, IVIS 200	Perkin Elmer Inc	IVIS 200
Cell Culture Plate - 24 well	Costar	3524
Cell Culture Plate - 48 well	Costar	3548
Cell Culture Plate - 6 well	Costar	3516
Cell Dissociation Solution, Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cell Scraper	Sarstedt	83.180
Cell Strainer	Falcon (Corning)	352350
CO2 incubator	Fisher Scientific	3546
DAPI	Vector Vectashield	H-1200
DHT	Sigma-Aldrich	D-073-1ML
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Gemini Bio-Products	100-106
FGF10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
Forceps	Denville Scientific	S728696
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
LS Columns	Miltenyi	130-0420401
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator	Miltenyi	130-090-976
Marker	VWR	52877-355
Matrigel (Growth Factor Reduced)	Mediatech Inc. (Corning)	356231
Matrigel (High Concentration)	BD (Fisher Scientific)	CB354248
Microscope Imaging Software, Keyence	BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)
Microscope, Keyence	BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Mouse Cell Depletion Kit	Miltenyi	130-104-694
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Noggin	PeproTech	120-10C
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Parafilm	American National Can	N/A
Pen-Strep	Mediatech Inc. (Corning)	30-002-CI-1
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Plunger (from 3 mL syringe)	BD Syringe	309657
Prostaglandin E2	Tocris Bioscience	2296
R-Spondin 1	Trevigen	3710-001-01
SB2021190	Sigma-Aldrich	S7076-25MG
Small Table Top Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75002426
Water Bath	Fisher Sci	2320
Y-27632 Dihydrochloride	Abmole Bioscience	M1817